¶ 使用RosetteSepTM混合物在ParsortixTM分离之前去除白细胞（WBC）
¶ 介绍
本文件中描述的方法仅供研究使用，不得用于临床或诊断程序。
在ParsortixTM系统上分离血液样本时，可以收获目标细胞群体（例如循环肿瘤细胞（CTCs）），同时伴随残留的白细胞（WBC）。通常，在使用推荐的标准条件（全血抽取到EDTA真空采血管内，分离操作需在抽血后48小时内进行，使用GEN3D6.5分离盒，分离压力为99mbar）分离健康正常志愿者（HNV）血液样本时，残留的白细胞数量通常在2,000至10,000个细胞之间。对于几种（尤其是基于RNA和DNA的）CTC识别方法，这些残留的白细胞数量会导致较高的背景噪声，从而使得低数量的CTC的识别和分析变得极其困难，甚至不可能进行。
一种非常有效的方法是在使用ParsortixTM分离之前，通过使用RosetteSepTM人类CD45去除混合物去除血液细胞，从而减少ParsortixTM收获过程中残留的白细胞数量。以下是供应商（STEMCELL Technologies）官网上关于RosetteSepTM人类CD45去除混合物的描述：
RosetteSepTM 人类 CD45 去除混合物旨在通过去除 CD45+ 细胞，从全血中富集上皮来源的循环肿瘤细胞（CTCs）。该混合物利用四聚体抗体复合物靶向识别红细胞（RBC）上的 CD45、CD66b 和糖蛋白 A，从而去除不需要的细胞。将血液样本在如 Lymphoprep™（目录号 #07801）等浮力密度介质上离心时，不需要的细胞与红细胞一起沉淀。纯化后的上皮肿瘤细胞则以高度富集的群体形式出现在血浆与浮力密度介质的界面处。
在ParsortixTM系统上进行样本分离之前使用RosetteSepTM人类CD45去除混合物，可以将收获物中的残留白细胞数量从典型的6000个减少至大约30至200个细胞。然而，目标细胞的捕获率以及随之而来的收获量也会受到RosetteSepTM人类CD45去除混合物的影响，捕获率大约降低33%。使用RosetteSepTM去除混合物的总体处理时间（从处理血液样本的开始到从Parsortix仪器中收获的时间）更短且更一致，约为100分钟。对于需要高纯度的情况，推荐使用此方法。
¶ 试剂和耗材
除了在PR1-OM-D Parsorter PR1操作手册中列出的试剂（用于标准分离条件）之外：
| 产品 | 目录号 | 制造商 |
| RosetteSepTM 人类 CD45 去除混合物 | Depletion 15162 | STEMCELL Technologies |
| LymphoprepTM | 07801 | STEMCELL Technologies |
| SepMateTM-50 (IVD) | 85450 | STEMCELL Technologies |
¶ 方法
- 将血液收集到10ml K2EDTA Vacutainer管中，并在4°C下保存，最长可保存48小时。
- 在分离血液的当天，确保ParsortixTM仪器已清洁（每次分离、收获或染色后都必须进行清洁）。如有疑虑，应在分离血液样本前再次清洁仪器。
- 将血液样本放置在滚筒混合器上，加热至室温，持续15分钟。
- 可选：如果分离的是健康正常志愿者（HNV）血液且需要添加癌细胞，请根据实验室的操作程序，将200个CellTracker Green标记的细胞加入每个血液样本中。如果不需要添加癌细胞，请跳过此步骤，直接进行第5步。
- 每1ml血液加入50μl RosetteSepTM去除混合物（即向10ml血液样本中加入500μl RosetteSepTM去除混合物）。
- 将样本在滚筒混合器上室温孵育20分钟。
- 将50ml SepMateTM圆锥管加满至少12ml LymphoprepTM试剂。确保通过管子中心的孔口，完全填充每个管子的下层室。
- 使用血清学吸管将血液样本缓慢加入LymphoprepTM试剂上方。
- 小心将SepMateTM管转移到离心机中，以1200 x g的速度离心20分钟，刹车关闭。
- 从离心机中取出管子。使用10ml血清学吸管，轻轻吸取每个SepMateTM管上层的血浆层，并转移至一个标准的50ml圆锥管中。使用带1ml吸头的移液器，将上层剩余的血浆层转移到同一个50ml圆锥管中。目标细胞会存在于血浆层中。
- 使用标准分离条件（即缓冲液槽中加入PBS，启动槽中加入乙醇，清洗槽中加入10%的Decomatic或10%的LabKlenz 110，使用GEN3D6.5分离盒），在ParsortixTM仪器上分离和收获回收的血浆样本，按照以下协议进行操作：
- PX2_PF（预处理）
- PX2_S99F（分离）
- PX2_H（收获）
- PX2_CT (清洗)
注意：此程序中不需要预收获冲洗（PX2_CT2）步骤。
-
- 对于未加癌细胞样本，按照相关协议在收获中识别CTC。对于加了癌细胞的样本，在收获前记录分离盒中的捕获癌细胞数量，然后在ParsortixTM收获中记录CTC和白细胞（WBC）数量。
¶ 样本结果
此白细胞去除技术已通过使用健康正常志愿者（HNV）血液并加入两种细胞系（A549（肺）和SKBR-3（乳腺））进行验证。在验证实验中，至少15个血液样本每个样本中加入约200个细胞（每种细胞系），并记录了细胞捕获、收获、回收以及残留白细胞（WBC）数量，以评估整体性能。
分离富集A549细胞的表现
图1：使用A549细胞加标健康正常志愿者（HNV）血液的ParsortixTM系统样本处理，比较有无白细胞去除10ml EDTA血液样本加入CellTracker Green标记的A549细胞后，分别进行了两种处理：一组样本使用RosetteSepTM去除混合物（Rosette）处理以减少白细胞数量（如上所述），另一组样本则在加标后立即进行ParsortixTM系统分离（对照组）。实验记录了A549细胞的捕获率（表示为分离盒中A549细胞捕获数量与细胞加标数量的百分比）和收获率（表示为收获中A549细胞数量与细胞加标数量的百分比）。回收率计算为收获中A549细胞数量与分离盒中捕获的A549细胞数量的百分比。白细胞（WBC）值为收获中的总有核血细胞数量。值得注意的是，A549细胞加标后的变异性也反映在A549细胞的捕获率和收获率的变动中。数据集包含了来自六个不同日期的分离结果。
分离富集SKBR-3细胞的表现
图2：使用SKBR-3细胞加标健康正常志愿者（HNV）血液的ParsortixTM系统样本处理，比较有无白细胞去除10ml EDTA血液样本加入CellTracker Green标记的SKBR-3细胞后，分别进行了两种处理：一组样本使用RosetteSepTM去除混合物（Rosette）处理以减少白细胞数量（如上所述），另一组样本则在加标后立即进行ParsortixTM系统分离（对照组）。实验记录了SKBR-3细胞的捕获率（表示为分离盒中SKBR-3细胞捕获数量与细胞加标数量的百分比）和收获率（表示为收获中SKBR-3细胞数量与细胞加标数量的百分比）。回收率计算为收获中SKBR-3细胞数量与分离盒中捕获的SKBR-3细胞数量的百分比。白细胞（WBC）值为收获中的总有核血细胞数量。值得注意的是，SKBR-3细胞加标后的变异性也反映在SKBR-3细胞的捕获率和收获率的变动中。数据集包含了来自三个不同日期的分离结果。
¶ 故障排除
使用RosetteSep™人类CD45去除混合物会导致细胞损失（对于两种测试的细胞系，约为33%），与未使用RosetteSepTM步骤的对照条件相比。尚未研究细胞损失发生在哪个步骤。可能的原因包括：在密度离心步骤中发生目标细胞损失；在使用移液器转移过程中发生目标细胞损失；或在Parsortix系统内部发生目标细胞损失。
在将血浆层转移到标准的50ml圆锥管时，应小心避免打扰密度梯度介质，以确保完整地转移上层的血浆层。若血浆层的转移量不同，可能会导致捕获和收获结果的不一致。
该技术尚未在临床样本中进行测试。