¶ TIGR、CASY、CERO提升3D细胞培养效率
提高产量、减少人工操作——改进实验结果
¶ 1.TIGR – Tissue Grinder & Dissociator 组织研磨与分散器
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¶ 2.CASY – Cell counter & Analyzer 细胞计数分析仪
CASY 的主要原理 – 计数 & 体积
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CASY的最重要特点：聚集物校正
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细胞聚团会导致细胞计数不准确，因为大脉冲通常会被误解为单个细胞的信号，而实际上是多个细胞的聚集。为了校正这种影响，CASY系统提供了聚集物校正功能，通过分析脉冲的大小来区分聚集物和单个细胞。 | Volume / Aggregates = number of individual cells：该公式表明，通过计算细胞或聚集物的体积并与聚集物的数量进行比较，可以推算出单个细胞的数量。CASY系统通过此公式来校正聚集物的影响，从而提供更精确的细胞计数。 |
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体积检测与精度：
聚集体校正：
死细胞的影响：
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¶ 3.CERO 3D Incubator & Bioreactor 全自动3D细胞培养仪
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4个独立控制的管道（4 individually controlled tubes）：
小型台式设计（Small footprint benchtop Incubator）：
最低剪切力的均质化翅片（Homogenization fins for lowest shear forces in bi-directional rotation）：
温度和二氧化碳控制（Controlled CO2 & temperature）：
在线pH监测（Online pH monitoring）：
通气帽（Vented cap）：
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简易操作与标准化（Easy handling & Standardization）：
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典型的类器官样本，来自NSCLC肺癌（H1299细胞），这表明该方法适用于复杂的肿瘤类器官培养，尤其在癌症研究中有广泛的应用。 |
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每3到7天操作一次，操作时间约为4分钟（Hands on as limited as ~4 min every 3 to 7 days）：这种标准化操作方法极大地减少了人工操作时间，3D类器官培养可在较长的时间内减少人工干预，仅需每3到7天进行简单操作，节省了大量时间。 每管可培养超过80,000个类器官（> 80.000 organoids (~500μm) per tube）：这种操作可以在每个培养管中培养超过80,000个直径约为500微米的类器官，表明该方法具有很高的细胞培养效率。 |
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干细胞扩增（Expansion of Stem Cells）：
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类器官培养（Organoids from Domes or Tissue）：
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干细胞分化（Differentiation of Stem Cells）：
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共培养实验（Perform Co-Cultures）：
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长期培养（Long term cultivation）：
无凋亡（No apoptosis over much extended periods）：
几个月或更长时间（Several months or more）：
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CAR巨噬细胞的生产（Production CAR Macrophages）：
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维持组织片段（Maintaining Tissue pieces）：
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¶ 1. 多能干细胞（Pluripotent stem cells）
¶ 2. 分化路径图中将多能干细胞的分化路径分为两个主要的胚层：内胚层和外胚层/神经外胚层。每个胚层的分化过程由特定的因子控制。 ¶ 内胚层（Endoderm）
¶ 外胚层/神经外胚层（Ectoderm/Neuroectoderm）
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多能干细胞（Pluripotent Stem Cells, PSC）的扩增与分化过程  |
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¶ Day 1-5: 扩增多能干细胞（Expansion of PSC）
¶ Day 6-22: 分化阶段（Differentiation），肾脏类器官的形成
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¶ 类器官分化（Organoids Differentiation）
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| 准备分化的类胚状体 | |
 ¶ Pluripotent / Not Differentiated (多能性/未分化)
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 ¶ Ready to differentiate in all 3 germ layers (准备向所有三个胚层分化)
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| 文章：Elanzew, et. al.; A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension; Biotechnol. J. 2015, 10, 1589–1599 | |
| 提高了心肌细胞的纯度和质量 | |
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¶ 1. 从小鼠ESC分化为心肌细胞（From Mouse ESC (J1)）
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¶ 2. 从人类iPSC分化为心肌细胞（From Human iPSC vs HD）
MHY7与TNNT2的表达：图右侧展示了MHY7和TNNT2两个心肌细胞标记物在不同培养方法下的表达量对比。使用CERO 3D系统（红色曲线）与传统的悬滴法（灰色曲线）相比，CERO 3D系统在心肌细胞分化过程中表现出更高的标记物表达量。
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¶ 3. 心肌细胞的纯度和质量（Improved Purity & Quality of Cardiomyocytes）
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| 从人类诱导多能干细胞（iPSC）分化得到的视网膜类器官（Retina Organoid） | |
 ¶ 细胞层次与定位
¶ 应用与意义视网膜类器官的应用：通过这种方式获得的视网膜类器官能够用于研究视网膜的发育、疾病模型（如视网膜退行性疾病）、药物筛选和再生医学。研究人员可以通过在体外模拟视网膜的发育过程，深入研究各种眼科疾病的机制，并寻找潜在的治疗方法。 从iPSC分化到视网膜类器官：这表明，iPSC具有巨大的潜力，通过合适的培养条件和分化因子，可以生成复杂的三维视网膜类器官。这一过程的成功应用为眼科相关的研究和治疗提供了新的方向。 |
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DAPI：是一种常用于染色细胞核的染料，标记细胞核为蓝色。图中显示了类器官的细胞核分布。 HuCD：是一种神经系统细胞的标志物，通常标记神经元。绿色荧光显示HuCD标记的神经元。图中可以看到HuCD标记的细胞在视网膜类器官中均匀分布。 SOX2：SOX2是视网膜胶质细胞的标志物，它在视网膜的星形胶质细胞中表达。在图中，SOX2被标记为绿色，并与HuCD共同显示，以帮助区分神经元和胶质细胞。 OTX2：OTX2是视网膜光感受器细胞和双极细胞的标志物。它是一个关键的转录因子，有助于视网膜发育。在图中，OTX2用红色荧光标记，显示在视网膜的内外层区域，标志着这些细胞的存在。 Isl1：Isl1是多种神经元亚型的标志物，在图中的绿色标记中显示。它在视网膜中标记不同类型的神经元，尤其是在视网膜的某些区域，涉及到不同亚型的神经元（如视网膜神经节细胞等）。 |
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视网膜类器官（Retina Organoid）：这是通过iPSC分化得到的三维视网膜类器官，模拟了视网膜的结构。图中展示了在不同时间点的类器官结构，包含了多层的神经细胞，具有典型的视网膜层状结构。 标记的细胞类型：
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| 从不同组织类型的成人干细胞分化为各种器官模型 |
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¶ 1. 成人干细胞（aSC）来源的器官
这些器官模型（类器官）代表了从成人组织来源的干细胞生成的多种不同器官类型。 ¶ 2. 生成过程
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| 从组织或类器官培养中提取并进一步分化的过程 | |
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¶ 转移至CERO系统培养
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¶ 使用TIGR进行酶无分解处理
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¶ 接种和培养
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| 扩大人类结肠癌类器官的生产规模 |
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通过不同细胞接种浓度（4% Matrigel）进行规模化生产  可扩展的培养（Scalable cultivation） 高产量（High Yields） 质量不妥协（No compromise in quality） |
¶ 1. 细胞接种浓度对类器官形态的影响
¶ 2. 标准培养与CERO 3D培养的比较
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| 人类乳腺癌类器官的形态 | |
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在不同Matrigel浓度和细胞接种量条件下培养的乳腺癌类器官的形态  |
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这张图展示了在不同Matrigel浓度和细胞接种量条件下培养的乳腺癌类器官的形态。 ¶ 图左侧：
¶ 图中间：
¶ 图右侧：
¶ 对比：
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¶ CERO 3D与传统Dome方法的比较这张图比较了CERO 3D系统与传统的Dome培养方法下乳腺癌类器官的组织学结构。 ¶ 左侧：CERO 3D
¶ 右侧：Dome
¶ 组织学对比：
¶ 总结：这张图突出了CERO 3D系统相较于传统Dome方法的优势，表现为更高的类器官生长密度和更好的结构化，显示出CERO 3D在类器官培养中的优越性。 |
| 人类乳腺癌的最佳成本与培养条件 |
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¶ 图表左侧：
¶ 图表右侧：
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| 来源于小鼠成年神经干细胞（aNSCs）的脑类器官 | |
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¶ 3个月培养 - Orbital Shaker（摇床方法）：
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¶ 5个月培养 - CERO 3D系统：
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20倍更高的容量：
减少2-4倍的频繁传代：
降低50%的人工操作：
每个培养管中可获得超过200个类器官，无融合现象：
5个月稳定的类器官培养：
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| 胶质瘤类器官（glioma assembloids）作为肿瘤模型 | |
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¶ 第一种方法：步骤：将 GL261 胶质瘤球状体 和 大脑类器官 放在一起，首先共培养72小时。 接着：将培养物转入CERO培养系统继续培养48小时。 这个方法的目的：是通过模拟一个较短时间的相互作用和融合过程，利用CERO培养系统进一步促进细胞之间的交互和融合。CERO系统提供的三维培养环境有助于模拟更复杂的细胞行为，包括肿瘤细胞侵袭和相互作用。 |
¶ 第二种方法：步骤：将 GL261 胶质瘤球状体 和 大脑类器官 一起，直接用低吸附板培养120小时。 这个方法的目的：是在没有中间转移到CERO系统的情况下，通过持续的培养使这两种细胞在较长时间内融合与生长，观察它们在标准环境中的表现。 |
| 第一种方法：72小时的共培养后，再转入CERO培养48小时。这个组合方法展示了GL261 胶质瘤球状体和大脑类器官在CERO系统中的融合效果。您可以观察到，使用CERO系统后，细胞的融合性有显著改善，球状体和类器官之间有更强的表面连接，并且细胞更为均匀，具有更强的增殖能力。 | 第二种方法：直接在低吸附板上培养120小时。相比于第一种方法，这种直接培养方式的细胞表面连接性较弱，细胞形态较为不规则，缺乏明显的表面融合。虽然细胞增殖仍然存在，但没有CERO系统提供的优化条件，细胞形态和增殖速度较低。 |
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改善融合性：CERO 3D培养组的细胞显示出更强的表面连接性，超过50%的细胞相互融合形成了较为紧密的结构，而低吸附板培养组则显示出较差的融合性。 模拟肿瘤侵袭：CERO 3D培养系统模拟了肿瘤的生长和侵袭，类器官能够更好地围绕肿瘤组织生长，这对于研究肿瘤细胞的侵袭性具有重要意义。 提高增殖与存活：使用CERO 3D培养系统可以显著提高胶质瘤细胞的增殖能力和存活率，减少了细胞凋亡，促进了肿瘤模型的健康生长。 |
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| 成人干细胞（adult stem cells）源的胃类器官（Gastro Organoids） |
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| 器官外植体的成功培养 |
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培养步骤：
实验对象与应用：
培养条件：
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