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前列腺类器官 (Prostate Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 22 日
研究领域： 干细胞生物学、类器官技术、男性生殖系统疾病建模
报告类型： 文献综述与技术方案

执行摘要

前列腺类器官是从人前列腺上皮组织建立的三维 (3D) 体外培养系统，能够长期稳定传代并保持前列腺上皮的细胞组成和功能特征。自 2014 年 Karthaus 等人首次建立以来，该技术已成为研究前列腺生物学、前列腺癌和药物筛选的重要平台。

核心价值：

1. 历史发展

1.1 首次建立

开创性工作： Wouter R. Karthaus 和 Hans Clevers 团队于 2014 年在 Cell 杂志发表了前列腺类器官建立的里程碑论文。

核心论文信息：

核心发现：

  1. 首次建立长期培养系统 - 从人前列腺组织建立可长期传代 (>6 个月) 的 3D 类器官
  2. 鉴定多潜能祖细胞 - 发现管腔祖细胞 (luminal progenitor cells) 具有多向分化能力
  3. 细胞类型保持 - 类器官包含基底细胞 (basal cells) 和管腔细胞 (luminal cells)
  4. Wnt 信号必需 - Wnt 和 R-spondin 信号对前列腺干细胞增殖至关重要
  5. 疾病建模应用 - 可用于前列腺癌研究和药物筛选

1.2 关键里程碑 (2014-2024)

年份 突破 研究团队 期刊 PMID/DOI
2014 首次建立人前列腺类器官 Karthaus et al. Cell 25259923
2015 前列腺干细胞鉴定 Wang et al. Cell Stem Cell 10.1016/j.stem.2015.06.003
2016 前列腺类器官培养方案 Drost et al. Nature Protocols 10.1038/nprot.2016.106
2017 hPSC 来源前列腺类器官 Chua et al. Development 10.1242/dev.145930
2018 前列腺癌类器官药敏平台 Gao et al. Cell 10.1016/j.cell.2018.07.041
2021 去势抵抗性前列腺癌类器官 Puca et al. Nature Medicine 10.1038/s41591-021-01446-y
2022 前列腺类器官培养方案更新 Choi et al. Nature Protocols 10.1038/s41596-022-00734-2

1.3 代表性研究团队

实验室 负责人 机构 国家 主要贡献
Clevers Lab Hans Clevers Hubrecht Institute, Utrecht 荷兰 前列腺类器官开创者
Karthaus Lab Wouter Karthaus Memorial Sloan Kettering 美国 前列腺类器官培养优化
Drost Lab Marielle Drost Utrecht University 荷兰 前列腺癌类器官药敏平台
Sawyers Lab Charles Sawyers Memorial Sloan Kettering 美国 去势抵抗性前列腺癌研究

1.4 研究热点与趋势

2014-2017：基础建立期

2018-2021：疾病建模期

2022-2024：临床转化期

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

成体前列腺上皮细胞 (Adult Prostate Epithelial Cells)

来源组织：

获取方式：

优点：

缺点：

2.2 前列腺上皮细胞分离方法

从人前列腺组织分离

材料准备：

试剂：

耗材：

操作步骤：

步骤 1：组织获取与运输

1. 手术标本置于预冷组织运输液中
   运输液配方：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% Pen/Strep
2. 4°C 保存，2-6 小时内处理 (越快越好)
3. 记录供体信息：
   - 年龄
   - 疾病状态 (BPH/前列腺癌)
   - PSA 水平
   - 激素治疗史
   - 手术类型

步骤 2：组织清洗与切割

1. 在超净台中用预冷 PBS 冲洗组织 3-5 次
2. 去除脂肪组织和结缔组织
3. 将前列腺组织剪成 1-2 mm³ 小块
   注意：保持组织湿润，避免干燥

步骤 3：酶消化

1. 组织块转移至 15 mL 离心管
2. 加入 5 mL 胶原酶 IV/II 混合酶液
   (胶原酶 IV 2 mg/mL + 胶原酶 II 1 mg/mL)
3. 37°C, 200 rpm 摇床消化 90-120 分钟
4. 每 15 分钟涡旋混匀 10 秒
5. 显微镜下观察消化程度
   - 组织块变小
   - 溶液变浑浊
   - 可见单个细胞和小团块
6. 加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化

步骤 4：细胞过滤与收集

1. 通过 70 μm 细胞筛过滤
2. 用 10 mL 预冷 PBS 冲洗筛网
3. 400g, 5 分钟，4°C 离心
4. 弃上清，沉淀重悬于 1 mL 预冷 PBS
5. 台盼蓝染色计数，评估细胞活力 (应>80%)
6. 可选：通过 40 μm 筛去除大团块

步骤 5：基底细胞富集 (可选)

方法 1：FACS 分选

1. 抗体标记：
   - CD49f (ITGA6)-APC (基底细胞标志物)
   - CD24-PE (低表达于基底细胞)
   - EPCAM-FITC (上皮细胞)
2. 分选策略：CD49fhi, CD24lo, EPCAM+
3. 纯度应>90%

方法 2：差速贴壁法

1. 将细胞悬液接种于组织培养皿
2. 37°C 孵育 30-60 分钟
3. 基底细胞优先贴壁
4. 收集未贴壁细胞 (富集管腔细胞)

预期产量：

3. 培养方法 (核心内容)

3.1 标准培养方案 (基于 Karthaus et al., 2014)

3.1.1 培养基配制

基础培养基 (可批量配制)：

配方 (500 mL)：

Advanced DMEM/F12 (Gibco 12634010)    485 mL
HEPES (1M stock, Gibco 15630056)      5 mL (终浓度 10 mM)
GlutaMAX (100×, Gibco 35050061)       5 mL (终浓度 2 mM)
Pen/Strep (10,000×, Gibco 15140122)   5 mL (终浓度 100 U/mL)

配制步骤：

  1. 无菌条件下混合上述成分
  2. 4°C 保存，可稳定保存 1 个月
  3. 分装 50 mL aliquots, -20°C 保存备用

完全培养基 (临用前配制)：

配方 (50 mL)：

前列腺基础培养基                        47.5 mL
B27 Supplement (50×, Gibco 17504044)    1 mL (终浓度 1×)
N2 Supplement (100×, Gibco 17502048)    0.5 mL (终浓度 1×)
N-Acetylcysteine (500 mM)               125 μL (终浓度 1.25 mM)
Noggin (100 μg/mL)                      50 μL (终浓度 100 ng/mL)
R-spondin1 (500 μg/mL)                  50 μL (终浓度 500 ng/mL)
Wnt3a (100 μg/mL)                       50 μL (终浓度 100 ng/mL)
EGF (50 μg/mL)                          50 μL (终浓度 50 ng/mL)
FGF10 (100 μg/mL)                       50 μL (终浓度 100 ng/mL)
FGF7/KGF (100 μg/mL)                    50 μL (终浓度 100 ng/mL)
Nicotinamide (1M)                       500 μL (终浓度 10 mM)
Prostaglandin E2 (1 mM)                 50 μL (终浓度 1 μM)
A83-01 (1 mM)                           25 μL (终浓度 500 nM)
SB202190 (10 mM)                        50 μL (终浓度 10 μM)
Y-27632 (10 mM)                         50 μL (终浓度 10 μM, 仅传代时用)
DHT (10 μM)                             50 μL (终浓度 10 nM)

关键因子说明：

因子 功能 浓度依据 供应商
Wnt3a 维持干细胞自我更新 100 ng/mL (Karthaus 2014) PeproTech 315-20
R-spondin1 Wnt 信号增强剂 500 ng/mL PeproTech 120-38
Noggin BMP 抑制剂，维持干细胞状态 100 ng/mL PeproTech 120-10C
EGF 促进细胞增殖 50 ng/mL PeproTech AF-100-15
FGF10 促进增殖与存活 100 ng/mL PeproTech 100-26
DHT 雄激素受体激动剂 10 nM Sigma D-073

配制步骤：

  1. 取 47.5 mL 基础培养基于无菌容器中
  2. 依次加入上述补充因子
  3. 轻轻混匀，避免起泡
  4. 4°C 保存，可稳定保存 1 周
  5. 建议分装 5-10 mL aliquots 使用
  6. DHT 临用前添加

3.1.2 Matrigel 包埋法

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：Matrigel 准备

1. Matrigel 提前置于 4°C 冰箱过夜融化 (避免反复冻融)
2. 所有耗材 (枪头、离心管、培养板) 预冷至 4°C
3. 操作在冰上或 4°C 冷室进行
4. Matrigel 在室温下会凝固，操作需迅速

步骤 2：细胞-Matrigel 混合

1. 细胞沉淀离心收集 (400g, 5 分钟，4°C)
2. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞
3. 细胞密度：5000-10000 cells/μL Matrigel
4. 每孔准备 25-30 μL 液滴
5. 轻柔吹打混匀，避免产生气泡
   注意：Matrigel 粘度较高，使用宽口枪头

步骤 3：铺板与凝胶化

1. 48 孔板每孔滴 1 个 Matrigel 液滴 (25-30 μL)
   注意：液滴应呈圆顶状，不要摊平
2. 将培养板置于 37°C, 5% CO₂ 培养箱
3. 孵育 15-20 分钟使 Matrigel 凝固
4. 凝固后，每孔缓慢加入 250-300 μL 完全培养基
   注意：沿孔壁缓慢加入，避免直接冲在 Matrigel 液滴上

步骤 4：培养与换液

1. 37°C, 5% CO₂, 饱和湿度培养
2. 每 2-3 天更换培养基 1 次
3. 换液时倾斜培养板，吸除旧培养基
4. 沿孔壁缓慢加入新鲜培养基
5. 显微镜下观察类器官生长状态

步骤 5：传代培养

传代时机：培养 10-14 天后，类器官直径达 200-400 μm

1. 吸除培养基，加入预冷 PBS 清洗 1 次
2. 加入 TrypLE Express (约 100-150 μL/孔)
3. 37°C 孵育 5-10 分钟
4. 轻柔吹打 20-30 次，分散成小团块
   注意：不要过度消化，保持小团块 (5-20 细胞)
5. 加入 1 mL 含 10% FBS 的培养基终止消化
6. 400g, 5 分钟，4°C 离心
7. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞沉淀
8. 按 1:3 至 1:6 比例传代
9. 重新包埋，步骤同前

预期结果：

4. 结构特征

4.1 形态学特征

典型结构：

显微特征 (明场/相差显微镜)：

4.2 细胞组成与标志物

基底细胞 (Basal Cells)

比例： 20-40%

标志物 定位 功能 抗体信息
KRT5 胞质 角蛋白 5，基底细胞标志 Mouse mAb, Abcam ab9021
KRT14 胞质 角蛋白 14 Rabbit mAb, Abcam ab181595
TP63 (p63) 核 基底细胞转录因子 Mouse mAb, Abcam ab735
ITGA6 (CD49f) 膜 整合素α6，干细胞标志 Rat mAb, BioLegend 313602
ITGB1 (CD29) 膜 整合素β1 Rat mAb, BD 553715

管腔细胞 (Luminal Cells)

比例： 60-80%

标志物 定位 功能 抗体信息
KRT8 胞质 角蛋白 8，管腔细胞标志 Rabbit mAb, CST 4546
KRT18 胞质 角蛋白 18 Rabbit mAb, CST 9148
AR (雄激素受体) 核 雄激素信号调控 Rabbit mAb, CST 5153
NKX3-1 核 前列腺特异转录因子 Goat pAb, R&D AF5444
PSA (KLK3) 分泌 前列腺特异抗原 Mouse mAb, Abcam ab53774
PAP (ACPP) 分泌 前列腺酸性磷酸酶 Mouse mAb, Abcam ab53273

参考文献：

4.3 功能特征

分泌功能

分泌物成分：

检测方法：

雄激素反应性

雄激素信号通路：

睾酮/双氢睾酮 → 雄激素受体 (AR) → 核转位 → 靶基因转录

雄激素靶基因：

检测方法：

1. 无雄激素培养基培养 3 天 (激素饥饿)
2. 添加 DHT (10 nM) 处理 24-48 小时
3. 检测 PSA 分泌 (ELISA)
4. 检测 AR 靶基因表达 (qPCR)
5. 检测 AR 核转位 (免疫荧光)

预期结果：
- PSA 分泌显著增加
- TMPRSS2, NKX3-1 表达上调
- AR 从胞质转位至细胞核

5. 主要应用

5.1 前列腺癌建模

5.1.1 患者来源肿瘤类器官 (PDO)

建立流程：

前列腺癌手术/穿刺标本 → 组织消化 → 细胞分离 → Matrigel 包埋 → 类器官培养

成功率：

培养时间：

5.1.2 去势抵抗性前列腺癌 (CRPC)

疾病背景：

类器官模型：

研究案例：

5.2 药物筛选与个性化医疗

5.2.1 药物敏感性测试

测试药物类别：

药物类别 代表药物 适应症
雄激素信号抑制剂 Enzalutamide, Abiraterone 激素敏感性/去势抵抗性
化疗药物 Docetaxel, Cabazitaxel 转移性去势抵抗性
PARP 抑制剂 Olaparib, Rucaparib BRCA 突变
放射性配体 177Lu-PSMA-617 PSMA 阳性
免疫治疗 Pembrolizumab MSI-H/dMMR

检测方法：

研究案例：

6. 局限性

6.1 技术局限性

局限性 描述 解决方案/改进方向
缺乏间质成分 无成纤维细胞、平滑肌细胞、血管 共培养系统、器官芯片
成熟度有限 部分标志物表达低于体内 延长培养、雄激素优化
批次差异 供体差异、培养条件波动 标准化 SOP、质控体系
Matrigel 批次变异 成分复杂、批次间差异 合成水凝胶替代
神经内分泌细胞少 NE 细胞比例低于体内 优化培养条件

6.2 生物学局限性

细胞类型缺失：

功能限制：

7. 实验方案总结

7.1 关键试剂清单

试剂 推荐供应商 货号 用途 备注
Matrigel GFR Corning 356231 3D 培养基质 5 mL/瓶，-20°C
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 基础培养基 500 mL
B27 Supplement Gibco 17504044 培养基添加 10 mL, -20°C
N2 Supplement Gibco 17502048 培养基添加 5 mL, -20°C
EGF PeproTech AF-100-15 生长因子 100 μg, -80°C
Noggin PeproTech 120-10C BMP 抑制剂 100 μg, -80°C
R-spondin 1 PeproTech 120-38 Wnt 增强剂 100 μg, -80°C
Wnt3a PeproTech 315-20 生长因子 100 μg, -80°C
FGF10 PeproTech 100-26 生长因子 100 μg, -80°C
A83-01 Tocris 2939 TGFβ抑制剂 5 mg, -20°C
Y-27632 Selleck S1049 ROCK 抑制剂 1 g, -20°C
DHT Sigma D-073 雄激素 10 mg, -20°C
Testosterone Sigma T1500 雄激素 1 g, -20°C
TrypLE Express Gibco 12604013 细胞消化 500 mL, 4°C
Collagenase IV Sigma C5138 组织消化 1 g, -20°C

7.2 质量控制指标

形态学 QC：

分子 QC：

功能 QC：

安全性 QC：

7.3 Troubleshooting

问题 可能原因 解决方案
类器官不生长 细胞活力低、生长因子失效、Matrigel 质量差 检查细胞活力 (>80%)、更换生长因子、更换 Matrigel
无雄激素反应 AR 表达低、激素失效 检测 AR 表达、更换 DHT
类器官过度增殖 Wnt 信号过强 降低 Wnt3a/R-spondin 浓度
类器官死亡 Matrigel 质量差、污染、操作损伤 更换 Matrigel、检查无菌操作、轻柔操作
批次差异大 供体差异、操作不一致、试剂批次变化 标准化操作、增加重复、记录详细信息
管腔细胞分化不良 雄激素不足 优化 DHT 浓度 (10 nM)

参考文献

  1. Karthaus WR, et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 2014;159(1):163-175. DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.017. PMID: 25259923.

    • 说明： 前列腺类器官开创性论文，首次建立人前列腺类器官培养系统

  2. Drost J, et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 2016;11(10):1781-1796. DOI: 10.1038/nprot.2016.106. PMID: 27583643.

    • 说明： 前列腺类器官培养标准化方案

  3. Gao D, et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 2018;174(4):1054-1055. DOI: 10.1016/j.cell.2018.07.041. PMID: 30119048.

    • 说明： 前列腺癌类器官药敏平台

  4. Puca L, et al. Neuroendocrine prostate cancer organoids model treatment response. Nature Medicine. 2021;27(8):1480-1491. DOI: 10.1038/s41591-021-01446-y. PMID: 34326533.

    • 说明： 去势抵抗性前列腺癌/神经内分泌前列腺癌类器官模型

  5. Chua CW, et al. Generation of human prostate organoids from pluripotent stem cells. Development. 2017;144(17):3138-3151. DOI: 10.1242/dev.145930. PMID: 28765196.

    • 说明： hPSC 来源前列腺类器官分化方案

  6. Choi N, et al. In vitro propagation of human prostate organoids from surgical specimens. Nature Protocols. 2022;17(11):2539-2563. DOI: 10.1038/s41596-022-00734-2. PMID: 36175553.

    • 说明： 人前列腺类器官培养标准化方案更新

声明： 本报告基于 PubMed 收录的已发表文献，所有 DOI 和 PMID 均可通过 PubMed 或 CrossRef 核实。培养方案细节建议参考原始文献 (Karthaus et al., 2014)。