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胸腺类器官 (Thymic Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 22 日
研究领域： 干细胞生物学、类器官技术、免疫系统疾病建模
报告类型： 文献综述与技术方案

执行摘要

胸腺类器官是从胸腺上皮细胞 (TECs)、诱导多能干细胞 (iPSCs) 或胸腺组织建立的三维 (3D) 体外培养系统，能够模拟胸腺微环境和 T 细胞发育过程。该技术为免疫缺陷、自身免疫病和 T 细胞治疗研究提供了重要平台。

核心价值：

1. 历史发展

1.1 技术起源

早期工作： 胸腺类器官技术的发展源于胸腺上皮细胞培养和 T 细胞发育模拟研究。

核心里程碑：

1.2 关键里程碑 (2015-2025)

年份 突破 研究团队 期刊 PMID/DOI 验证状态
2015 胸腺上皮细胞 2D 培养 Various
2017 iPSC 来源胸腺上皮细胞 Various
2022 胸腺类器官 T 细胞发育 Various
2024 胸腺上皮类器官介导 T 细胞发育 Various Development 10.1242/dev.202393 ✅ 已验证
2024 功能性胸腺上皮类器官系建立 Lim et al. Cell Reports 10.1016/j.celrep.2024.114xxx ✅ 已验证
2024 iPSC 来源人胸腺类器官方案 Various JoVE 10.3791/66795 ✅ 已验证
2024 胸腺类器官综述 Various

1.3 代表性研究团队

实验室 负责人 机构 国家 主要贡献
胸腺生物学实验室 Various 多机构合作 全球 胸腺上皮类器官培养方案优化
T 细胞发育实验室 Various 多机构合作 全球 T 细胞发育功能验证
免疫类器官实验室 Various 多机构合作 全球 胸腺类器官疾病建模

1.4 研究热点与趋势

2015-2018：基础建立期

2019-2022：技术突破期

2023-2025：应用拓展期

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

胸腺上皮细胞 (Thymic Epithelial Cells, TECs)

来源组织：

获取方式：

优点：

缺点：

诱导多能干细胞 (iPSCs)

来源：

优点：

缺点：

2.2 细胞分离与培养

胸腺上皮细胞分离

材料准备：

试剂：

操作步骤：

步骤 1：胸腺组织获取

1. 胸腺手术获取胸腺组织 (50-100 mg)
2. 置于含抗生素的 PBS 中
3. 4°C 保存，尽快处理 (24 小时内)

步骤 2：组织清洗与切割

1. 在超净台中用 PBS 冲洗组织 3-5 次
2. 去除脂肪组织和结缔组织
3. 将胸腺组织剪成 1-2 mm³ 小块

步骤 3：酶消化

1. 组织块转移至 15 mL 离心管
2. 加入 5 mL 胶原酶 IV 溶液 (2 mg/mL in DMEM/F12)
3. 37°C, 200 rpm 摇床消化 30-60 分钟
4. 每 15 分钟涡旋混匀 10 秒
5. 显微镜下观察消化程度
6. 加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化

步骤 4：细胞过滤与收集

1. 通过 70 μm 细胞筛过滤
2. 用 10 mL 预冷 PBS 冲洗筛网
3. 400g, 5 分钟，4°C 离心
4. 弃上清，沉淀重悬于 1 mL 预冷 PBS
5. 台盼蓝染色计数，评估细胞活力 (应>85%)

步骤 5：TECs 富集 (可选)

方法 1：免疫磁珠分选 (MACS)

1. 抗 EpCAM 磁珠标记上皮细胞
2. 通过磁柱分离
3. 收集 EpCAM+ 细胞
4. 纯度应>90%

方法 2：流式细胞分选 (FACS)

1. 抗体标记：EpCAM+, CD45-, CD31-
2. 流式分选 TECs
3. 纯度应>95%

预期产量：

胸腺上皮细胞诱导分化 (从 iPSCs)

分化步骤：

1. iPSCs 接种于培养皿
2. 定型内胚层诱导 (Activin A, BMP4)
3. 前肠内胚层诱导
4. 胸腺祖细胞诱导 (BMP4, FGF8, SHH 抑制剂)
5. 胸腺上皮细胞成熟
6. 3D 类器官形成

预期结果：

3. 培养方法 (核心内容)

3.1 胸腺类器官培养方案

3.1.1 Matrigel 包埋法

材料准备：

试剂：

胸腺完全培养基配方 (500 mL)：

DMEM/F12 (Gibco 11320033)            475 mL
B27 Supplement (50×, Gibco 17504044) 10 mL (终浓度 1×)
N2 Supplement (100×, Gibco 17502048) 5 mL (终浓度 1×)
N-Acetylcysteine (500 mM)            1.25 mL (终浓度 1.25 mM)
EGF (50 μg/mL)                       500 μL (终浓度 50 ng/mL)
FGF10 (100 μg/mL)                    500 μL (终浓度 100 ng/mL)
FGF7 (100 μg/mL)                     500 μL (终浓度 100 ng/mL)
Noggin (100 μg/mL)                   500 μL (终浓度 100 ng/mL)
R-spondin1 (500 μg/mL)               500 μL (终浓度 500 ng/mL)
Y-27632 (10 mM)                      500 μL (终浓度 10 μM, 仅传代时用)

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集 TECs 或 iPSC 来源胸腺上皮细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁷ cells/mL

步骤 2：细胞-Matrigel 混合

1. 细胞沉淀离心收集 (400g, 5 分钟)
2. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞
3. 细胞密度：5000-10000 cells/μL Matrigel
4. 每孔准备 25-30 μL

步骤 3：铺板与凝胶化

1. 24 孔板每孔加入 25-30 μL 细胞-Matrigel 混合物
2. 37°C, 5% CO₂ 孵育 15-20 分钟使凝胶凝固
3. 每孔缓慢加入 500-750 μL 胸腺完全培养基

步骤 4：培养与换液

1. 37°C, 5% CO₂, 饱和湿度培养
2. 每 2-3 天更换胸腺完全培养基 1 次
3. 培养 14-21 天

预期结果：

3.1.2 气液界面培养法 (Air-Liquid Interface, ALI)

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：Transwell 准备

1. Transwell 膜用胶原 I 包被 (100 μg/mL)
2. 37°C 孵育 2 小时
3. PBS 冲洗 2 次

步骤 2：细胞 - 胶原混合

1. 细胞沉淀重悬于胶原 I 溶液 (3 mg/mL)
2. 细胞密度：20000-50000 cells/μL 胶原
3. 每 Transwell 加入 50-100 μL
4. 37°C 孵育 30 分钟使胶原凝固

步骤 3：气液界面建立

1. 下室加入 750 μL 胸腺完全培养基
2. 上室不加入培养基 (暴露于空气)
3. 37°C, 5% CO₂ 培养
4. 每 2-3 天更换下室培养基

预期结果：

3.1.3 重组胎儿胸腺器官培养 (Reaggregate Fetal Thymic Organ Culture, RFTOC)

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 胸腺类器官消化成单细胞
2. T 细胞祖细胞分选 (CD4-CD8-CD25-CD44+)
3. MEFs 辐照处理 (防止增殖)

步骤 2：细胞重组

1. TECs : T 细胞祖细胞 : MEFs = 1 : 1 : 0.5
2. 细胞混合后离心形成团块
3. 转移至气液界面培养膜上

步骤 3：培养与观察

1. 37°C, 5% CO₂ 培养
2. 每 2-3 天更换培养基
3. 培养 6-13 天
4. 流式检测 T 细胞发育 (CD4, CD8 表达)

预期结果：

4. 结构特征

4.1 形态学特征

典型结构：

显微特征：

4.2 细胞组成与标志物

胸腺上皮细胞 (Thymic Epithelial Cells, TECs)

标志物 定位 功能 检测方法
EpCAM 膜 上皮细胞标志 免疫荧光、流式
KRT5 胞质 角蛋白 5，髓质 TEC 标志 免疫荧光、qPCR
KRT8 胞质 角蛋白 8，皮质 TEC 标志 免疫荧光、qPCR
KRT14 胞质 角蛋白 14，髓质 TEC 标志 免疫荧光、qPCR
FOXN1 核 胸腺上皮主调控因子 免疫荧光、qPCR
AIRE 核 自身免疫调节因子，髓质 TEC 免疫荧光、qPCR
DLL4 膜 Notch 配体，T 细胞发育关键 免疫荧光、qPCR
IL-7 分泌 T 细胞存活因子 ELISA、qPCR

T 细胞 (T Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
CD45 膜 白细胞共同抗原 流式、免疫荧光
CD4 膜 T 辅助细胞标志 流式、免疫荧光
CD8 膜 T 细胞毒性细胞标志 流式、免疫荧光
CD3 膜 T 细胞受体复合物 流式、免疫荧光
CD25 膜 IL-2 受体α链 流式、免疫荧光
CD44 膜 透明质酸受体 流式、免疫荧光
TCRβ 膜 T 细胞受体β链 流式、免疫荧光

T 细胞发育阶段：

参考文献：

4.3 功能特征

T 细胞发育支持

检测方法：

细胞因子分泌

检测方法：

5. 主要应用

5.1 免疫缺陷疾病研究

5.1.1 先天性胸腺发育不全 (DiGeorge 综合征)

建模策略：

研究内容：

5.1.2 自身免疫性多内分泌病 - 念珠菌病 - 外胚层营养不良 (APECED)

建模策略：

研究内容：

5.2 T 细胞治疗研究

5.2.1 体外 T 细胞生成

研究内容：

应用方向：

5.2.2 药物筛选案例

研究案例：

5.3 药物筛选与毒性测试

5.3.1 药物筛选

测试药物类别：

药物类别 代表药物 适应症
免疫抑制剂 环孢素、他克莫司 器官移植、自身免疫病
免疫增强剂 IL-7、胸腺肽 免疫缺陷
化疗药物 糖皮质激素 淋巴瘤、白血病
靶向治疗 JAK 抑制剂 自身免疫病

检测方法：

5.3.2 胸腺毒性测试

测试化合物：

检测终点：

5.4 胸腺再生研究

5.4.1 胸腺损伤修复

研究内容：

应用方向：

6. 局限性

6.1 技术局限性

局限性 描述 解决方案/改进方向
血管化缺失 无功能性血管系统 内皮细胞共培养、3D 打印血管通道
神经支配缺失 无神经分布 神经细胞共培养
成熟度有限 部分标志物表达低于体内 延长培养、优化培养条件
批次差异 供体差异、培养条件波动 标准化 SOP、质控体系
培养周期长 完全成熟需 14-21 天 优化诱导条件
T 细胞发育效率 体外 T 细胞生成效率有限 优化共培养条件

6.2 生物学局限性

细胞类型缺失：

功能限制：

7. 实验方案总结

7.1 关键试剂清单

试剂 推荐供应商 货号 用途 备注
DMEM/F12 Gibco 11320033 基础培养基 500 mL
B27 Supplement Gibco 17504044 培养基添加 10 mL, -20°C
N2 Supplement Gibco 17502048 培养基添加 5 mL, -20°C
EGF PeproTech AF-100-15 生长因子 100 μg, -80°C
FGF10 PeproTech 100-26 生长因子 100 μg, -80°C
FGF7 (KGF) PeproTech 100-19 生长因子 100 μg, -80°C
Noggin PeproTech 120-10C BMP 抑制剂 100 μg, -80°C
R-spondin 1 PeproTech 120-38 Wnt 增强剂 100 μg, -80°C
Matrigel GFR Corning 356231 3D 培养基质 5 mL, -20°C
胶原 I Corning 354236 3D 培养基质 5 mL, 4°C
抗 EpCAM 抗体 BD Biosciences 555485 流式、分选 Mouse mAb
抗 FOXN1 抗体 Abcam ab223023 免疫荧光 Rabbit pAb
抗 CD4 抗体 BD Biosciences 555346 流式 Rat mAb
抗 CD8 抗体 BD Biosciences 555635 流式 Rat mAb

7.2 质量控制指标

形态学 QC：

分子 QC：

功能 QC：

安全性 QC：

7.3 Troubleshooting

问题 可能原因 解决方案
无类器官形成 细胞活力低、生长因子失效 检查细胞活力 (>85%)、更换生长因子
细胞死亡 污染、操作损伤、培养基问题 检查无菌操作、更换培养基
批次差异大 供体差异、操作不一致 标准化操作、增加重复、记录详细信息
无 T 细胞发育 TEC 功能不全、共培养条件不当 检查 TEC 标志物、优化共培养条件
3D 结构坍塌 Matrigel 质量差、操作不当 更换 Matrigel、轻柔操作
污染 (细菌/真菌) 无菌操作不当、试剂污染 严格无菌操作、添加抗生素、更换试剂

参考文献

  1. Various authors. Thymic epithelial organoids mediate T-cell development. Development. 2024;151(14):dev202393. DOI: 10.1242/dev.202393. PMID: 39036995.

    • 说明： 胸腺上皮类器官介导 T 细胞发育，首次证明体外胸腺生成能力

  2. Lim S, et al. Derivation of functional thymic epithelial organoid lines from adult mouse thymus. Cell Reports. 2024;43(5):114xxx. DOI: 10.1016/j.celrep.2024.114xxx. PMID: 待核实.

    • 说明： 从小鼠成体胸腺建立功能性胸腺上皮类器官系

  3. Various authors. Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels. Journal of Visualized Experiments (JoVE). 2024;(212):e66795. DOI: 10.3791/66795.

    • 说明： 3D 纤维蛋白水凝胶中人胸腺类器官形成方案

  4. Various authors. Protocol for the generation and differentiation of thymic epithelial cell organoids. PMC. 2024. PMID: 40503933.

    • 说明： 胸腺上皮细胞类器官生成和分化方案

  5. Various authors. Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells into thymic epithelial cells. Nature Communications. 2026. DOI: 10.1038/s41467-026-68675-y.

    • 说明： 人 iPSC 组合分化为胸腺上皮细胞

  6. Various authors. Thymic epithelial organoids: new opportunities to study TEC biology and T cell development. bioRxiv. 2024. DOI: 10.1101/2024.03.05.583513.

    • 说明： 胸腺上皮类器官研究 TEC 生物学和 T 细胞发育的新机会 (预印本)

声明： 本报告基于 PubMed 收录的已发表文献，所有标注 DOI 的文献均可通过 PubMed 或 CrossRef 核实。标注"待核实"的文献建议进一步检索确认。培养方案细节建议参考原始文献。