¶ 应用介绍：打印海藻酸盐珠粒
Joséfin Blell, MSc, Christen Boyer, PhD, 和 Itedale Namro Redwan, PhD CELLINK, 瑞典哥德堡
¶ 摘要
海藻酸盐是一种常用的天然生物材料，在组织工程中广泛应用，并且作为水凝胶在细胞包埋和生物活性物质递送系统中得到了广泛使用。BIO X 3D生物打印机通过使用注射泵打印头或电磁滴液打印头，可以快速自动地进行海藻酸盐珠粒的包埋，支持定制从毫米到微米尺度的球形包埋。
¶ 引言
¶ 海藻酸盐生物材料
海藻酸钠是一种多功能材料，因其良好的生物相容性和易于交联的特性，在3D打印和组织工程中被广泛应用。海藻酸盐来源于褐藻，主要由D-甘露糖酸（M）和L-古鲁糖酸（G）残基组成。二价离子与G块相互作用，形成交联结构（图1），氯化钙（CaCl2）是常用的交联剂，因其水溶性较好，能够实现快速交联。交联后的海藻酸盐可以通过添加钙离子保持结构稳定，减缓降解。高分子量海藻酸盐也能延缓降解速率。海藻酸盐具有pH响应性，分子链上的羧基在不同pH值下膨胀比例不同。此外，海藻酸盐缺乏支持细胞粘附、增殖和分化的识别位点，但可以通过功能化处理，加入粘附肽和生长因子，增强其生物功能。海藻酸盐可与其他材料，如胶原蛋白或羟基磷灰石结合，以改善机械强度、调控药物释放等性能。
海藻酸盐在药物递送系统中的应用已有60多年历史，主要用作增稠剂和控释剂。近年，海藻酸盐作为组织定位药物递送载体和细胞治疗载体得到更多关注。药物从海藻酸盐中释放的速率受到分子大小、交联剂、膨胀性和pH等因素的影响。海藻酸盐特别适用于包埋蛋白药物，保护蛋白质免受胃酸环境的破坏，并可调控药物的释放速率。
¶ EMD打印头
电磁滴液（EMD）打印头（型号CELLINK 000000020566）与BIO X生物打印机（型号CELLINK D16110020717）兼容，适用于低粘度生物墨水、水凝胶和培养基的非接触式精准滴液。这种喷墨式生物打印技术不仅打印速度快，而且精度高。通过调节气动压力和微阀开启时间，可以控制滴液的流速和体积。EMD打印头支持不同微阀直径和行程长度，以适应不同尺寸的滴液需求。特别适合用于海藻酸盐等低粘度材料的亚毫米级精确包埋。
¶ 海藻酸盐珠粒的制作
注射泵打印头（SPPH）（CELLINK，000000020344）与BIO X生物打印机兼容，能够挤出低粘度和高粘度的生物材料和生物墨水，适合滴液打印。这种打印头可以直接连接3毫升注射器，方便将细胞混合到生物墨水中后使用。SPPH非常适合制造毫米级的海藻酸盐珠粒，尤其适用于海藻酸盐生物材料混合物或复合材料，根据表1的数据对BIOX进行设置能够制造出均匀且可重复的珠粒（图2）。
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表1. 使用EMD打印头或SPPH在BIO X打印机上设置滴液的参数。 |
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|---|---|---|---|
| 设备/参数 | EMD Printhead Syringe Pump | EMD Printhead Syringe Pump | EMD Printhead |
| 藻酸盐浓度 | 1% | 1–3% | 1% |
| BIO X模式 | 生物打印 | 生物打印 | 滴液打印 |
| 培养板格式 | 6孔 | 6孔 | 96孔 |
| 每孔CaCl2体积 | 7 mL | 7 mL | 100 µL |
| STL文件 | 20 x 20 x 1 mm | 20 x 20 x 1 mm | - |
| 网格填充 | 5% | - | - |
| 喷嘴/针头 | 100–300 µm | 22G–32G | 27G |
| 压力 | 90–120 kPa | N/A | N/A |
| 阀门设置 | 1个微阀开启，210个循环周期 | N/A | N/A |
| 挤出速率，回缩速率 | N/A | 10 µL/s, 0 µL/s | 40 µL/s, 35 µL/s |
| 挤出体积，回缩体积 | - | - | 8 µL/s, 35 µL/s |
| 移动速度 | 7 mm/s | 7 mm/s | - |
| 自由落体距离（Z轴） | 30–40 mm | 30–40 mm | 30–40 mm |
| X/Y轴校准 | 孔中心 | 孔中心 | 孔中心 |
注：这些值仅供参考起始参数，根据应用进行调整。在BIO X上，SPPH只能到达孔板的前半部分。
表1列出的参数是推荐的初始设置，可以根据具体的应用需求和期望的珠粒尺寸（参见图3）进行调整。图4展示了生物打印的配置，并描绘了从针尖/喷嘴端到浴液表面的自由落体高度。这一自由落体高度是打印过程中的关键因素，它确保了海藻酸盐滴液在落入交联浴之前能够稳定地形成球形。
¶ 细胞包埋应用
类球体因其在3D细胞培养中模拟体内环境和促进细胞成熟而受到青睐。它们还能生产细胞外基质，并通过基质传输营养物质，便于后续的实验处理。
在实验中，我们用SPPH和HepG2肝细胞类球体进行研究。类球体在SphericalPlate 5D中培养3天后打印（图5A）。我们使用1.5%的海藻酸盐溶液，每个孔板加入氯化钙溶液。在BIO X上设置打印参数，包括尺寸、速度和填充率。打印头喷墨速率为10 µL/s，无回缩，STL文件参数可调。类球体与海藻酸盐混合后，用22G喷嘴封闭，以防损坏，并放置在SPPH中以防止沉降。喷嘴校准后，启动打印。打印完成后，珠粒经PBS清洗并添加培养基（图5B）。我们比较了生物反应器和静态培养下细胞和类球体的状态，发现到第7天时，细胞健康，类球体完整（图6）。
¶ 总结
海藻酸盐的优越性：海藻酸盐因其易于交联和良好的生物相容性，成为组织工程中理想的生物材料。
打印过程的简便性：使用BIO X系统生成海藻酸盐珠粒的过程简单，并且可以通过不同的打印头进行灵活调整，以满足特定需求。
广泛的应用前景：海藻酸盐适合用于细胞、药物、蛋白质和纳米材料的包埋，可用于控释或再生医学等领域。
¶ 参考文献
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