¶ 用于悬浮生物反应器中干细胞培养的可定制软生物功能化藻酸盐微载体
¶ 作者
Michael M. Gepp1,2、Petra Geßner3、Isabelle Sébastien1,2、Karina Ivaskevica1,2、Julia C. Neubauer1,2、Heiko Zimmermann1,4,5
1.德国苏尔茨巴赫弗劳恩霍夫生物医学工程研究所 IBMT
2.弗劳恩霍夫干细胞工艺工程项目中心，德国维尔茨堡
3.德国里登海姆 Alginatec 有限公司
4.分子与细胞生物技术/纳米技术，萨尔州大学，德国萨尔布吕肯
5.智利科金博，北天主教大学海洋科学学院
¶ 简介
三维（3D）细胞培养技术在研究与生物技术产业中正日益凸显其重要性。特别是多能干细胞在工业化规模下的扩增与分化，已成为众多学术机构与产业研发团队的核心研究方向。尽管针对谱系特异性三维培养的优化方案及培养基已存在，但生物材料与细胞支架仍待进一步发展。研究证实，由于更高的比表面积（图1a），微载体可显著提升生物工艺的生产效率——例如减少培养基需求量，并能在单一生物反应器系统中产出更多细胞。然而，目前市售适用于干细胞的软性微载体系统仍屈指可数。值得注意的是，生物材料的力学特性（如弹性模量）对细胞培养行为具有显著影响。因此，具有可调机械特性的海藻酸盐微载体在组织工程新型细胞模型中展现出独特优势，因其能更精准地模拟体内生理环境特性（图1b）。在本应用指南中，我们将系统阐述软性海藻酸盐微载体的特性，及其通过CERO悬浮生物反应器系统整合至人诱导多能干细胞（hiPSC）扩增工艺的实施方案。
¶ 材料与方法
¶ 藻酸盐微载体
藻酸盐微载体的生产（所有步骤均在里登海姆的 Alginatec GmbH 公司进行）包括从干燥的褐藻 Lessonia nigrescens 和 Lessonia trabeculata 中提取和纯化超高粘性（UHV）藻酸盐，其质量控制流程源自文献[4]。 将两种无菌藻酸盐等量混合，使用同轴气流液滴发生器产生球形珠子。 藻酸盐液滴在含有 20 mM BaCl2 的交联浴中凝胶化。 然后对珠子进行修饰，固定关键的生化分子，使干细胞能够粘附并形成菌落（另见[1]和[2]）。 第一步，使用水性碳二亚胺化学方法激活海藻酸珠的羧基。 在第二个孵育步骤中，Matrigel™ 与藻酸盐表面共价结合（见图 1）。 经过孵育和彻底清洗，我们确定了涂有 Matrigel™ 的藻酸盐微载体的特性。 我们评估了它们的功能性、无菌性、大小和单位体积的生长面积。 然后将微载体储存在 4°C 的等渗氯化钠溶液中，直至使用。 我们使用纳米压痕系统 PAVONE（Optics11life）测量了藻酸盐微载体的机械性能。
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| 图 2：在悬浮生物反应器和藻酸盐微载体上对 UKBi005-A 细胞系进行三维培养。 (a) 细胞总数和 (b) 细胞培养四天后的存活率。 结果表明，在 2.49 至 4.44kPa 的严格范围内，杨氏模量与细胞行为之间没有相关性。 播种密度为 6.0 x 104 cells/cm2 细胞支架样品。 (c) 在由不同成分的海藻酸混合物制备的三维细胞支架上进行三维培养后，对 UKBi005-A 细胞系进行的 FACS 分析。 在悬浮生物反应器中培养四天后，可检测到两种多能性标记 SSEA4 和 OCT-3/4 以及一种分化标记 SSEA1 的阳性细胞百分比。 n = 3 个生物重复。 误差条代表标准偏差（±SD）。 | ||
¶ 在 CERO 生物反应器中进行三维微载体细胞培养
实验中使用的是 hiPSC 株系 UKBi005-A（https://hpscreg.eu/cell-line/UKBi005-A）。 根据标准化方案，细胞在mTeSR™1培养基（Stemcell Technologies公司，法国）中的Matrigel™涂层培养皿中培养，并在60-80%汇合度时使用无酶分离试剂EDTA进行分离。 在悬浮生物反应器 CERO 中，在涂有 Matrigel™ 的藻酸盐微载体上进行三维培养。 首先制备涂有 Matrigel™ 的藻酸盐微载体，用于接种细胞。 总生长面积为 20 平方厘米的微载体用于在悬浮生物反应器中培养。 在 1 毫升由 mTeSR1 和 10 毫摩尔 ROCK 抑制剂（比例为 1:1000）组成的培养基中接种藻酸盐微载体。 悬浮生物反应器中的细胞培养密度为 6.0 - 104 个细胞/平方厘米细胞支架面积。 细胞计数后，将 hiPSC 与细胞培养基中的微载体混合，并转移到 CERO 管中。 随后将试管放入 CERO 生物反应器系统（均为 OMNI Life Science GmbH & Co： 4 秒，搅拌时间：2 分钟，搅拌暂停：5 分钟）： 5 分钟）。 12 小时后，生物反应器以 40 转/分的转速和 4 秒的旋转周期进行培养。
¶ 细胞收获和细胞分析
为了收获细胞，微载体用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤两次，加入缓冲液并在短暂孵育后再次吸出。 第二次洗涤后，加入乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。 将装有微载体的试管放入悬浮生物反应器中，使用适当的程序培养 20 分钟。 试管以每分钟 60 转的速度旋转，并不断改变方向（每 5 秒），不能停顿。 培养时间结束后，将试管从悬浮生物反应器中取出并摇晃一次。 为了停止分离反应，用移液管将由 mTeSR1 和 10 mM Rock 抑制剂（比例为 1:1000）组成的培养基注入细胞悬浮液中。 为了将海藻酸盐微载体与 iPS 细胞分离，细胞悬浮液用 200 μm 筛过滤。 过滤后，测定细胞总数和细胞存活率。 然后取质控样本进行 FACS 分析。 使用 NucleoCounter® NC-202™ 自动细胞计数器测定 iPS 培养物的细胞数和存活率。 使用两种测量方法分析多能性和分化标记的表达。 在整个研究过程中，UKBi005-A 细胞系的多能性使用流式细胞仪和相衬显微镜进行评估。
¶ 结果与讨论
¶ 海藻酸盐微载体的一般特性和处理方法
藻酸盐微载体的生长面积可通过移液和离心调整相应的体积。 每个小瓶都标明了每毫升的生长面积，因此接种过程快速可靠。 微载体即开即用，在使用前储存在 4°C 等渗氯化钠溶液中，无需再进行补水。 微载体与低浓度多聚酶相容。 这最大程度地减少了微载体对塑料表面的吸附。 透明、无自动荧光藻酸盐微载体上的 HiPSC 可通过相衬或激光共聚焦扫描显微镜等各种显微技术进行成像记录和分析。 染色时可使用荧光染料和抗体，成像时无需修改制造商的染色方案。 与其他商用微载体不同，藻酸盐微载体质地柔软，可模仿体内环境的机械特性。 微载体的直径可调，可生产 100 微米到 500 微米的微载体。 使用这些微载体时，可使用标准实验室设备收获细胞。 可以通过离心和筛分来分离培养基和长满细胞的微载体。 藻酸盐微载体的密度约为 1014 kg/m³，因此沉淀速度较慢。 不过，这也意味着在搅拌式生物反应器中进行搅拌所需的能量较少。 细胞分离可使用胰蛋白酶、TrypLE™、阿库酶或 EDTA。 此外，市售的藻酸盐裂解酶也可用于降解水凝胶，从而在标准的二维细胞培养表面重新培养扩增细胞。 海藻酸的粘度和弹性模量会随着时间的推移而改变，这取决于储存条件和生产模具。 改变细胞支架的几何形状和模量（2.0-8.0 千帕）不会影响 hiPSC-3D 培养的效率或质量。
¶ hiPSC 在 CERO 生物反应器中的三维扩增
藻酸盐微载体用于在 CERO 悬浮生物反应器中扩增 hiPSC。 研究了不同机械性能（E-Modul 越大）的微载体，并在 4 天后测量了存活率和细胞总数。 总体而言，数据（见图 2 a-c）显示，与 hiPSC 的兼容性极佳，与海藻酸盐的配方无关。 扩增后的存活率超过 85%，细胞总数至少达到 6.0x106 ± 1,8x106。 结果得出结论，不同的弹性模量对 UKBi005-A 细胞的增殖没有不利影响。 细胞总数和存活率都没有受到细胞支架机械性能的影响。 扩增的细胞也通过流式细胞术（FACS）进行了分析。 多能性标志物的表达模式与细胞支架的杨氏模量无关。 除了对 UKBi005-A 细胞的增殖和多能性进行定性评估外，还对整个培养过程进行了显微评估。 培养最后一天的代表性图像如图 3 所示。
¶ 研究结论
在这项研究中，涂有 Matrigel™ 的藻酸盐微载体被鉴定为一种重要的生物材料，可用于干细胞在软微载体上的悬浮生物反应器中扩增。 研究人员对海藻酸盐在环境条件影响下的机械特性、粘度与弹性模量之间的相关性以及海藻酸盐与 iPSC 细胞系之间的相互作用有了新的认识。 研究发现，尽管混合物成分的粘度不同，但藻酸盐微载体的弹性模量为 2.5 至 4.5 千帕，这并不影响 hiPSC 的扩增效率。 在这些细胞支架上培养的 hiPSC 具有很高的存活率（85%-95%）和良好的粘附性。 其他研究表明，藻酸盐微载体可作为复杂干细胞过程的一部分（见[7]），并与各种人类细胞系统兼容。 因此，藻酸盐微载体可与间充质干细胞培养方案[1]、肾近端肾小管上皮细胞[5]、神经细胞[3]和 3,56 kPa 2,83 kPa 2,49 kPa 4,44 kPa 2,97 kPa 4,13 kPa 的 hiPSC 扩增和分化方案相结合。
培养心肌细胞。 此外，藻酸盐微载体在附着 hiPSC 玻璃化研究中表现稳定[6]。 超高真空海藻酸盐微载体在干细胞过程中的主要优点如下：
- 可调节的柔软生理表面
- 直径可调
- 各种涂层（Matrigel™、胶原 I、层粘连蛋白、酪氨酸等）
- 可调节的机械性能（类脑组织到类心脏组织）
- 多维生物相互作用
- 与各种细胞系统兼容（hMSC、hiPSC、心肌细胞、神经细胞、成纤维细胞、内皮细胞......）。
- 易于扩展
- 高表面体积比
- 易于集成到现有工艺中
- 可通过筛分等方式轻松回收过量生长的微载体
- 使用海藻酸酶进行酶降解
- 透明度高，可进行显微分析