¶ Cell Stem Cell
¶ 生成具有脊髓三叉神经核的人类区域特异性脑类器官
¶ 作者
魏庞,金奎朱,柯欣杨,...,姚尹,子玲陈,杨飞向
Correspondence xiangyf@s hanghaitech.edu.cn
图形摘要
¶ 亮点
人类髓质SpV样类器官(hmSpVOs)是由人类多能干细胞(hPSCs)创建的。
类似于背髓的脊神经三叉核。
在长期培养中表现出结构和功能的成熟。
三叉丘脑束在和丘脑类器官之间建立。
¶ 简而言之
生成具有核特异性身份的脑类器官是具有挑战性的。Xiang及其同事报告了一种生成特定人类区域脑类器官的方法,这些类器官重现了髓质脊髓三叉神经核(SpV)和三叉丘脑连接。这些发现为研究人类 及其相关电路和脑疾病提供了一个可获取的模型。
¶ 人类区域特异性脑类器官的生成与髓质脊髓三叉神经核
魏庞,1,4 金奎朱,1,4 杨克欣,1 朱晓娜,1 周伟,1 姜琳琳,1 庄旭然,1 刘艳彤,1 魏建锋,1 陆晓翔,1 尹瑶,1 陈子玲,1 和向扬飞 上海科技大学生命科学与技术学院,中国上海 201210 2上海科技大学先进医疗材料与设备国家重点实验室,中国上海 201210 3上海临床研究与试验中心,中国上海 201210 4这些作者贡献相同 5主要联系人 *通讯: xiangyf@shanghaitech.edu.cn https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.08.004
¶ 摘要
具有特定核身份的脑类器官为研究人脑发育和疾病提供了独特的平台,能够以更精细的分辨率进行研究。尽管在重要的身体功能中发挥着至关重要的作用,后脑的髓质却缺乏体外模型,更不用说类似于特定髓质核的模型,包括将外周感觉信号传递到丘脑的关键脊髓三叉神经核(SpV)。在这里,我们报告了一种将人类多能干细胞分化为类似于髓质后脑背侧区域的区域特异性脑类器官的方法。重要的是,这些类器官特异性地重现了源自背侧髓质的SpV的发展。我们还开发了一种类器官系统,通过融合这些类器官,即人类髓质SpV样类器官(hmSpVOs)与代表丘脑的类器官(hThOs),来创建 与丘脑之间的三叉丘脑投射。我们的研究为理解SpV的发展、基于核的电路组织及相关疾病提供了一个平台。
¶ 介绍
在过去的十年中,从无指导的脑类器官1到通过指导分化构建的各种区域特异性脑类器官2–5,以及整合多个谱系或脑区之间相互作用的更复杂的类器官(即组装体)6–12,脑类器官代表了一种前沿策略,用于揭示人脑的生物学。尽管已经建立了各种区域特异性脑类器官,但重现脑核特异性特征的努力仍处于早期阶段。我们最近开发了一种方法,以在通向人类脑丘脑类器官中建模人类丘脑网状核13。早期的报告建立了一种生成具有弓状核特征的人类下丘脑类器官的方法14。在二维(2D)培养中生成脑核特异性细胞也是可能的15。然而,考虑到大脑中功能核的多样性,具有核特异性特征的区域特异性脑类器官的可用性仍然有限,且尚未用人类细胞建模核特异性脑电路。重现核特异性特征的区域特异性脑类器官将有助于更精确和深入地理解人脑16。
三叉神经核的组成部分。脊髓三叉神经核(SpV)可以进一步分为三个亚核:口腔亚核(Vo)、插极亚核(Vi)和尾部亚核(Vc)。其中,Vo和Vi与触觉感知相关,而位于延髓的Vc则是负责将头部的痛觉和温度感知传递到丘脑的核,这对维持身体正常生理功能至关重要。尽管SpV在感官处理和调节、神经痛病因学,甚至病原体引起的病理反应中发挥着关键作用,但目前尚无关于人类SpV的模型。在这里,我们应用了引导的三维(3D)人类多能干细胞(hPSCs)分化,并开发了一种生成具有特定延髓SpV特征的人类区域特异性脑类器官的方法,即人类延髓SpV样类器官(hmSpVOs)。我们通过单细胞转录组分析剖析了hmSpVO发育过程中的谱系特异性,并描绘了hmSpVOs的结构和功能成熟。随后,我们构建了一个类器官模型,以重现人类SpV与丘脑之间的三叉丘脑投射,通过将hmSpVOs与丘脑类器官(hThOs)融合形成人类融合SpV-丘脑类器官(hSTOs)。我们预计我们的方法将为未来研究人类 、其相关神经回路和相关脑疾病提供一个可及的体外模型。
脊髓三叉神经核(SpV),是跨越整个脑干的最大颅神经核,是其中一个重要的
¶ 结果
从人类多能干细胞生成hmSpVOs为了确定髓质SpV发育的分化条件,我们应用了之前建立的静态到旋转的3D培养策略。8,11–13 从分离的H9人胚胎干细胞(hESCs)中产生了均匀的胚样体(EBs)。应用双SMAD抑制以诱导神经外胚层命运,同时补充CHIR99021(WNT激活剂)和视黄酸(RA)。WNT和RA是对后脑发育至关重要的尾部化线索,而WNT信号也诱导背侧模式形成。17–19 在筛选的条件中(代表性条件见图S1A),我们识别出WNT和RA处理的组合,可以实现背侧-尾侧后脑的局限性分化,可能具有髓质的菱脊节r7/8特征(例如,C6和C9,图S1B– S1F)。髓质后脑的背侧部分包含两个主要的祖细胞域:位于最背侧的OLIG3+ A类祖细胞和位于更腹侧的B类祖细胞,这些细胞生成来自于其的ladybird同源盒1(LBX1)+神经元(图S1G)。19 具体而言,髓质dBLa和dBLb域均源自dB1域,分别生成SpV的抑制性神经元(InNs)和兴奋性神经元(ExNs)19–21 转录组分析表明,来自候选条件(即C9,以下简称hmSpVO策略;图1A)的类器官与dBLb、dBLa和密切相关的dB1域显示出最高的相似性(图S1H)。qPCR分析还显示hmSpVO具有类B特征,可以通过BMP4或SHH处理有效地向背侧或腹侧转移(图S1I和S1J)。由于长期WNT激活增强了神经上皮的扩展,我们向hmSpVO培养中添加了溶解的Matrigel( ),以帮助神经上皮组织的折叠(图1A)。hmSpVO的RNA测序(RNA-seq)分析进一步验证了它们的后脑特异性身份,与hESCs和我们之前建立的人类皮层类器官(hCOs)不同。8 (图1B)。HOX基因平行组3-4的表达也揭示了hmSpVO与髓质发育的尾侧后脑之间的相关性(图1B),19,22与转录组相似性分析一致(图S1E)。我们还确认了4条不同的hPSC系(H9和H1 hESC系以及hiPSC系RC01001A和RC01001B)在hmSpVO分化过程中可以建立类似的头尾身份,这与hCOs、hThOs和H9 hESCs形成对比(图1C)。
在hmSpVOs中独特生成的细胞在hThOs和hCOs中并未出现(图1F)。与转录组分析一致,hmSpVOs未显示出明显的OLIG3+ A类谱系或由NKX6-1、PHOX2B或NKX2-2标记的腹侧位置谱系(图S2D– S2F)。此外,在 中未检测到SOX10阳性的神经嵴谱系,类似于hThOs和hCOs(图S2A– S2C)。在hmSpVOs中经过更长时间的培养(第30天,图1G– 1I),可以产生丰富的LMX1B 细胞和PAX2 /LHX1/5 细胞,分别表明与SpV相关的兴奋性和抑制性神经谱系的发展19,21。通过与兴奋性标记物囊泡谷氨酸转运蛋白2(vGLUT2)和抑制性标记物γ -氨基丁酸(GABA)进行免疫染色,验证了LMX1B+和PAX2+细胞的身份(图1J和1K)。值得注意的是,标记髓质中B类神经元并决定SpV中中继神经元的体感命运的同源域因子LBX120在hmSpVOs中广泛表达,而在hThOs或hCOs中未发现(图1L)。正如我们之前报道的那样8,12,hCOs和hThOs能够分别生成TBR1+皮层神经元和TCF7L2+丘脑神经元,而这两者在hmSpVOs中几乎未被产生(图1M和1N),再次表明hmSpVOs的区域身份独特。除了来自H9 hESCs的hmSpVOs外,来自H1 hESCs以及hiPSC系RC01001A和RC01001B的hmSpVOs也显示出相似的谱系发展(图S2G– S2N),定量分析显示与hThOs和hCOs相比,所有细胞系来源的hmSpVOs中特别富集了PAX2+和LMX1B+细胞的产生(图1I),表明hmSpVO的生成在不同的hPSC系中具有可靠性。
单细胞转录组学揭示了hmSpVOs中的SpV谱系特异性为了进一步分析hmSpVOs的区域身份和谱系特征,我们对来自hmSpVOs的7,214个细胞在两个发育时间点(第30天和第62天)的单细胞转录组进行了分析(图2A)。统一流形近似和投影(UMAP)维度识别出14个簇,这些簇进一步被分类为5种主要细胞类型,包括神经祖细胞(NPC)、中间祖细胞(IP)、未成熟神经元(IM)、外部神经元(ExN)和内部神经元(InN)(图2A、2B、S3A和S3B)。为了理解hmSpVOs的区域身份,我们将类器官特征与人类胎儿大脑图谱整合,23这表明hmSpVOs与人类大脑的髓质最为相似(图2C、2D、S3C和S3D)。与来自人类组织的不同细胞类型的比较验证了注释细胞簇的相关性(图2D,右侧)。在hmSpVO衍生细胞中,HOX基因平行组3-4的表达再次确认了它们的髓质身份(图S3E)。我们还应用了VoxHunt,24该工具将单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据空间映射到来自艾伦大脑图谱的小鼠原位杂交数据;分析显示hmSpVOs与小鼠后脑的髓质具有最高的相关性(图S3F和S3G)。
RNA-seq分析还显示,虽然hmSpVOs复制体与dBLb、dBLa及其相关的dB1区域具有高度相似性,但当施加腹侧模式化时,这种区域特异性身份可能会减弱(图1D),再次表明SpV发育在hmSpVOs中的相关性。我们随后通过免疫染色验证了hmSpVOs中SpV相关谱系的生成。早期阶段(第16天)的hmSpVOs富含PAX7+和 祖细胞,并开始产生PAX2+和LMX1B+分化细胞;相比之下,hThOs和hCOs则没有大量产生这些细胞类型,除了存在SO 祖细胞(图1E和S2A– S2C)。同样,阳性细胞对于PAX2和LIM同源盒1/5(LHX1/5)是SpV InN分化所必需的。
我们发现,对于hmSpVO衍生的ExN组,转运蛋白vGLUT2而不是vGLUT1主要被表达(图2B),这证实了在体内观察到的髓质SpV主要表达vGLUT2.25 在SpV发育的dBLa和dBLb的经典标记物的表达情况是
图1. 从人类多能干细胞(hPSCs)生成hmSpVOs
(A) 示意图显示了hmSpVOs的分化条件(上)和不同发育阶段hmSpVOs的形态(下)。SB,SB431542;LDN,LDN193189 CHIR,CHIR99021;RA,视黄酸;EGF,表皮生长因子;NGF,神经生长因子;BDNF,脑源性神经营养因子。 (B) 基于大规模RNA测序, 中区域特异性基因的表达与其他样本的比较。点的大小表示每个基因的log 。 (C) 来自不同hPSC系的第30天hmSpVOs中HOX基因表达的qPCR分析。数据表示均值 SEM( 次重复的H9 hESC衍生hmSpVOs, 次重复的H1 hESC衍生hmSpVOs, 次重复的hiPSCs RC01001A衍生hmSpVOs, 次重复的hiPSCs RC01001B衍生hmSpVOs, 次重复的hCOs, 次重复的hThOs,以及n 次重复的H9 hESCs)。
(D) 第30天hmSpVOs与不同神经亚组的腹侧hmSpVOs的相似性分析。
(E 和 F)对 hmSpVOs、hThOs 和 hCOs 进行 PAX7 和 PAX2 的免疫染色(E),LHX1/5 和 PAX2 的免疫
染色(F)。 (G 和 H)对 进行 PAX7 和 LMX1B 的免疫染色(G),LHX1/5 和 PAX2 的免疫
染傲不同的hPSC系衍生的第30天hmSpVOs中定量PAX2+和LMX1B+细胞。数据表示均值 标准差 , 9和8个器官样本,分别来自3批H9 hESC、H1 hESC、RC01001A hiPSC和RC01001B hiPSC衍生的hmSpVOs; 4来自2批hCOs和hThOs;每个器官样本量化1-2个随机切片; , , , ,红色符号表示与hThOs的比较,蓝色表示与hCOs的比较)。使用ANOVA进行多重比较分析测试进行统计分析。
(J 和 K)对 进行 vGLUT2 和 LMX1B(J)、GABA 和 PAX2(K)的免疫染色。(L)对 hmSpVOs、hThOs 和 hCOs 进行 LBX1 和 OLIG3 的免疫染色。(M 和 N)在 hmSpVOs、hThOs 和 hCOs 中对 MAP2 和TBR1(M)、MAP2 和 TCF7L2(N)进行免疫染色。比例尺:在(A)中为 ;在(E)– (H)和(L)中为 ;在(J)、(K)、(M)和(N)中为 。另见图 S1 和
图2. 的单细胞转录组分析
(A) hmSpVOs在第30天(4,176个细胞)和第62天(3,038个细胞)的7,214个细胞的scRNA-seq数据的UMAP嵌入。 (B) 点图显示hmSpVOs每个簇中细胞类型特异性基因的表达。 (C) 人类胎儿大脑图谱的UMAP图(左)和整合轮廓(右)。 (D) hmSpVOs与人类胎儿大脑(5-14周后[pcw])之间的区域(左)和细胞类型(右)相似性的热图。 (E) 点图显示hmSpVOs每个簇中背髓亚区特异性基因的表达。 (F) 特征图显示hmSpVOs中细胞类型特异性基因的表达。 (G) 热图显示不同背腹亚区的相似性(基因来自小鼠延髓发育综述;见STAR方法)和hmSpVOs的不同细胞类型。 (H) 热图显示不同人类延髓核(24-57岁)与hmSpVOs中不同细胞类型之间的相似性。 (I) 轨迹分析显示hmSpVOs中细胞的伪时间。 (J) 山脊线图显示hmSpVOs中细胞类型的伪时间。
经过检查,发现体内的dBLa特异性基因如PAX2、LHX1和LHX5主要在InN组中表达,而dBLb特异性基因,包括TLX3、LMX1B和POU4F1,主要在ExN组中检测到;LBX1,作为B类神经元的标记物,也定义了躯体感觉命运,在各种细胞簇中广泛表达,除了NPC(图2E、2F和S3H)。相反,PHOX2B,作为其他后脑核团中内脏感觉特异性的关键因子,并未表达(图S3H)。对后脑不同发育领域的基因特征分析再次揭示,hmSpVOs中的InNs和ExNs最接近dBLa和dBLb领域(图2G)。这些数据与大规模RNA测序和免疫染色分析一致(图1D– 1K),并与dBLa和dBLb领域分别负责在体内生成SpV InNs和ExNs的事实相符,19–21 从而验证了hmSpVOs中不同SpV谱系的特异性。
细胞类型通过单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)进一步得到了验证,表明它们在SpV发育过程中的细胞命运决策中发挥作用(图2L和S3L)。此外,与我们建立的其他区域特异性脑类器官的scRNA-seq数据进行比较,包括hCOs和hThOs,8,12 也揭示了hmSpVOs的SpV特异性身份(图S3M和S3N)。对参与SpV、皮层或丘脑发育的特定细胞群体的定量分析进一步验证了hmSpVOs与hCOs和hThOs相比的独特区域身份(图2M)。总之,我们的结果表明hmSpVOs重现了髓质SpV中的谱系特征,并促进了人类SpV发育中神经发生和基本调控因子的剖析。
为了进一步验证亚区域特异性身份,我们使用艾伦脑成人人类数据库(见STAR方法)比较了hmSpVOs与不同人类髓核的转录组特征。值得注意的是,hmSpVO衍生的细胞与人类SpV最为相似(图2H)。此外,已知SpV是一个延伸结构,跨越脑桥和后脑的延髓,并可以分为Vo、Vi和Vc,其中Vc位于延髓(图S3I)。我们的结果显示,hmSpVOs与延髓的相似性最高,这表明hmSpVOs中的SpV相关细胞可能具有类似Vc的身份。因此,我们调查了ExN和InN组中已知的Vo、Vi和Vc标记物的表达。26 实际上,ExN组与Vc区域的相似性高于Vo和Vi;然而,InN组对Vo、Vi或Vc区域并没有表现出特定的偏好(图S3J)。未来对人脑组织进行单细胞分辨率的研究将有助于理解人类SpV兴奋性投射神经元是否具有比SpV InNs更为特定的脑亚区域特征。
¶ hmSpVOs的长期结构和功能成熟
为了促进hmSpVOs的长期发展,特别是促进投射轴突的生长,我们准备了300微米的hmSpVO切片,并在气-液界面上培养它们。冷冻切片和免疫染色显示,3个月大的在气-液界面上培养的hmSpVOs含有LMX1B+和PAX2+细胞,分别代表兴奋性和抑制性谱系的发展(图3A和3B),与早期阶段一致(图1G– 1K和2A)。来自多个hPSC系(即H9和H1 hESCs以及RC01001A hiPSCs)的长期培养hmSpVOs的定量分析显示,PAX2+和LMX1B+细胞的存在相似(图3C)。为了了解完整hmSpVOs的结构,我们进行了全挂染色,结果显示hmSpVOs在超过4个月的长期培养后表现出丰富的轴突和树突过程(图3D)。值得注意的是, 轴突在类器官边缘附近表现出有规律的组织,最终形成一个合并的NF 轴突通路,缺乏MAP2+树突过程(图3D)。远离类器官边缘,MAP2+树突和NF+轴突显示出随机的空间组织(图3E)。在不同阶段定量hmSpVOs显示,这种边缘富集的轴突通路在更长的培养后出现(即超过120天)(图3F和3G)。与H9 hESC衍生的hmSpVOs类似,来自其他hPSC系(例如H1 hESCs和RC01001A hiPSCs)的类器官在长期培养后也同样发展出边缘富集的轴突通路(图3H和S4A)。这些结果表明,hmSpVO细胞具有以合并方式从类器官中投射轴突的潜力,这种模式类似于大脑中的SpV投射神经元27。我们还注意到,在相同条件下培养的hThOs在长期培养期间可以发展出边缘富集的轴突束,而在hThOs中, 轴突束并不像hmSpVOs那样与MAP2+区域均匀分离(图3F和3H)。
我们接下来在两个阶段(第30天和第62天)的样本中进行了伪时间分析,以了解hmSpVOs中不同细胞类型的发育轨迹。我们发现NPC组到InN和ExN组之间有明显的早期到晚期的过渡(图2I和S3K)。RNA速度分析揭示了不同细胞类型之间相似的发育关系(图S3K)。有趣的是,尽管NPC和IP如预期般显示出最早的发生,InN在hmSpVOs中的发生却早于ExN(图2J)。在不同推断状态下的基因表达分析也揭示了三个主要簇,其中与祖细胞相关的基因如VIM、SOX2和PAX7显示出最早的发生并随时间减少;第一个簇之后是定义躯体感觉命运的基因簇,如LBX1,以及对抑制性神经发生至关重要的基因,如LHX1和LHX5;对兴奋性神经发生的关键调节因子,如TLX3和POU4F1,则在最新的簇中开始表达(图2K)。基本转录因子与相应基因之间的相关性
在这种情况下,长期培养的hmSpVOs在NF+轴突中含有丰富的突触前囊泡蛋白突触素(SYP)(图S4B)。病毒标记结合对突触后蛋白突触后密度95(PSD95)的染色和
图3. 的结构和功能发展 (A和B) 在hmSpVOs中对NF和LMX1B的免疫染色 (A),NF和PAX2的免疫染色 。 (C) 从不同hPSC系衍生的hmSpVOs中PAX2+和LMX1B+细胞的定量 (>天120)。数据表示均值 标准差 9和9个器官样本,分别来自3批H9 hESC-、H1 hESC-、RC01001A hiPSC衍生的hmSpVOs;每个器官样本量化了1-2个随机切片)。使用ANOVA进行多重比较分析进行统计分析。 (D) 对长期培养的hmSpVOs进行NF和MAP2的免疫染色。箭头显示包含合并的NF+轴突但缺乏MAP2+树突的区域。Tr,脊髓三叉神经束。 (E) 在长期培养的hmSpVOs中对NF和MAP2的免疫染色。 (F) 在不同发育阶段的hmSpVOs和hThOs中对NF和MAP2的免疫染色。 (G) 在不同阶段的hmSpVOs中边缘轴束宽度的定量 (60-80天和超过120天)。数据表示均值 标准差 个器官样本,来自3批H9 hESC衍生的hmSpVOs)。使用未配对双尾Student's t检验进行比较。 。
在从hmSpVOs中培养的细胞中,抑制性突触后蛋白gephyrin的存在表明分化神经元中突触的发展(图3I和3J)。除了神经元,hmSpVOs中还产生了大量GFAP+星形胶质细胞,这些细胞与NF+神经过程紧密交织在一起(图S4C)。通过对S100b的共染色进一步验证了GFAP+细胞的星形胶质细胞身份(图3K)。我们还注意到,星形胶质细胞的产生仅在较长的培养后发生(例如, 个月),这与我们对早期样本的scRNA-seq分析中缺乏星形胶质细胞的结果一致,并反映出在大脑发育过程中,神经发生优先于胶质发生的事实。
为了评估hmSpVOs的电生理活动,我们使用多电极阵列(MEA)系统进行了细胞外记录(图3L)。尽管MEA记录了5个月大hmSpVOs的自发电活动,但用GABA受体激动剂(美克洛尔,GABA A受体激动剂;R-巴氯芬,GABA B受体激动剂)或谷氨酸受体拮抗剂(AP5,N-甲基-D-天冬氨酸[NMDA]受体;CNQX,α -氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸[AMPA]/卡因酸受体)对hmSpVOs进行药理干预显著减少了尖峰事件;相反,使用双氟氯噻吨阻断GABA能传递显著增加了尖峰事件(图3L和S4D),这表明hmSpVOs中存在GABA能和谷氨酸能神经传递。此外,考虑到大脑中的SpV神经元可以对来自外周感觉神经元释放的神经肽作出反应,我们用降钙素基因相关肽(CGRP)刺激hmSpVOs,这是一种参与感觉处理(包括痛觉)的关键神经肽。28 确实,MEA记录显示CGRP处理显著增加了hmSpVOs中的尖峰事件(图3M和S4E)。总体而言,这些结果表明hmSpVOs在发育过程中可以建立结构和功能的成熟。
通过将mCherry+ hmSpVO与未标记的hThO融合制备的hSTO的实时成像显示,hmSpVO细胞向hThO区域投射mCherry+过程的强大投影(图4B)。之前,我们将hThO与hCO融合,重现了丘脑投射到皮层区域的情况。12 为了理解hmSpVO与hThO之间的投影事件,我们将mCherry+ hmSpVO与GFP+ hThO融合。有趣的是,我们发现mCherry+ hmSpVO衍生的轴突投影束进入hThO的情况比G hThO衍生的投影束进入hmSpVO的情况更为明显,即使hmSpVO与hThO以不成比例的方式融合,即较大的hThO最终包裹了较小的hmSpVO;在这种情况下,来自hThO细胞到hmSpVO区域的GFP+投影束仍然不如mCherry+ hmSpVO到hThO的投影束明显(图S4G)。为了理解投影特征,我们包含了不同组合的类器官融合。融合类器官的冷冻切片和免疫染色再次显示,hmSpVO容易向hThO投射轴突束,这比向hCO投射更为强大;相反,hThO到hmSpVO方向的轴突聚合不如hmSpVO到hThO方向强大,这与hThO与hCO融合时的丘脑皮层投影不同(图4C和S4G)。12 我们在不同融合条件的冷冻切片中量化了轴突投影。结果显示(1)hmSpVO到hThO的投影在融合后随时间增加(图4D);(2)hmSpVO向hThO的投影事件在投影覆盖率和投影轴突束的最大宽度上显著高于向hCO的投影(图4D和4E);(3)尽管hThO显示出向hmSpVO的轴突生长,但聚合的轴突通路的大小显著小于hmSpVO到hThO的投影和hThO到hCO的投影(图4D和4E)。因此,轴突投影模式可能依赖于融合脑类器官中结合的神经组织类型。在体内,SpV与丘脑之间的神经回路主要由三叉丘脑束组成,而不是反之。25,29 我们的结果表明,在人类脑类器官模型中,SpV衍生的神经元表现出更强的倾向,将轴突聚合投射到结合的丘脑区域,而丘脑神经元投射到SpV区域的能力则较弱。
融合hmSpVOs和hThOs模型的三叉神经丘脑
投射
作为大脑中一个重要的感觉中继中心,SpV接收来自大脑外部的感觉信息,包括痛觉,并通过三叉神经丘脑束将信息传递给丘脑。因此, 的生成和我们之前建立的hThOs使得在体外构建这种特定于大脑核团的神经电路成为可能。为此,我们在气-液界面上融合了hmSpVO和hThO部分,以产生hSTOs(图4A)。为了便于可视化轴突投射,我们将一个普遍存在的mCherry或GFP表达盒插入hESCs的AAVS1位点(图S4F)。
除了hmSpVO来源的轴突在投射到丘脑侧时,靠近和远离融合边界的轴突聚集成束的典型特征(图4C、4F和S4G),我们还发现,在hThOs内部,hmSpVO来源的轴突可以形成明显排除胞体的投射通路(图S4H)。这些投射特征证实了我们的
图4. hSTOs模型中SpV与丘脑之间的连接 (A) 大脑中SpV与丘脑之间轴突连接的示意图(左上),与hSTOs构建连接的策略(左下),以及hSTOs的代表性明场图像(右)。 (B) 3D共聚焦活体成像显示在完整hSTO中mCherry+三叉神经丘脑投射。 (C) 冷冻切片样本的共聚焦成像显示不同融合组合中的轴突投射事件。 (D) 融合脑类器官中目标区域的荧光覆盖率的归一化百分比。hSTOs在融合后第18天和第32天进行了量化。对于其他融合,样本在融合后第32天进行了量化。数据表示均值 标准差(hmSpVO-to-hThO-D18: 个融合类器官;hmSpVO-to-hThO-D32: 个融合类器官;hThO-to-hmSpVO: 个融合类器官;hmSpVO-to-hCO: 个融合类器官,hThO-to-hCO: 个融合类器官;所有样本均来自3个批次,每个类器官量化了1-2个随机切片)。使用ANOVA进行多重比较分析。
观察到,当hmSpVO神经元单独培养时,倾向于在类器官边缘形成一个合并的轴突通路(图3D和3F),并且类似于体内脊髓三叉神经束的特征。27 除了大型投射束外, 投射的小分支也在hThOs内部形成(图S4I),这表明对丘脑细胞的强健神经支配。对SYP的免疫染色显示,在hThOs中,mCherry+来源于hmSpVO的投射含有 颗粒(图4G),表明在三叉丘脑靶向过程中存在突触发生。在hSTOs中,从SpV到丘脑侧的顺行追踪30显示,hThOs中的TCF7L2+丘脑神经元是hmSpVO神经元的后突触(图S4J)。此外,我们通过染色丘脑和SpV特异性标记物来检查hSTOs中脑区身份的维持。我们发现,在长期培养后,即类器官融合约1个月后,在hSTOs中,丘脑侧富含TCF7L2+丘脑细胞,而hmSpVO侧则富含PAX2+和LMX1B+ SpV细胞(图4H)。这些结果表明,hSTOs在发育过程中可以维持两种不同的脑区特异性身份。
被微注射到hThOs或hmSpVOs中。我们发现hThO到hmSpVO的追踪与hmSpVO到hThO的追踪相比,产生了显著更多的GFP+细胞(图4N),再次验证了轴突投射通路偏向三叉神经丘脑而非丘脑三叉神经(图4C– 4F和S4G)。为了进一步了解hmSpVOs和hThOs中的神经元是否建立了轴突投射,我们将AAV1-hSyn-ChrimsonR-tdTomato微注射到hSTOs的SpV侧,以在SpV神经元中表达光敏感的视紫红质ChrimsonR。随后在hSTOs的丘脑侧进行了光遗传学和钙成像(图4O和S4K)。施加561-nm光可以在hThOs的丘脑神经元中引发钙反应(图4P、4Q和S4L)。我们还应用了高密度3D MEA(HD-MEA),通过微米级电极(每个电极大小为 ,2个相邻电极作为正极,2个作为负极,相隔一个电极)在hSTOs的SpV区域局部引入电刺激(图S4M)。对丘脑侧的分析显示,SpV细胞的电刺激在丘脑区域引发了电尖峰(图S4N和S4O),进一步表明SpV与丘脑神经元之间的连接。综合来看,我们的结果表明,通过融合hmSpVO和hThO,可以在体外重现人类SpV与丘脑之间的三叉神经丘脑连接。
为了进一步研究hSTOs中SpV与丘脑细胞之间的联系,我们使用rAAV2-retro变体进行了逆行追踪。31 将rAAV2-retro-hSyn-EGFP载体微注射到丘脑区域,能够轻松追踪到hmSpVO侧的细胞(图4I)。逆行标记的GFP+ hmSpVO细胞主要表达神经元标记物MAP2,而不表达星形胶质细胞标记物GFAP(图4J)。投射到hThO的主要神经元群体是vGLUT2+ ExNs(占GFP+细胞的 ),而不是PAX2+ InNs(占GFP+细胞的 )(图4K和4L)。这些结果与体内观察一致,即三叉神经丘脑投射主要来源于vGLUT 神经元。25 值得注意的是,逆行追踪不仅标记了远离载体注射位点的hmSpVO细胞,还追踪了hThOs内部汇聚的hmSpVO来源的mCherry+轴突通路(图4M)。此外,我们量化了使用rAAV2-retro-hSyn-EGFP载体逆行追踪的细胞。
讨论
尽管无指导的脑类器官、指导的区域特异性脑类器官和组装体在过去十年中迅速发展,但构建具有核特异性分辨率的脑类器官仍然在很大程度上未被探索。开发具有核特异性身份的区域特异性脑类器官对于以更精细的分辨率进行人脑建模至关重要。16 后脑的髓质包含不同的核,这些核对维持重要的身体功能至关重要,包括各种感官和运动功能。
功能和自主功能,如呼吸、心跳和血压。对延髓的损伤会导致身体功能的严重障碍。19 尽管其重要性,缺乏能够模拟人类延髓的脑类器官模型,特别是重现延髓的特定亚结构。在这里,我们专注于延髓的脊髓后角(SpV),这是一个重要的痛觉中继中心。尽管SpV的异常与几种神经疾病高度相关,如三叉神经痛,32–34但人类的SpV及相关神经回路模型尚不可用。我们建立了一个针对延髓背侧区域的特定区域脑类器官模型。重要的是,我们的类器官展示了SpV特异性的特征。我们的研究为在体外研究延髓SpV的发展及相关脑部疾病提供了机会。
与我们为各种其他区域特异性脑类器官建立的完整悬浮培养不同8,11–13,在这里我们应用了气-液界面的切片类器官培养35,以便长期发展hmSpVOs。在这种策略下,hmSpVOs在几个月的培养中表现出神经发生和星形胶质细胞发生,值得注意的是,表现出轴突过程的聚合模式,可能是体内脊髓三叉神经束的回忆27。由于脑核样组织特征可能需要长期发展,我们预计这种气-液界面培养策略在生成其他类型的脑核特异性类器官时也会有益。
我们还建立了一个系统,通过融合hmSpVO和hThO来建模人类髓质SpV与丘脑之间的连接。区域特异性的脑类器官使得不同神经系统区域之间的相互作用建模成为可能。6–10,12 然而,脑核特异性神经电路的建模更具挑战性,目前尚未报告此类模型。如这里所示,具有核特异性身份的脑类器官可以被利用来在培养皿中重现与人类脑核相关的神经电路。偏向于hmSpVO到hThO的投射,而不是反向投射,暗示了在三叉神经丘脑束发育过程中可能存在的内在调控机制,这值得进一步研究。总体而言,我们预见到一个宝贵的机会,可以利用精确引导的核特异性人类脑类器官来建模人类脑核及相关神经电路。
研究的局限性
在本研究中,对亚核相关特征(例如,Vo、Vi 和 Vc)的理解有限。未来需要在单细胞水平上分析人类 ,以展示人脑的亚核相关特征,并指导体外脑类器官生产的设计。此外,对人类发育中的 进行单细胞水平的研究将有助于提高对类器官中细胞类型的理解,特别是未成熟细胞(例如,NPC 和 IP)。此外,目前在 hSTOs 中的功能分析有限。需要更多的功能研究,以了解在融合模型中形成的 和丘脑细胞之间神经回路的功能性,以及三叉丘脑连接对两个区域功能成熟的潜在影响。此外,考虑到 SpV在将感觉信息(包括痛觉)传递到丘脑和其他高级脑结构中的作用,
在未来的研究中,使用该系统对相关的发展或疾病进行建模是重要的。
资源可用性
¶ 主要联系人
进一步的信息和资源及试剂的请求应直接联系并由主要联系人向飞向(xiangyf shanghaitech.edu.cn)满足。
材料可用性本研究未生成新的独特试剂。
数据和代码可用性
测序数据已存入基因表达综合数据库(GEO: GSE251680),并在出版时公开可用。本文分析的已发布数据集的获取编号列在关键资源表中。本研究不报告原始算法。任何重新分析本文报告的数据所需的额外信息可根据请求从主要联系人处获得。
¶ 致谢
本研究部分得到了中国国家重点研发计划(2021YFF1200800)、中国国家自然科学基金(32170836)、中国中央地方科技发展指导基金(YDZX20233100001002)、上海科技大学生物大分子与精准医学前沿科学中心、上海浦江计划(20PJ1410400)以及上海科技大学启动基金的支持。我们感谢上海科技大学生命科学与技术学院分子成像核心和分子与细胞生物学核心的设施支持。上海科技大学的高性能计算平台支持了计算工作。我们感谢上海科技大学的魏申实验室提供试剂,以及上海科技大学的季虎实验室协助神经功能记录。我们还感谢蒙特利尔大学的田中义明协助数据分析。
¶ 作者贡献
W.P.、J.Z. 和 Y.X. 构思了项目并设计了实验。W.P. 进行了类器官分化和表征实验。J.Z. 进行了测序数据的分析。W.Z. 和 L.J. 分别协助进行了类器官分化和免疫染色。X. Zhuang、Y.L.、J.W.、X.L.、Y.Y. 和 Z.C. 进行了细胞培养和相关实验。W.P.、K.Y. 和 X. Zhu 进行了类器官的功能记录。W.P.、J.Z. 和 Y.X. 准备了手稿。
利益声明
作者声明没有竞争利益。
¶ 星级 方法
本文的在线版本提供了详细的方法,包括以下内容:
d 关键资源表 d 实验模型和研究参与者详情 细胞系 方法详情 BhmSpVOs 的生成 hCOs 和 hThOs 的生成 气-液界面培养 hSTOs 的生成 基因组编辑 免疫荧光染色 实时定量 PCR (qPCR)
B 大规模RNA测序和数据处理 单细胞RNA测序和数据处理 逆行标记 前行追踪 光遗传学刺激和钙成像 MEA测定 电刺激和记录
d 量化与统计分析B细胞数量定量 B 边缘轴突束宽度定量 B投影定量
补充信息
补充信息可以在网上找到,网址为 https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.08.004。
收到:2024年1月10日 修订:2024年6月16日 接受:2024年8月8日 发布:2024年8月28日
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星际+方法
关键资源表
| REAGENTorRESOURCE | SOURCE | IDENTIFIER |
| Antibodies | ||
| synaptophysin | Abcam | Cat#ab8049;RRID:AB_2198854 |
| SOX2 | Cell signaling | Cat#3579;RRID:AB_2195767 |
| MAP2 | Millipore | Cat#MAB3418;RRID:AB_11212326 |
| MAP2 | Abcam | Cat#ab183830;RRID:AB_2895301 |
| Neurofilament | Abcam | Cat#ab7795;RRID:AB_306084 |
| Neurofilament | Millipore | Cat#AB1989,RRID:AB_91202 |
| GFAP | Invitrogen | Cat#130300;RRID:AB_86543 |
| S-100β | Sigma-merck | Cat#S2532;RRID:AB_477499 |
| NKX2-2 | Abcam | Cat#ab191077;RRID:AB_2811076 |
| NKX6-1 | Abcam | Cat#ab221549;RRID:AB_2754979 |
| PAX7 | Abcam | Cat#ab92317;RRID:AB_10561454 |
| LBX1 | Invitrogen | Cat#PA564884;RRID:AB_2662958 |
| LMX1B | Sigma-Aldrich | Cat#HPA073716;RRID:AB_2686630 |
| PAX2 | Abcam | Cat#ab150391;RRID:AB_3065222 |
| LHX1/5 | Developmental Studies | Cat#4F2;RRID:AB_531784 |
| TCF7L2 | Hybridoma Bank Cell Signaling | Cat#2569T;RRID:AB_2199816 |
| TBR1 | Abcam | Cat#ab31940;RRID:AB_2200219 |
| GABA | Sigma-merck | Cat#A0310;RRID:AB_476667 |
| Gephyrin | Santa Cruz | Cat#sC-25311;RRID:AB_627670 |
| PHOX2B | Santa Cruz | Cat#SC-376997;RRID:AB_2813765 |
| SOX10 | R&D | Cat#MAB2864;RRID:AB_2195180 |
| OLIG3 | R&D | Cat#MAB2456;RRID:AB_2157678 |
| VGLUT2 | ||
| PSD95 | Millipore | Cat#MAB5504;RRID:AB_2187552 |
| Bacterial andvirusstrains | Santa Cruz | Cat#sC-32290;RRID:AB_628114 |
| pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE | ||
| pAAV-hSyn-EGFP-3XFLAG-WPREretrogradetracervirus | OBiO OBiO | https://www.obiosh.com/ https://www.obiosh.com/ |
| rAAV2/1-hSyn-Cre-WPRE-hGH polyA | BrainVTA | Cat# PT-0136 |
| rAAV2/9-EF1a-DIO-EGFP-WPRE-hGH polyA | BrainVTA | Cat#PT-0795 |
| rAAV2/1-hSyn-ChrimsonR-tdTomato-WPRE-hGHpolyA | ||
| Chemicals,peptides, and recombinant proteins | BrainVTA | Cat# PT-1432 |
| mTeSR Plus | ||
| DMEM-F12 | Stem Cell Technologies Life Technologies | Cat# 100-0276 Cat#C11330500BT |
| Neurobasal Media | Life Technologies | Cat#21103049 |
| BrainPhysNeuronal Medium | stemcell | Cat#05790 |
| KNOCKOUT(TM) SR | invitrogen | Cat#10828028 |
| Accutase | Stem Cell Technologies | Cat# 07920 |
| Amino acids, non-essential | Life Technologies | Cat# 11140050 |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | Cat# 15140122 |
| Glutamax | Life Technologies | Ca# 35050061 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | Ca# M3148 |
| N2 | Life Technologies | Cat# 17502048 |
| B27(-VA) | invitrogen | Cat#12587010 |
Continued
| REAGENTorRESOURCE | SOURCE | IDENTIFIER |
| D- (+)-Glucose solution (45% H2O) | Sigma-Aldrich | Cat# G8769 |
| B27 | Life Technologies | Cat# 17504044 |
| Insulin | Beyotime | Cat#P3376 |
| EGF | novoprotein | Cat#C029B |
| Retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | Cat#R2625 |
| NGF | novoprotein | Cat#C060 |
| Matrigel | BD | Cat# 354230 |
| Y-27632 | MCE | Cat# HY-10583 |
| LDN193189 | MCE | Cat#HY-12071A |
| SB431542 | Abcam | Cat# ab120163 |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | Cat# 72054 |
| XAV939 | Sigma-Aldrich | Cat#X3004 |
| PD325901 | Selleck | Cat#S1036 |
| Purmorphamine | stemcell | Cat#D204 |
| BMP4 | Abcam | Cat# ab238298 |
| SHH | R&D | Cat# 464-SH-200 |
| BDNF | novoprotein | Cat# C076 |
| Bucladesine sodium | MCE | Cat#HY-B0764 |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | Cat# A92902 |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | Cat#4583 |
| Bovine serum albumin | Sangong | Cat#A500023-0100 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T8787 |
| DAPI | Solarbio | Cat# C0065 |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | Cat# A9414 |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher | Cat#P36930 |
| Muscimol | MCE | Cat#HY-N2313 |
| (R)-Baclofen | MCE | Cat# HY-17354 |
| Bicuculline | MCE | Cat# HY-N0219 |
| D-AP5 | MCE | Cat# HY-100714A |
| CNQX disodium salt | Tocris | Cat# 1045 |
| α-CGRP (human) | MCE | Cat# HY-P1071 |
| Cal-520 | ||
| powerload | AAT Bioquest | Cat#21130 |
| Critical commercial assays | Invitrogen | Cat#P10020 |
| FastPureCell/TissueTotal RNA IsolationKit | Vazyme | |
| HiScript Ill All-in-one RT SuperMix Perfect | Vazyme | Cat# RC101 Cat#R333 |
| Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Cat# Q712 |
| RapiClear | Sunjin lab | Cat#RC152001 |
| Deposited data | ||
| Raw and processed RNA-seq and scRNA-seq | This paper | GEO:GSE251680 |
| RNA-seq for hESC and hCO and scRNA-seq for hCO | Xiang et al.8 | GEO:GSE97882 |
| scRNA-seq for hThO | Xiang et al. 12 | GEO:GSE122342 |
| Reference transcriptome GRCh38 | 10X genomics | https://support.10xgenomics.com/ |
| Microarray dataset for human medulla | Allen brain | https://human.brain-map.org/ |
| scRNA-seq for developing human brain | Braun et al.23 | https://github.com/linnarsson-lab/ developing-human-brain/ |
Experimental models: Cell lines
| Continued | IDENTIFIER | |
| REAGENTorRESOURCE H1 hESC line | SOURCE WiCell | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ |
| pubmed/9804556/ | ||
| hiPSCs RC01001A line | Nuwacell | https://www.nuwacell.com/ |
| hiPSCRC01001Bline | Nuwacell | https://www.nuwacell.com/ |
| H9-AAVS1-CAG-GFP hESC line | This paper | N/A |
| H9-AAVS1-CAG-mCherry hESC line | This paper N/A | |
| RecombinantDNA and virus | ||
| AAVS1-TALEN-L | Gonzalez et al. 36 | Addgene # 59025 |
| AAVS1-TALEN-R | Gonzalez et al. 36 | Addgene #59026 |
| AAVS1-CAG-hrGFP | Qian et al.37 | Addgene # 52344 |
| AAVS1-CAG-mCherry | Chen et al.38 | Addgene # 80946 |
| Software and algorithms | ||
| Maestro pro MEA system | Axion Biosystems | https://www.axionbiosystems.com/ |
| Plexon Offline Sorter | Plexon | https://plexon.com/products/offline-sorter/ |
| AxIS Navigator | Axion Biosystems | https://www.axionbiosystems.com/ |
| Neural Metric Tool | Axion Biosystems | https://www.axionbiosystems.com/ |
| Fiji | N/A | https://fiji.sc |
| BioCAM DupleX | 3Brain | https://www.3brain.com/products/ single-wel/biocam-duplex |
| Brainwave5 | 3Brain | https://www.3brain.com/products/ |
| nf-core/rnaseq pipeline (v3.13.2) | N/A | software/brainwave5 https://github.com/nf-core/rnaseq |
| STAR (v2.7.10a) | N/A | https://github.com/alexdobin/STAR |
| RSEM (V1.3.1) | N/A | https://github.com/deweylab/RSEM |
| GSVA (1.44.5) | N/A | https://github.com/rcastelo/GSVA |
| Voxhunt (v 1.0.1) | Fleck et al.24 | https://github.com/quadbio/VoxHunt |
| Cell Ranger (v6.1.2) | N/A | https://www.10xgenomics.com/support/ |
| Seurat (v 4.3.0) | Hao et al.39 | software/cell-ranger https://satijalab.org/seurat/ |
| DoubletFinder (v 2.0.3) | McGinnis et al.40 | https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/ |
| SeuratWrappers (v 0.3.1) | DoubletFinder | |
| AUCell (v 1.18.1) | N/A N/A | https://github.com/satijalab/seurat-wrappers https://github.com/aertslab/AUCell |
| SCENIC (v 1.3.1) | Sande et al.41 | https://github.com/aertslab/SCENIC |
| Harmony (v 0.1.1) | Korsunsky et al.42 | https://github.com/immunogenomics/harmony |
| scvelo (v0.2.5) | Bergen et al.43 | https://github.com/theislab/scvelo |
| Other | ||
| Orbital shaker | ||
| Nucleofector | IKA | KS260 |
| Lonza | AAB-1001 | |
| Micropipette Puller | RWD | MP-500 |
| Glass microelectrode injection pump | RWD | R480 |
| U-bottom ultra-low-attachment 96-well plate | Corning | CLS7007-24EA |
| Tissue Culture Plate Insert 3.0um | BIOFIL | TCS002006 |
| Ultra-low-attachment 6-well plate | BIOFIL | TCP030006 |
| CytoView MEA plate (six-well) | Axion Biosystems | M384-tMEA-6W |
¶ 实验模型和研究参与者详情
LS
¶ 细胞系
女性H9人胚胎干细胞(hESCs)、男性H1人胚胎干细胞(hESCs)、男性高诱导多能干细胞(hiPSCs)RC01001A、女性高诱导多能干细胞(hiPSC)RC01001B,以及所有来自基因组操作的衍生克隆(H9-AAVS1-CAG-GFP hESCs和H9-AAVS1-CAG-mCherry hESCs)在涂有Matrigel的组织培养基上培养。
在湿度控制的 培养箱中,使用含有mTeSR的培养基,二氧化碳浓度为 。hESC系H9和H1可从WiCell公司获得,hiPSC系RC01001A和RC01001B可从Nuwacell公司获得(见关键资源表)。RC01001A和RC01001B分别来源于一名36岁男性的外周血单核细胞和一名新生女性的脐带细胞,通过仙台病毒载体介导的重编程获得。H9-AAVS1-CAG-GFP hESCs和H9-AAVS1-CAG-mCherry hESCs的身份可以通过CAG启动子驱动的GFP和mCherry蛋白的持续表达进行验证。hPSCs每4-5天传代一次,使用 EDTA处理( )。所有涉及hESCs和hiPSCs的实验均已获得上海科技大学研究伦理委员会的批准。
¶ 方法细节
hmSpVOs的生成
在第0天,去饲养的hESC克隆通过使用Accutase处理10分钟被解离为单个细胞。单个细胞重新悬浮在诱导培养基中(DMEM-F12,15 (v/v)KSR, (v/v)MEM-NEAA, (v/v)Glutamax和 -巯基乙醇),并添加 LDN193189, SB431542, CHIR99021和 Y27632,接着被接种到超低附着的96孔板中(1500个细胞/孔)。在第2天,所有培养基被更换为添加了 LDN193189,10 mM SB431542, CHIR99021和 视黄酸(RA)的诱导培养基。在第4天和第6天,补充上述培养基。在第8天,类器官被转移到超低附着的6孔板中进行旋转培养( )(8-12个类器官/孔)。培养基更换为分化培养基(DMEM-F12和神经基础培养基的1:1混合物, (v/v)N2补充剂, (v/v)B27补充剂, (v/v)MEM-NEAA, (v/v)Glutamax, 胰岛素, -巯基乙醇和 (v/v)青霉素/链霉素),并添加 CHIR99021, EGF和 GF。培养基每隔一天更换一次。在第12天和第14天,添加溶解的Matrigel( ,v/v)。从第16天开始,使用添加了 BDNF和 抗坏血酸的分化培养基(DMEM-F12和神经基础培养基的1:1混合物, (v/v)N2补充剂, (v/v)B27补充剂, (v/v)MEM-NEAA, (v/v)Glutamax, 胰岛素, -巯基乙醇和 (v/v)青霉素/链霉素)。在第30天之前,每隔一天更换一次培养基,此后每四天更换一次。
hCOs和hThOs的生成
hCOs 和 hThOs 的生成如前所述。8,12 简而言之,对于 的生成,从 hESCs 中获得的单细胞悬液被接种到超低附着的 96 孔板中(9000 个细胞/孔),使用诱导培养基(DMEM-F12, (v/v) KSR, (v/v) MEM-NEAA, (v/v) Glutamax 和 -巯基乙醇),并补充 LDN193189, SB431542,2 mM XAV939 和 。上述培养基每隔一天更换一次,直到第 10 天(在第 4 天,移除 Y27632)。从第 10 天开始,类器官被转移到超低附着的 6 孔板中进行旋转培养( )(每孔 6-8 个类器官)。从第 10 天到第 18 天,使用不含维生素 A 的分化培养基(DMEM-F12 和神经基础培养基的 1:1 混合物, (v/v) N2 补充剂, (v/v) B27 补充剂减去维生素 A, (v/v) MEM-NEAA, (v/v) Glutamax, 胰岛素, b-巯基乙醇和 (v/v)青霉素/链霉素)(培养基每隔一天更换一次)。从第 18 天起,使用含有维生素 A 的分化培养基(DMEM-F12 和神经基础培养基的1:1 混合物, (v/v) N2 补充剂, (v/v) B27 补充剂, (v/v) MEM-NEAA, (v/v) Glutamax, 胰岛素, -巯基乙醇和 (v/v) 青霉素/链霉素),并补充 BDNF 和 抗坏血酸(在第 25 天之前每隔一天更换培养基,此后每四天更换一次)。
对于hThOs的生成,来自hESC的单细胞悬液被接种到超低附着力的96孔板中(每孔20000个细胞),使用诱导培养基(DMEM-F12, (v/v)KSR, (v/v)MEM-NEAA, (v/v)Glutamax和 -巯基乙醇),并补充 LDN193189, 431542, 胰岛素和 。上述培养基每隔一天更换一次,直到第8天(在第4天,移除了Y27632)。在第8天,类器官被转移到超低附着力的6孔板中进行旋转培养( )(每孔8-12个类器官)。从第8天到第16天,使用图案化培养基(DMEM-F12, (w/v)葡萄糖, -巯基乙醇, (v/v)N2补充剂和 (v/v)B27补充剂减去维生素A),并补充 BMP7和1 mM PD325901(培养基每隔一天更换一次)。从第16天开始,使用分化培养基(DMEM-F12和神经基础培养基的1:1混合物, (v/v)N2补充剂, (v/v)B27补充剂, (v/v)MEM-NEAA, (v/v)Glutamax, 胰岛素, -巯基乙醇和 (v/v)青霉素/链霉素),并补充 BDNF和 抗坏血酸。培养基在第25天之前每隔一天更换一次,此后每四天更换一次。
¶ 气-液界面培养
对于气-液界面的培养,在第25-30天,使用切割的塑料移液管尖端轻柔地收集 ,避免干扰类器官结构,并将其嵌入 低凝胶温度琼脂糖的嵌入模具中。通常,每个模具嵌入3-6个 。含有类器官的琼脂糖块使用振动切片机在13 PBS(不含 和Mg2+)中切割。类器官切片(300微米厚)被转移到跨孔板(6孔格式)中的细胞培养插入物上。补充有 BDNF和 抗坏血酸的分化培养基(DMEM-F12和神经基础培养基的1:1混合物, (v/v)N2补充剂, (v/v)B27补充剂, (v/v)MEM-NEAA, (v/v)Glutamax, 胰岛素, -巯基乙醇和 (v/v)青霉素/链霉素)被添加并保持在培养插入物下方,以确保类器官切片保持在。
气液界面。类器官切片在静态培养中保持一天以恢复,然后转移到轨道摇床上进行长期培养,温度为 ,二氧化碳浓度为 。培养基每隔一天更换一次。
¶ hSTOs的生成
为了生成hSTOs,准备了第25-30天的hmSpVO和hThO,并按照上述方法制备了300毫米厚的类器官切片。将单个hmSpVO切片和单个hThO切片转移到6孔板的transwell插入物上,并相邻放置,以允许两个样本自发融合,称为hSTOs。添加分化培养基(如上述空气-液体培养中所述),并保持在transwell插入物下方,以在空气-液体界面建立培养,并避免类器官切片的移动。新制备的hSTOs在不摇动的情况下孵育一天,然后转移到轨道摇床上,在 和 的条件下进行长期培养。培养基每隔一天更换一次。
¶ 基因组编辑
为了生成H9-AAVS1-CAG-GFP hESCs和H9-AAVS1-CAG-mCherry hESCs报告系, 个从H9 hESCs中解离的单细胞被电转染了1 mg的AAVS1-TALEN-L质粒、1 mg的AAVS1-TALEN-R质粒和 的供体质粒(AAVS1-CAG-GFP或AAVS1-CAG-mCherry质粒),然后接种到涂有Matrigel的培养板上。电转染后三天,细胞用嘌呤霉素处理1周,并再恢复 天。然后,挑选并扩增GFP+或mCherry+克隆。
¶ 免疫荧光染色
类器官在 PFA中于 固定1-2天,使用PBS洗涤3次(每次洗涤10分钟室温孵育),然后在 的 蔗糖溶液中孵育2天。随后,类器官在室温下与O.C.T化合物孵育15分钟,转移到组织基模具中,并嵌入O.C.T化合物。嵌入的类器官储存在- 或立即用于冷冻切片(30-50微米切片)。切片在室温下与 Triton-100孵育15分钟,使用 BSA/PBS在室温下封闭2小时,然后在 下与稀释在 BSA/PBS中的一抗孵育过夜。经过三次PBS洗涤后,切片在室温下与稀释在 BSA/PBS中的二抗孵育1小时,然后用PBS洗涤三次,使用DAPI染色15分钟,并进行封片。抗体列表在关键资源表中提供。
对于全挂染色,类器官使用RapiClear溶液处理。简而言之, PFA固定的类器官在 下用 PBST(PBS中的 Triton X-100)处理1天,然后用PBS洗涤三次(每次15分钟,室温)。样品保存在一个装满新鲜制备的封闭缓冲液( 正常山羊血清和 PBST(PBS中的 Triton-X100))的 管中,在 下放置1天。然后,类器官在一个装满封闭缓冲液的 管中与一抗在 下的摇床上孵育2天。洗涤三次PBS(每次1小时,室温)后,类器官在PBS中于 下过夜保存。接着,类器官在一个装满封闭缓冲液的 管中与二抗在 下孵育2天。经过三次PBS洗涤(每次1小时,室温)后,类器官在PBS中于 下过夜保存。再经过三次PBS洗涤(每次20分钟,室温)后,样品在一个装满DAPI溶液(在封闭缓冲液中1:1000稀释)的 管中于 下过夜孵育。经过三次PBS洗涤(每次1小时,室温)后,类器官被转移到玻璃皿的底部,并在室温下加入RapiClear,处理2-3小时。对于所有的免疫染色实验,荧光图像由尼康CSU-W1 Sora 2Camera显微镜捕获,并使用ImageJ软件进行分析。
实时定量PCR (qPCR)
每组的类器官被汇总在一起,使用FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒按照制造商的协议提取总RNA。使用HiScrip III全能RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒和 总RNA生成cDNA。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix在QuantStudioTM实时PCR系统中进行实时定量PCR。PCR循环条件如下: 下保持2分钟,随后进行40个两步循环, 下15秒和 下30秒。本研究中使用的引物列表见表 。
¶ 大规模RNA测序和数据处理
对于大规模RNA测序,收集了第30天的类器官。根据制造商的协议,使用FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒提取总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度和纯度。使用Agilent 2100生物分析仪和2100 RNA nano 6000检测试剂盒评估RNA样本的完整性。简而言之,对于样本C3、C4、C6和C9(hmSpVO_rep1),使用TruSeq Stranded mRNA LT样本制备试剂盒构建文库,并在Illumina HiSeq X Ten平台上进行测序。对于hmSpVO_rep2和hmSpVO_ventr样本,使用TIANSeq mRNA捕获试剂盒准备mRNA,并使用TIANSeqFast RNA文库试剂盒构建文库。文库在Illumina NovaSeq 6000上进行测序。
清洁读取通过使用STAR 与参考基因组(GRCh38)对齐,RSEM 用于计算映射到每个基因的读取数,并计算每百万映射读取的外显子模型每千碱基转录本数(TPM)。我们通过nf-core/rnaseq管道v3.13.2.46实现了这一点。hESC和hCO的原始数据以相同方式处理。使用单样本GSEA方法47进行转录组相似性分析,使用GSVA(v 1.44.5)R包,富集分数进行了最小-最大缩放以便于可视化。背侧和腹侧富集分数的标准化差异被视为背侧特征分数。组织特异性基因列表来自GTEx数据库。48 大脑区域特异性基因
签名是从由voxhunt包(v 1.0.1)24计算的前20个基因中获得的,髓质区域特异性基因则来自对延髓分子特征的综述。19 所有基因列表均在表S3中提供。
¶ scRNA-seq 和数据处理
对于单细胞RNA测序,收集了第30天和第62天的hmSpVO,并将其解离为单个细胞。简而言之,将6-8个相同阶段的hmSpVO汇集在一起。离心后以500 g离心5分钟去除培养基,然后加入1 ml的dispase;用剪刀轻轻切割类器官,并在 的金属浴中消化30分钟。悬浮液在 下离心5分钟以去除上清液,然后加入 胰蛋白酶,在 下继续消化15-30分钟。当完全消化后,细胞通过 筛网过滤,并用DPBS BSA洗涤2-3次以进行后续实验。为了质量控制,细胞活力应高于 。细胞以每毫升1,000个细胞的浓度加载到10X Chromium单细胞平台(10X Genomics)上(单细胞30文库V3),按照制造商的协议进行操作。根据要收集的细胞数量构建GEMs(乳液中的凝胶珠)以进行单细胞分离。在GEMs形成后,收集GEMs在PCR机中进行逆转录以进行标记。然后,对GEMs进行油处理,扩增的cDNA通过磁珠纯化,然后进行cDNA扩增和质量检测。使用质量合格的cDNA构建3ʹ基因表达文库。经过片段化、接头连接、样本索引PCR等步骤后,文库经过定量检查,并在Illumina Novaseq 6000仪器上使用150碱基对的双端测序进行测序。
为了获得计数矩阵,使用默认参数的Cell Ranger (v 6.1.2) 将读取数据比对到人类基因组GRCh38 (v 3.0.0,由10X基因组提供)。下游分析使用R包Seurat (v 4.3.0)进行。39 为了进行质量控制,保留检测到的基因在500到5000之间、UMI计数在4000到20000之间以及线粒体基因的比例<在 以下的细胞作为高质量细胞。使用DoubletFinder 检测并去除双重细胞。计数通过该细胞的总表达进行标准化,乘以10000的缩放因子,并进行对数转换,然后检测到前2000个高变基因(Seurat中的NormalizeData和FindVariableFeatures函数)。
对于数据整合和注释,使用SeuratWrappers包中的MNN方法49去除了批次效应(版本0.3.1)。在对基因表达进行缩放和降维后,我们使用统一流形近似和投影(UMAP)嵌入可视化细胞。使用前20个维度来识别细胞的邻居和分辨率为1的簇。簇注释使用典型标记进行标记。我们首先根据神经标记(STMN和DCX)和早期神经发生标记(SOX2和NES)的表达对神经和非神经簇进行分类,如前所定义的8,12。然后,非神经簇被分为神经祖细胞(NPC)簇(表达SOX2)和中间祖细胞(IP)簇(表达NHLH1和INA50)。神经簇被分为兴奋性神经元簇(ExN,表达SLC17A6)、抑制性神经元簇(InN,表达GAD1、GAD2和SLC32A1)以及未成熟神经元簇(IM,不表达神经类型特异性标记)。
我们使用Seurat中实现的基于锚点的标签转移,将转录组相似性与已发布的人类大脑发育(妊娠后5-14周(pcw))scRNA-seq数据23进行了比较。为此,我们首先随机选择了100k个细胞,并使用IntegrateData函数将每个供体作为批次因子进行整合,以便于参考数据集。然后,使用FindTransferAnchors函数在查询数据集和参考数据集之间识别并过滤锚点,选取前30个维度。接着,使用TransferData函数计算预测分数。细胞类型和区域相似性(定义为每个细胞类型的平均预测分数)通过热图进行了可视化。我们进一步使用MapQuery函数将我们的数据投影到参考UMAP图上。
为了检查样本的区域身份,我们使用voxhunt R包对成熟神经元簇(ExN和InN)进行了无偏空间映射,然后在矢状面或条形图中绘制了脑区相似性。为了计算单细胞转录组与髓质背腹亚区的空间相关模式,我们使用AUCell包(v 1.18.1)计算每种细胞类型的富集分数,然后进行Z标准化以便可视化。
为了评估不同髓核的hmSpVOs的转录组相似性,我们使用上述相同的方法计算富集分数。选择了与其他核相比,前20个倍数变化和 的基因作为每个核的基因特征,使用了艾伦大脑人类脑微阵列数据集(https://human.brain-map.org)(年龄范围为24至57岁)(表S3)。来自同一核的左半球和右半球的数据被合并进行分析。为了理解潜在的亚核特异性特征,我们分析了Vo(MAFB和FN1)、Vi(IRX2、KCNG4、PDE1C和ZBTB16)和Vc(TAC1、BAIAP3、CAMK2A、CALB2和CALB1)的相对基因表达,正如Marn等人所报道的那样。基因表达经过最小-最大缩放的对数(每 计数)分别为ExN和InN绘制。
我们使用 monocle3 包 进行轨迹分析,采用默认参数,并选择 NPC 聚类作为根节点来排序细胞。不同细胞类型的伪时间的 Ridge 图是通过 ggridges (v 0.5.4) 包生成的。感兴趣基因的伪时间热图是使用 ClusterGVis (v 0.1.0) 包绘制的。我们还使用 scvelo (v 进行 RNA 速度分析,采用“ 随机” 模式下的 scv.tl.velocity 函数计算速度时间,以表示分化轨迹。
为了直接将hmSpVOs与其他特定区域的大脑类器官进行比较,我们整合了来自hCOs(晚期,72天和79天)8、hThOs(晚期,89天)12和hmSpVOs的单细胞RNA-seq数据,使用了harmony(v 0.1.1)42。在归一化后,使用前2000个可变特征来缩放数据并进行主成分分析(PCA)。类器官数据集基于前20个主成分使用默认参数的RunHarmony()函数进行整合,并使用前20个维度来识别细胞和簇的邻居,分辨率为1.8。神经元和非神经元簇的定义如上所述。接下来,我们
专注于神经元簇以进行进一步分析。标记阳性细胞比例被定义为标记基因计数 总神经元细胞。使用 Seurat 中的 FindMarkers() 函数进行差异分析,logfc.threshold 参数使用 wilcox 检验。具有 变化倍数 、调整后的 值 ,以及差异的绝对值 的基因被定义为具有统计学意义。
逆行标记
对于逆行追踪实验, 的 pAAV-hSyn-EGFP-3XFLAG-WPRE 逆行追踪病毒( )通过微注射注入到 hSTOs 的 hThO或 区域,使用 RWD R480 玻璃微电极注射泵和由 RWD MP-500 微量移液器拉制的玻璃微电极。微注射的 hSTOs 按照常规培养,三周后,可以在相应的未注射区域观察到 GFP 荧光。此时,收集 hSTOs 并进行免疫染色处理,量化 群体中 、G 、vGLUT2+ 和 细胞的数量。对于 hThO 到 的追踪,病毒注入到 hThO 区域,并对 区域进行量化;对于 到 hThO 的追踪,病毒注入到 区域,并对 hThO 区域进行量化。
顺行追踪
对于顺行追踪, 的rAAV2/1-hSyn-Cre-WPRE-hGH polyA病毒 )被注射到hmSpVO区域, 的rAAV2/9-EF1a-DIO-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒 )通过微注射注入到hSTOs的hThO区域,使用RWD R480玻璃微电极注射泵和由RWD MP-500微量移液器拉制的玻璃微电极。微注射的hSTOs按常规培养,三周后可以在hThO区域观察到GFP荧光。此时,收集hSTOs并进行免疫染色,量化GFP+群体中TCF7L2+细胞的数量。
¶ 光遗传学刺激与钙成像
对于光遗传刺激实验, 的rAAV2/1-hSyn-ChrimsonR-tdTomato-WPRE-hGH聚合病毒 )被注入hSTOs的hmSpVO区域。三周后,可以在hThO区域观察到表达tdTomato荧光的hmSpVO投射轴突。在钙成像之前,hSTOs在BrainPhys培养基(BrainPhys神经元培养基, (v/v)N2补充剂, (v/v)B27补充剂, BDNF, Bucladesine钠和 抗坏血酸)中培养至少两周。hSTOs在含有Cal-520( )和powerload(1:100)的BrainPhys培养基中,在放置于摇床上的 玻璃底板上的 盖玻片上孵育 , 30分钟,然后用新鲜的BrainPhys培养基更换培养液。在 , 下再孵育30分钟后,使用20X物镜记录钙变化,刺激hThOs中的ChrimsonR-tdTomato 投射轴突,使用 光源在尼康CSU-W1 Sora共聚焦显微镜下进行。刺激在远离 病毒注射部位的丘脑区域(hThOs)进行。在刺激前捕获hSyn-ChrimsonR-tdTomato和Cal-520的荧光信号,以确保刺激区域内没有ChrimsonR-tdTomato+丘脑细胞体。记录自发活动1分钟,然后刺激100毫秒并记录10秒(10个周期),最后以30秒的自发活动记录结束。使用Fiji/ImageJ分析单细胞钙涌动和deltaF/F值,以获取ROI的原始荧光强度随时间变化。使用GraphPad Prism应用Savitzky-Golay滤波器。作为对照,在钙成像之前添加了CNQX( )和AP5( )。
¶ MEA 检测
六孔板的微电极阵列用于检测电生理活动。在检测之前,hmSpVOs切片在BrainPhys培养基中于气-液界面培养超过两周。在记录当天,hmSpVOs切片从跨膜膜上刮下,转移到MEA板上,并去除培养基。然后,加入一滴(5毫升)Matrigel以覆盖切片。在 和 C 下孵育5分钟后,加入200毫升BrainPhys培养基以覆盖切片,随后将板子放回培养箱中1-2小时。然后可以进行电生理记录。记录使用Maestro pro MEA系统(Axion Biosystems)进行,数据根据制造商的自发神经配置使用AxIS Navigator(Axion Software)进行分析。使用神经度量工具(Axion Software)绘制电极阵列活动。尖峰检测阈值设置为六个标准差,采用自适应阈值交叉方法,尖峰爆发通过ISI阈值识别,要求至少有五个尖峰,最大ISI为100毫秒。对于化学处理,在添加Muscimol( )、R-baclofen( )、CNQX( )和AP5( )、Bicuculline( )或CGRP( )到培养基之前和之后记录活动。
¶ 电刺激与记录
hSTOs 被铺设在用半透明聚酯膜过滤器平整的 4096 通道高密度 3D 微电极阵列 (HD-MEA) 上。hSTOs 静置了 20 分钟。然后,使用 BioCam Duplex MEA 平台和 HD-MEA Accura 芯片 (3Brain GmbH, Lanquart, Switzerland) 进行记录。 区域 (红色) 的电极被选为电刺激。每个电极的面积为 。2 个相邻电极被用作刺激的正极,2 个用作负极。正极和负极之间由一个电极隔开。刺激持续时间为 ,强度为 。刺激进行了 10 次,每次间隔 10 秒。使用 BrainWave 5 软件。
分析数据。原始数据经过 的高通滤波器处理,随后进行尖峰检测和分类。在非荧光区域(即hThO区域)选择并分析放电电极数据。
¶ 量化与统计分析
数据以均值 或 SEM 的形式呈现。使用配对或非配对双尾学生T检验和ANOVA的多重比较分析来确定统计显著性(GraphPad Pris )。每个实验的统计检验和生物重复在图例和表S1中注明。统计显著性用星号表示: , , ,****p 。
¶ 细胞数量定量
在冷冻切片中,细胞数量是通过在ImageJ (Fiji)中使用Analyze Particles获得的。每个切片计算了四个随机区域的面积和细胞数量。然后,将总细胞数量除以总面积以获得细胞/面积的数量 )。每个类器官随机选择一到两个切片进行定量分析。
¶ 边缘轴突束宽度量化
在hmSpVOs中,边缘轴突束被定义为靠近类器官边缘的通路,富含缺乏MAP2+树突的 轴突。由于hThOs中的轴突束组织得不如hmSpVOs那样均匀(即,边缘 轴突束与MAP2+区域的分离不如hmSpVOs那样均匀),因此hThOs中的边缘轴突束被定义为富含NF+轴突的外周通路,无论MAP2+树突的存在与否。每个类器官的边缘轴突束宽度是在类器官的全挂染色中测量的。具体而言,它是通过在类器官周边的四个位置( /顶部, 右侧, 底部和 左侧)测量的轴突束宽度的平均值来计算的。
¶ 投影量化
轴突投影使用ImageJ(Fiji)进行定量分析。手动绘制感兴趣区域(ROI),以覆盖投影和目标类器官的区域,并对投影和目标类器官的面积进行定量。使用阈值调整,以包括目标类器官中荧光信号阳性区域。每个目标ROI区域的信号阳性区域百分比(PSAT)通过分析测量计算得出。然后,通过将PSAT除以投影类器官的面积,计算出归一化的荧光覆盖百分比( )。最大轴突束宽度使用ImageJ(Fiji)测量,通过手动测量切片中轴突束的最宽区域。每个类器官随机选择一到两个切片进行定量分析。