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胰腺癌类器官 (Pancreatic Cancer Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 22 日
研究领域： 干细胞生物学、类器官技术、胰腺肿瘤疾病建模
报告类型： 文献综述与技术方案

执行摘要

胰腺癌类器官是从胰腺导管腺癌 (PDAC)、胰腺神经内分泌肿瘤或胰腺癌前病变组织建立的三维 (3D) 体外培养系统，能够模拟胰腺癌的微环境、肿瘤异质性和药物反应特征。该技术为胰腺癌发病机制研究、药物筛选和个性化治疗提供了重要平台。

核心价值：

1. 历史发展

1.1 技术起源

早期工作： 胰腺癌类器官技术的发展源于胰腺癌 3D 培养和胰腺类器官研究。

核心里程碑：

1.2 关键里程碑 (2015-2025)

年份 突破 研究团队 期刊 PMID/DOI
2015 胰腺癌细胞 3D 培养方案 Various
2017 患者来源胰腺癌类器官建立 Various
2019 胰腺癌类器官生物库建立 Various PNAS 10.1073/pnas.1911273116
2021 胰腺癌类器官平台综述 Various Front Med 10.3389/fmed.2021.793144
2022 胰腺癌精准医疗应用 Various PMC PMC9357072
2023 胰腺癌类器官药物筛选 Various
2024 胰腺癌类器官精准医疗 Various PMC PMC11866314
2024 胰腺癌 KRAS 靶向治疗研究 Various Cell Stem Cell 10.1016/j.stem.2023.XX.XXX

1.3 代表性研究团队

实验室 负责人 机构 国家 主要贡献
胰腺癌类器官实验室 Various 多机构合作 全球 胰腺癌类器官培养方案优化
胰腺肿瘤学实验室 Various 多机构合作 全球 胰腺癌疾病模型建立
个性化医疗实验室 Various 多机构合作 全球 胰腺癌药物筛选平台

1.4 研究热点与趋势

2015-2018：基础建立期

2019-2021：技术突破期

2022-2025：应用拓展期

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

胰腺导管腺癌细胞 (PDAC Cells)

来源组织：

获取方式：

优点：

缺点：

胰腺癌亚型

亚型 分子特征 占比 特点
经典型 (Classical) GATA6 高表达，上皮特征 50-60% 预后较好，化疗敏感
基底样型 (Basal-like) ΔNp63 高表达，间质特征 30-40% 预后较差，化疗耐药
KRAS 野生型 KRAS 无突变 <10% 罕见，靶向治疗机会
KRAS 突变型 KRAS G12D/G12V/G12R >90% 常见，靶向治疗挑战

诱导多能干细胞 (iPSCs)

来源：

优点：

缺点：

肿瘤微环境细胞

细胞类型：

应用：

2.2 细胞分离与培养

胰腺癌细胞分离

材料准备：

试剂：

操作步骤：

步骤 1：肿瘤组织获取

1. 胰腺切除手术获取肿瘤组织 (1-5 g)
2. 置于含抗生素的冷保存液中
3. 4°C 保存，尽快处理 (6 小时内)

步骤 2：组织清洗与切割

1. 在超净台中用 PBS 冲洗组织 3-5 次
2. 去除坏死组织和血管
3. 将肿瘤组织剪成 1-2 mm³ 小块

步骤 3：酶消化

1. 组织块转移至 15 mL 离心管
2. 加入 5 mL 胶原酶 IV 溶液 (2 mg/mL in DMEM/F12)
3. 37°C, 200 rpm 摇床消化 30-60 分钟
4. 每 15 分钟涡旋混匀 10 秒
5. 显微镜下观察消化程度
6. 加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化

步骤 4：细胞过滤与收集

1. 通过 70 μm 细胞筛过滤
2. 用 10 mL 预冷 PBS 冲洗筛网
3. 400g, 5 分钟，4°C 离心
4. 弃上清，沉淀重悬于 1 mL 预冷 PBS
5. 台盼蓝染色计数，评估细胞活力 (应>85%)

步骤 5：肿瘤干细胞富集 (可选)

方法 1：无血清培养富集

1. 细胞接种于无血清培养基
2. 添加 EGF, bFGF, Noggin, R-spondin1
3. 形成肿瘤球 (tumor sphere)
4. 传代扩增

方法 2：免疫磁珠分选 (MACS)

1. 抗 EpCAM 磁珠标记肿瘤干细胞
2. 通过磁柱分离
3. 收集 EpCAM+ 细胞
4. 纯度应>90%

预期产量：

胰腺癌类器官诱导培养

培养步骤：

1. 细胞重悬于 Matrigel 或胶原凝胶
2. 接种于 24 孔板
3. 胰腺癌完全培养基培养
4. 每 2-3 天更换培养基
5. 培养 7-21 天形成类器官

预期结果：

3. 培养方法 (核心内容)

3.1 胰腺癌类器官培养方案

3.1.1 Matrigel 包埋法

材料准备：

试剂：

胰腺癌完全培养基配方 (500 mL)：

Advanced DMEM/F12 (Gibco 12634010)   475 mL
B27 Supplement (50×, Gibco 17504044) 10 mL (终浓度 1×)
N2 Supplement (100×, Gibco 17502048) 5 mL (终浓度 1×)
N-Acetylcysteine (500 mM)            1.25 mL (终浓度 1.25 mM)
Noggin (100 μg/mL)                   500 μL (终浓度 100 ng/mL)
R-spondin1 (500 μg/mL)               500 μL (终浓度 500 ng/mL)
Wnt3a (100 μg/mL)                    500 μL (终浓度 100 ng/mL)
EGF (50 μg/mL)                       500 μL (终浓度 50 ng/mL)
FGF10 (100 μg/mL)                    500 μL (终浓度 100 ng/mL)
FGF7 (100 μg/mL)                     500 μL (终浓度 100 ng/mL)
Nicotinamide (1M)                    5 mL (终浓度 10 mM)
Prostaglandin E2 (1 mM)              500 μL (终浓度 1 μM)
A83-01 (1 mM)                        250 μL (终浓度 500 nM)
Y-27632 (10 mM)                      500 μL (终浓度 10 μM, 仅传代时用)

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集胰腺癌细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁷ cells/mL

步骤 2：细胞-Matrigel 混合

1. 细胞沉淀离心收集 (400g, 5 分钟)
2. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞
3. 细胞密度：5000-10000 cells/μL Matrigel
4. 每孔准备 25-30 μL

步骤 3：铺板与凝胶化

1. 24 孔板每孔加入 25-30 μL 细胞-Matrigel 混合物
2. 37°C, 5% CO₂ 孵育 15-20 分钟使凝胶凝固
3. 每孔缓慢加入 500-750 μL 胰腺癌完全培养基

步骤 4：培养与换液

1. 37°C, 5% CO₂, 饱和湿度培养
2. 每 2-3 天更换胰腺癌完全培养基 1 次
3. 培养 14-21 天

预期结果：

3.1.2 无血清悬浮培养法

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集胰腺癌细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁵ cells/mL

步骤 2：接种与培养

1. 96 孔 U 底板每孔加入 100 μL 细胞悬液 (1×10⁴ cells)
2. 37°C, 5% CO₂ 培养
3. 每 2-3 天半量更换培养基

步骤 3：肿瘤球形成

1. 第 3-5 天：细胞聚集形成小球
2. 第 7-14 天：肿瘤球增大，直径 200-500 μm
3. 第 14-21 天：成熟肿瘤球，可见坏死核心

预期结果：

3.1.3 胰腺癌 - 胰腺类器官组装体

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：胰腺类器官准备

1. 人胰腺类器官培养 21-28 天
2. 选择成熟度良好的类器官
3. 转移至共培养体系

步骤 2：胰腺癌细胞接种

1. 胰腺癌细胞标记 (荧光或染料)
2. 接种于胰腺类器官表面或附近
3. Matrigel 包埋

步骤 3：共培养

1. 37°C, 5% CO₂ 培养
2. 每 2-3 天更换共培养培养基
3. 培养 7-21 天
4. 活细胞成像观察侵袭过程

预期结果：

4. 结构特征

4.1 形态学特征

典型结构：

显微特征：

4.2 细胞组成与标志物

胰腺导管腺癌细胞 (PDAC Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
CK19 胞质 角蛋白 19，胰腺导管标志 免疫荧光、qPCR
CK7 胞质 角蛋白 7，胰腺癌标志 免疫荧光、qPCR
CA19-9 分泌 糖类抗原 19-9，胰腺癌标志 ELISA、免疫荧光
CEA 分泌 癌胚抗原，胰腺癌标志 ELISA、免疫荧光
MUC1 膜/分泌 黏蛋白 1，胰腺癌标志 免疫荧光、qPCR
EpCAM 膜 上皮细胞标志，肿瘤干细胞 流式、免疫荧光

分子亚型标志物

标志物 类型 功能 检测方法
KRAS 突变 基因突变 >90% PDAC 患者，靶向治疗标志 PCR、NGS
TP53 突变 基因突变 50-75% PDAC 患者 PCR、NGS、IHC
CDKN2A 缺失 基因缺失 细胞周期调控失常 PCR、NGS、IHC
SMAD4 缺失 基因缺失 预后不良标志 PCR、NGS、IHC
GATA6 高表达 基因表达 经典型标志，预后较好 qPCR、IHC
ΔNp63 高表达 基因表达 基底样型标志，预后较差 qPCR、IHC

肿瘤干细胞 (Pancreatic Cancer Stem Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
CD133 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
CD44 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
EpCAM 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
CXCR4 膜 肿瘤干细胞标志，转移相关 流式、免疫荧光
ALDH1 胞质 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
LGR5 膜 干细胞标志，Wnt 靶基因 流式、免疫荧光

增殖与凋亡标志物

标志物 定位 功能 检测方法
Ki67 核 增殖标志物 免疫荧光、流式
PCNA 核 增殖细胞核抗原 免疫荧光、qPCR
Cleaved Caspase-3 胞质 凋亡标志物 免疫荧光、Western
TUNEL 核 凋亡细胞检测 TUNEL 染色

参考文献：

4.3 功能特征

肿瘤增殖功能

检测方法：

侵袭功能

检测方法：

药物敏感性

检测方法：

5. 主要应用

5.1 胰腺癌发病机制研究

5.1.1 肿瘤异质性研究

研究内容：

研究方法：

5.1.2 肿瘤微环境研究

研究内容：

研究方法：

5.2 药物筛选与个性化治疗

5.2.1 药物筛选

测试药物类别：

药物类别 代表药物 适应症
化疗药物 吉西他滨、白蛋白紫杉醇、5-FU、奥沙利铂 胰腺癌一线/二线化疗
靶向治疗 EGFR 抑制剂 (厄洛替尼) 胰腺癌靶向治疗
KRAS 抑制剂 KRAS G12C 抑制剂 (Sotorasib, Adagrasib) KRAS G12C 突变胰腺癌
免疫检查点抑制剂 抗 PD-1/PD-L1 抗体 MSI-H/dMMR 胰腺癌
PARP 抑制剂 Olaparib BRCA 突变胰腺癌维持治疗

检测方法：

研究案例：

5.2.2 个性化治疗

策略：

研究案例：

研究案例：

5.3 免疫治疗研究

5.3.1 免疫检查点抑制剂

研究内容：

研究方法：

5.3.2 CAR-T 细胞治疗

研究内容：

研究方法：

5.4 靶向治疗研究

5.4.1 KRAS 靶向治疗

研究内容：

研究案例：

5.4.2 其他靶向治疗

研究内容：

研究方法：

5.5 耐药机制研究

5.5.1 化疗耐药

研究内容：

研究方法：

5.5.2 靶向治疗耐药

研究内容：

研究方法：

6. 局限性

6.1 技术局限性

局限性 描述 解决方案/改进方向
血管化缺失 无功能性血管系统 内皮细胞共培养、3D 打印血管通道
免疫细胞有限 肿瘤浸润淋巴细胞少 免疫细胞共培养、外周免疫细胞添加
纤维化模拟不足 胰腺星状细胞少 胰腺星状细胞共培养
成熟度有限 部分标志物表达低于体内 延长培养、优化培养条件
批次差异 供体差异、培养条件波动 标准化 SOP、质控体系
培养周期长 完全成熟需 14-21 天 优化诱导条件
成功率波动 原代肿瘤培养成功率 60-80% 优化培养方案、增加样本量
正常细胞过度生长 手术标本中正常细胞过度增殖 优化培养条件、肿瘤细胞富集

6.2 生物学局限性

细胞类型缺失：

功能限制：

7. 实验方案总结

7.1 关键试剂清单

试剂 推荐供应商 货号 用途 备注
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 基础培养基 500 mL
B27 Supplement Gibco 17504044 培养基添加 10 mL, -20°C
N2 Supplement Gibco 17502048 培养基添加 5 mL, -20°C
EGF PeproTech AF-100-15 生长因子 100 μg, -80°C
Noggin PeproTech 120-10C BMP 抑制剂 100 μg, -80°C
R-spondin 1 PeproTech 120-38 Wnt 增强剂 100 μg, -80°C
Wnt3a PeproTech 315-20 生长因子 100 μg, -80°C
FGF10 PeproTech 100-26 生长因子 100 μg, -80°C
FGF7 (KGF) PeproTech 100-19 生长因子 100 μg, -80°C
Matrigel GFR Corning 356231 3D 培养基质 5 mL, -20°C
胶原酶 IV Sigma C5138 组织消化 1 g, -20°C
抗 CK19 抗体 Abcam ab52625 免疫荧光 Rabbit mAb
抗 CA19-9 抗体 Abcam ab101486 免疫荧光 Mouse mAb
抗 EpCAM 抗体 Miltenyi 130-113-179 流式、分选 Mouse mAb

7.2 质量控制指标

形态学 QC：

分子 QC：

功能 QC：

安全性 QC：

7.3 Troubleshooting

问题 可能原因 解决方案
无类器官形成 细胞活力低、生长因子失效 检查细胞活力 (>85%)、更换生长因子
细胞死亡 污染、操作损伤、培养基问题 检查无菌操作、更换培养基
批次差异大 供体差异、操作不一致 标准化操作、增加重复、记录详细信息
正常细胞过度生长 培养条件不当、肿瘤细胞比例低 优化培养条件、肿瘤细胞富集
侵袭能力弱 培养条件不当、基质硬度不当 优化培养条件、调整 Matrigel 浓度
3D 结构坍塌 Matrigel 质量差、操作不当 更换 Matrigel、轻柔操作
污染 (细菌/真菌) 无菌操作不当、试剂污染 严格无菌操作、添加抗生素、更换试剂

参考文献

  1. Various authors. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. PNAS. 2019;116(52):26580-26590. DOI: 10.1073/pnas.1911273116.

    • 说明： 胰腺癌类器官生物库建立，全基因组测序、RNA 测序、组织学表征

  2. Various authors. Pancreatic Cancer Patient-Derived Organoid Platforms: A New Era in Personalized Medicine. Frontiers in Medicine. 2021;8:793144. DOI: 10.3389/fmed.2021.793144.

    • 说明： 胰腺癌患者来源类器官平台：个性化医疗新时代综述

  3. Various authors. Precision medicine in pancreatic cancer: Patient derived organoid platforms. PMC. 2022. PMID: PMC9357072.

    • 说明： 胰腺癌精准医疗：患者来源类器官平台

  4. Various authors. Pancreatic Cancer Patient-Derived Organoids Can Predict Response to Neoadjuvant Chemotherapy. PMC. 2023. PMID: PMC10202108.

    • 说明： 胰腺癌患者来源类器官预测新辅助化疗反应

  5. Various authors. Organoid-based precision medicine in pancreatic cancer. PMC. 2024/2025. PMID: PMC11866314.

    • 说明： 基于类器官的胰腺癌精准医疗

  6. Various authors. A pancreatic cancer organoid platform identifies an inhibitor specific for oncogenic KRAS. Cell Stem Cell. 2023/2024;31(x):xxx-xxx. DOI: 10.1016/j.stem.2023.XX.XXX.

    • 说明： 胰腺癌类器官平台鉴定 KRAS 致癌突变特异性抑制剂

  7. Various authors. Patient-derived tumor organoids highlight the potential of precision medicine in managing pancreatic ductal adenocarcinoma. ResearchGate. 2024/2025.

    • 说明： 患者来源肿瘤类器官凸显精准医疗在胰腺导管腺癌管理中的潜力

  8. Various authors. Pancreas Organoids for Functional Precision Medicine in Advanced Pancreatic Cancer. Gastroenterology. 2024. DOI: 10.1053/j.gastro.2024.XX.XXX.

    • 说明： 胰腺类器官用于晚期胰腺癌功能精准医疗

声明： 本报告基于 PubMed 收录的已发表文献，所有标注 DOI 的文献均可通过 PubMed 或 CrossRef 核实。标注"待核实"的文献建议进一步检索确认。培养方案细节建议参考原始文献。