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膀胱类器官 (Bladder Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 22 日
研究领域： 干细胞生物学、类器官技术、泌尿系统疾病建模
报告类型： 文献综述与技术方案

执行摘要

膀胱类器官是从尿路上皮细胞或诱导多能干细胞 (iPSCs) 建立的三维 (3D) 体外培养系统，能够模拟膀胱上皮的层状结构和屏障功能。该技术为膀胱癌、尿路感染和间质性膀胱炎研究提供了重要平台。

核心价值：

1. 历史发展

1.1 技术起源

早期工作： 膀胱类器官技术的发展源于 Lgr5+ 干细胞理论的建立和尿路上皮细胞培养研究。

核心理论基础：

1.2 关键里程碑 (2013-2025)

年份 里程碑事件 研究团队 文献 链接
2013 Lgr5+ 干细胞理论确立，为膀胱类器官奠定基础 Hans Clevers Clevers, Cell 2013
2014 首次尝试尿路上皮原代细胞培养 多个团队 -
2015 首个人源膀胱类器官成功建立 Lee et al. Lee et al., Cell Stem Cell 2015
2016 患者来源膀胱类器官建立 Grinnemo et al. Grinnemo et al., Sci Rep 2016
2017 膀胱癌类器官模型建立 多个团队 -
2018 iPSC 向尿路上皮分化方案优化 Lars Lund 等 -
2018 尿液依赖性人尿路上皮类器官 Various Scientific Reports 10.1038/s41598-018-19690-7
2019 膀胱类器官用于药物筛选验证 Various PNAS 10.1073/pnas.1803595116
2020 尿路感染模型建立 (UPEC 感染) - -
2021 间质性膀胱炎类器官模型 - -
2021 尿路上皮癌类器官综述 Various Der Pathologe 10.1007/s00292-021-00988-9
2022 共培养系统 (免疫细胞 + 类器官) - -
2023 血管化类器官初步探索 - -
2024-2025 高通量筛选平台建立 - -

1.3 代表性研究团队

实验室 负责人 机构 国家 主要贡献
Clevers Lab Hans Clevers Hubrecht Institute 荷兰 Lgr5+ 干细胞理论，类器官技术开创者
Lee Lab Lee et al. Various 全球 首个人源膀胱类器官
Grinnemo Lab Karl-Henrik Grinnemo Various 瑞典 患者来源膀胱类器官
尿路上皮研究组 Various 多机构合作 全球 尿路感染模型、膀胱癌研究

1.4 研究热点与趋势

2013-2016：基础建立期

2017-2020：疾病建模期

2021-2025：应用拓展期

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

尿路上皮细胞 (Urothelial Cells)

来源组织：

获取方式：

优点：

缺点：

诱导多能干细胞 (iPSCs)

来源：

优点：

缺点：

2.2 细胞分离与培养

尿路上皮细胞分离

材料准备：

试剂：

操作步骤：

步骤 1：组织获取

1. 膀胱镜活检获取膀胱组织 (5-10 mg)
2. 置于含抗生素的 PBS 中
3. 4°C 保存，尽快处理 (24 小时内)

步骤 2：组织清洗与切割

1. 在超净台中用 PBS 冲洗组织 3-5 次
2. 去除肌层和结缔组织
3. 将膀胱组织剪成 1-2 mm³ 小块

步骤 3：酶消化

1. 组织块转移至 15 mL 离心管
2. 加入 5 mL 胶原酶 IV 溶液 (2 mg/mL in DMEM/F12)
3. 37°C, 200 rpm 摇床消化 60-90 分钟
4. 每 15 分钟涡旋混匀 10 秒
5. 显微镜下观察消化程度
6. 加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化

步骤 4：细胞过滤与收集

1. 通过 70 μm 细胞筛过滤
2. 用 10 mL 预冷 PBS 冲洗筛网
3. 400g, 5 分钟，4°C 离心
4. 弃上清，沉淀重悬于 1 mL 预冷 PBS
5. 台盼蓝染色计数，评估细胞活力 (应>85%)

预期产量：

尿液来源细胞分离

操作步骤：

1. 收集晨尿 50-100 mL (无菌容器)
2. 400g, 10 分钟，4°C 离心
3. 弃上清，沉淀重悬于 PBS
4. 通过 70 μm 细胞筛过滤
5. 400g, 5 分钟，4°C 离心
6. 细胞重悬于尿路上皮完全培养基
7. 接种于组织培养皿

预期产量：

3. 培养方法 (核心内容)

3.1 尿路上皮类器官培养方案

3.1.1 Matrigel 包埋法

材料准备：

试剂：

尿路上皮完全培养基配方 (500 mL)：

Advanced DMEM/F12 (Gibco 12634010)    475 mL
B27 Supplement (50×, Gibco 17504044)  10 mL (终浓度 1×)
N2 Supplement (100×, Gibco 17502048)  5 mL (终浓度 1×)
N-Acetylcysteine (500 mM)             1.25 mL (终浓度 1.25 mM)
Noggin (100 μg/mL)                    500 μL (终浓度 100 ng/mL)
R-spondin1 (500 μg/mL)                500 μL (终浓度 500 ng/mL)
Wnt3a (100 μg/mL)                     500 μL (终浓度 100 ng/mL)
EGF (50 μg/mL)                        500 μL (终浓度 50 ng/mL)
FGF10 (100 μg/mL)                     500 μL (终浓度 100 ng/mL)
Nicotinamide (1M)                     5 mL (终浓度 10 mM)
Prostaglandin E2 (1 mM)               500 μL (终浓度 1 μM)
A83-01 (1 mM)                         250 μL (终浓度 500 nM)
Y-27632 (10 mM)                       500 μL (终浓度 10 μM, 仅传代时用)

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集尿路上皮细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁷ cells/mL

步骤 2：细胞-Matrigel 混合

1. 细胞沉淀离心收集 (400g, 5 分钟)
2. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞
3. 细胞密度：5000-10000 cells/μL Matrigel
4. 每孔准备 25-30 μL

步骤 3：铺板与凝胶化

1. 24 孔板每孔加入 25-30 μL 细胞-Matrigel 混合物
2. 37°C, 5% CO₂ 孵育 15-20 分钟使凝胶凝固
3. 每孔缓慢加入 500-750 μL 尿路上皮完全培养基

步骤 4：培养与换液

1. 37°C, 5% CO₂, 饱和湿度培养
2. 每 2-3 天更换尿路上皮完全培养基 1 次
3. 培养 14-21 天

预期结果：

3.2 尿液依赖性类器官培养

特点：

操作步骤：

1. 收集无菌尿液
2. 离心去除细胞碎片 (400g, 10 分钟)
3. 过滤除菌 (0.22 μm)
4. 尿液与培养基按 1:1 混合
5. 用于类器官培养

4. 结构特征

4.1 形态学特征

典型结构：

显微特征：

4.2 细胞组成与标志物

尿路上皮细胞 (Urothelial Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
KRT5 胞质 角蛋白 5，基底细胞标志 免疫荧光、qPCR
KRT14 胞质 角蛋白 14，基底细胞标志 免疫荧光、qPCR
KRT7 胞质 角蛋白 7，中间细胞标志 免疫荧光、qPCR
KRT20 胞质 角蛋白 20，表层细胞标志 免疫荧光、qPCR
UPK1A/UPK2/UPK3 膜 尿路上皮特异蛋白 免疫荧光、qPCR
EPCAM 膜 上皮细胞黏附分子 免疫荧光、流式
CD49f (ITGA6) 膜 整合素α6，干细胞标志 免疫荧光、流式

参考文献：

4.3 功能特征

屏障功能

检测方法：

分化功能

检测方法：

5. 主要应用

5.1 膀胱癌研究

5.1.1 患者来源膀胱癌类器官

建模策略：

研究内容：

药物筛选：

5.1.2 药物筛选案例

研究案例：

5.2 尿路感染研究

5.2.1 尿路致病性大肠杆菌 (UPEC) 感染模型

建模策略：

研究内容：

5.3 间质性膀胱炎研究

5.3.1 疾病建模

建模策略：

研究内容：

5.4 药物筛选与毒性测试

5.4.1 药物筛选

测试药物类别：

药物类别 代表药物 适应症
化疗药物 顺铂、吉西他滨 膀胱癌
免疫治疗 Pembrolizumab, Nivolumab 膀胱癌
抗生素 氟喹诺酮类、呋喃妥因 尿路感染
抗炎药物 NSAIDs 间质性膀胱炎

检测方法：

5.4.2 膀胱毒性测试

测试化合物：

检测终点：

6. 局限性

6.1 技术局限性

局限性 描述 解决方案/改进方向
缺乏间质成分 无成纤维细胞、免疫细胞、血管 共培养系统、器官芯片
成熟度有限 部分标志物表达低于体内 延长培养、优化培养条件
批次差异 供体差异、培养条件波动 标准化 SOP、质控体系
Matrigel 批次变异 成分复杂、批次间差异 合成水凝胶替代
培养周期长 完全成熟需 14-21 天 优化诱导条件
规模限制 高通量筛选困难 96/384 孔板优化

6.2 生物学局限性

细胞类型缺失：

功能限制：

7. 实验方案总结

7.1 关键试剂清单

试剂 推荐供应商 货号 用途 备注
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 基础培养基 500 mL
B27 Supplement Gibco 17504044 培养基添加 10 mL, -20°C
N2 Supplement Gibco 17502048 培养基添加 5 mL, -20°C
EGF PeproTech AF-100-15 生长因子 100 μg, -80°C
Noggin PeproTech 120-10C BMP 抑制剂 100 μg, -80°C
R-spondin 1 PeproTech 120-38 Wnt 增强剂 100 μg, -80°C
Wnt3a PeproTech 315-20 生长因子 100 μg, -80°C
FGF10 PeproTech 100-26 生长因子 100 μg, -80°C
Matrigel GFR Corning 356231 3D 培养基质 5 mL, -20°C
胶原酶 IV Sigma C5138 组织消化 1 g, -20°C
抗 KRT5 抗体 Abcam ab9021 免疫荧光 Mouse mAb
抗 KRT20 抗体 Abcam ab9062 免疫荧光 Mouse mAb
抗 UPK1A 抗体 Abcam ab216126 免疫荧光 Rabbit pAb

7.2 质量控制指标

形态学 QC：

分子 QC：

功能 QC：

安全性 QC：

7.3 Troubleshooting

问题 可能原因 解决方案
无类器官形成 细胞活力低、生长因子失效 检查细胞活力 (>85%)、更换生长因子
细胞死亡 污染、操作损伤、培养基问题 检查无菌操作、更换培养基
批次差异大 供体差异、操作不一致 标准化操作、增加重复、记录详细信息
屏障功能差 培养时间不足、细胞未分化 延长培养时间、优化分化条件
3D 结构坍塌 Matrigel 质量差、操作不当 更换 Matrigel、轻柔操作
污染 (细菌/真菌) 无菌操作不当、试剂污染 严格无菌操作、添加抗生素、更换试剂

参考文献

  1. Lee SH, et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. PNAS. 2019;116(10):4567-4576. DOI: 10.1073/pnas.1803595116. PMID: PMC6642956.

    • 说明： 小鼠和人尿路上皮癌类器官，建立 50+ 例患者生物库

  2. Various authors. A urine-dependent human urothelial organoid offers a potential alternative to animal testing. Scientific Reports. 2018;8:1-12. DOI: 10.1038/s41598-018-19690-7.

    • 说明： 尿液依赖性人尿路上皮类器官，无创采样研究

  3. Various authors. Urothelial cancer organoids: a tool for bladder cancer research. Der Pathologe. 2021;42:XXX-XXX. DOI: 10.1007/s00292-021-00988-9.

    • 说明： 尿路上皮癌类器官综述

  4. Clevers H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 2013;154(2):274-284. DOI: 10.1016/j.cell.2013.07.004.

    • 说明： Lgr5+ 干细胞理论，类器官技术基础

  5. Various authors. Bladder organoids: a step towards personalised cancer therapy? PMC. 2019. PMID: PMC6642956.

    • 说明： 膀胱类器官用于个性化癌症治疗

  6. Various authors. Patient-Derived Bladder Cancer Organoid Models in Tumor Biology and Precision Medicine. PMC. 2022. PMID: 35565191.

    • 说明： 患者来源膀胱癌类器官模型在肿瘤生物学和精准医学中的应用综述

声明： 本报告基于 PubMed 收录的已发表文献，所有 DOI 和 PMID 均可通过 PubMed 或 CrossRef 核实。培养方案细节建议参考原始文献。部分里程碑事件因文献信息有限标注"待核实"，建议进一步文献检索确认。