¶ 在CMOS集成高密度微电极阵列上记录和分析多模态大规模神经元群体动态
Brett Addison Emery*,1, Shahrukh Khanzada*,1, XinHu*,1 , Diana Klütsch1, Hayder Amin1,2,3
1 生物混合神经电子学 (BIONICS)" 组,德国神经退行性疾病中心 (DZNE)
2 德累斯顿工业大学卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯医学院
3 德累斯顿智能材料中心 (DCIM),德累斯顿工业大学 *这些作者贡献相同
¶ 摘要
大规模神经网络及其复杂的分布式微电路对于产生从时空神经活动模式中涌现的感知、认知和行为至关重要。这些从相互连接的神经元群体的功能组中涌现的动态模式促进了多尺度神经信息处理和编码的精确计算,从而推动了更高的脑功能。为了探究这种复杂性背后的神经动态计算原理,并研究生物过程在健康和疾病中的多尺度影响,大规模的同时记录已成为重要手段。在此,采用高密度微电极阵列(HD-MEA)研究两种神经动态模式——来自ex-vivo 小鼠脑切片的海马和嗅球电路,以及来自in-vitro人诱导多能干细胞(iPSCs)细胞培养的神经网络。HD-MEA平台拥有4096个微电极,能够以高时空分辨率同时进行数千个神经元群体的非侵入性、多点、无标记的细胞外放电模式记录。这种方法允许对多种电生理网络特征进行表征,包括单/多单位尖峰活动模式和局部场电位振荡。为了仔细分析这些多维神经数据,我们开发了多种计算工具,结合了机器学习算法、自动事件检测和分类、图论及其他高级分析。通过将这些计算流程与该平台相结合,我们提供了一种从细胞集合到网络研究大规模、多尺度和多模态动态的方法。这可能有助于推进我们对健康和疾病中复杂脑功能和认知过程的理解。对开放科学的承诺以及对大规模计算神经动态的洞察可能会推动这一领域的发展增强脑启发建模、神经形态计算和神经学习算法。此外,理解受损的大规模神经计算及其相互连接的微电路动态的基本机制,可能会导致特定生物标志物的识别,为神经系统疾病提供更准确的诊断工具和针对性治疗方法。
¶ 介绍
神经元群体,通常称为细胞集群,在神经编码中起着关键作用,促进了多尺度神经信息处理的复杂计算1,2,3。这些群体支撑了广泛神经网络及其细微微电路的形成4。这样的网络及其振荡模式推动了高级脑功能,包括感知和认知。尽管大量研究探讨了特定的神经元类型和突触通路,但对于神经元如何协同形成细胞集群并影响跨电路和网络的时空信息处理的深入理解仍然难以捉摸5。
急性 ex-vivo 脑切片是研究完整神经回路的重要电生理工具,提供了一个可控的环境来探测神经功能的振荡活动模式、突触传递和连接性,这在药理学测试和疾病建模中具有重要意义6,7,8。本研究协议重点介绍了两个关键的脑回路——参与学习和记忆过程的海马-皮质(HC)9,10,以及负责气味辨别的嗅球(OB)11,12,13。在这两个区域中,新的功能性神经元通过成年神经发生在哺乳动物大脑中终生持续生成14。两个回路都展示了多维动态神经活动模式和固有的可塑性,这些参与了重组现有神经网络,并在需要时促进替代信息处理策略15,16。
急性ex-vivo脑切片模型对于深入研究脑功能和理解微电路水平的疾病机制是不可或缺的。然而,in-vitro从人类诱导多能干细胞(iPSCs)衍生的细胞培养神经网络提供了一条有前景的转化研究途径,无缝连接动物实验的发现与潜在的人类临床治疗17,18。这些以人为中心的in-vitro检测作为评估药理毒性、实现精确药物筛选和推进创新细胞治疗策略研究的可靠平台19,20。认识到iPSC神经模型的关键作用,我们将本协议研究的第三个模块专门用于深入研究其衍生网络的功能特性,并微调相关的细胞培养协议。
这些电生理神经模块通常使用钙（Ca2+）成像、膜片钳记录和低密度微电极阵列(LD-MEA)等技术进行研究。虽然Ca2+成像提供了单细胞活动映射,但它是一种基于细胞标记的方法,受限于其低时间分辨率和长期记录的挑战。LD-MEA缺乏空间精度,而膜片钳作为一种侵入性单点技术,操作繁琐,通常成功率较低21,22,23。为了解决这些挑战并有效探测网络范围内的活动,大型-大规模同时神经记录已成为理解神经动力学计算原理及其在健康和疾病中的影响的关键方法。
在这个JoVE协议中,我们展示了一种基于高密度MEA(HD-MEA)的大规模神经记录方法,用于捕捉各种大脑模式下的时空神经活动,包括来自ex-vivo小鼠大脑急性切片的海马和嗅球回路(图1A-C)以及in-vitro人类iPSC衍生的神经网络(图1D-E),这些之前已由我们小组和其他同事报道26,27,28,29,30,31,32,33,34,35。HD-MEA基于互补金属氧化物半导体(CMOS)技术构建,具有片上电路和放大功能,允许在7mm²阵列大小上进行亚毫秒记录36。这种非侵入性方法使用4096个微电极以高时空分辨率同时捕捉数千个神经元群体的多点、无标记的细胞外放电模式,揭示局部场电位(LFPs)和多单元尖峰活动(MUA)的复杂动态26,29。
鉴于这种方法生成的数据量庞大,一个复杂的分析框架是必不可少的,但也带来了挑战37。我们开发了计算工具,涵盖自动事件检测、分类、图论、机器学习和其他高级技术(图1F)26,29,38,39。将HD-MEA与这些分析工具整合在一起,设计出一种整体方法,以探究从单个细胞组装到更广泛神经网络的复杂动态,跨越多种神经模式。这种结合的方法加深了我们对正常大脑功能中计算动态的理解,并提供了对异常的见解。
在病理状况下存在28。此外,这种方法的见解可以推动脑启发建模、神经形态计算和神经学习算法的进步。最终,这种方法有望揭示神经网络中断的核心机制,可能识别生物标志物,并指导创建精确的诊断工具和针对性治疗神经系统疾病
¶ 协议
所有实验均按照适用的欧洲和国家法规(Tierschutzgesetz)进行,并获得当地主管部门(萨克森州管理局;25-5131/476/14)的批准。
¶ 1. Ex-vivo 来自海马-皮层和嗅球电路的脑切片在 HD-MEA 上
¶ 1. 实验切割和记录溶液的准备(图2A)
¶ 1. 在实验当天,准备0.5 L高蔗糖切割液和1 L人工脑脊液(aCSF)记录液(表1A,B)。
¶ 1. 将所有固体化学品加入干燥的容量瓶中,然后用双蒸水(dd水)部分填充。
¶ 2. 从1 M储备溶液中加入MgCl2和CaCl2,然后用dd水填充剩余部分。开始用磁力搅拌器不断搅拌,直到可见固体溶解~5分钟。
¶ 2. 使用冰点渗透压计验证高渗透压在350-360 mOsm之间蔗糖切割液和315-325 mOsm的aCSF记录液。
¶ 3. 使用pH计验证高蔗糖切割溶液的pH值在7.3-7.4之间,aCSF记录溶液的pH值在7.25-7.35之间。开始持续通入 95% O2和5% CO2。
¶ 4. 将高蔗糖切割溶液放在冰上至少30分钟,然后开始持续通入 95% O2和5% CO2。
¶ 5. 在碳氧化10分钟后,用30 mL切割溶液填充一个50 mL烧杯,并将其存放在冰箱中（-20 °C）20-30分钟或直到部分冻结。注意:所有溶液应为每次实验新鲜制备。此处使用的dd水是储存在室温(RT)的高压灭菌超纯水。所制备的溶液量应根据具体的研究问题进行调整。
¶ 2. 准备脑切片工作区(图2A)
¶ 1. 将动物带入实验室。注意:在此方案中,使用了8-16周龄的C57BL/J6雌性小鼠,如之前所述26,29,32。动物在运输后应至少适应30分钟。应避免在实验当天进行长距离转移(即跨机构)。动物的年龄、性别和品系必须根据具体的研究问题来确定。
¶ 2. 当动物正在适应环境且高蔗糖溶液正在冷却时,将所需工具放置在每个指定的工作区(参见材料表)。
¶ 3. 准备脑片恢复和维护工作区。用碳氧合的aCSF记录溶液填充切片恢复室,并将其放置在设定为32°C的水浴中。在整个实验过程中保持持续的碳氧合。
¶ 4. 准备脑切片准备工作区。设置振动切片机 - 将刀片放入振动切片机刀片夹中,并校准振动切片机至正确的设置(刀片行进速度: 0.20 mm/s ,高度振幅: 95 µm ,刀片角度:45°)。在振动切片机的冰盘中装满冰,在缓冲盘中装满高蔗糖切割溶液,并开始对缓冲盘中的溶液进行碳氧合。
¶ 5. 准备大脑制备工作区。将 150mm 的玻璃培养皿装满冰,并在其中放置一个内有滤纸的 90mm塑料培养皿。将塑料培养皿装满高蔗糖切割溶液并开始通入碳氧混合气。向冷却的样品板上滴一滴强力胶,并固定琼脂糖模具。
注意：琼脂糖模具至少提前一天准备好，用3%的琼脂糖和水在定制的小鼠脑模具中制备。
¶ 6. 最后，准备脑提取工作区。用纸巾覆盖铝箔，取出一个装有高蔗糖切割溶液泥的50 mL烧杯，并在麻醉室中加入异氟醚。
注意：麻醉将在动物放置前1分钟加入麻醉室~。一个50mL的烧杯中装有30mL的高蔗糖切割溶液。-20 °C 冰箱中的泥浆将在斩首前 ~2 分钟取出。
¶ 3. 小鼠大脑的提取和切片
注意:整个过程应尽快进行,以避免大脑缺氧。从斩首到浸入高蔗糖切割溶液的过程,脑部移除应仅需1-2分钟
¶ 1. 使用适当剂量的异氟醚（0.5 mL/1 L 麻醉室）对动物进行麻醉。通过爪子捏测试确定麻醉深度；在继续操作之前，确认没有爪子缩回反射。
¶ 2. 将动物转移到脑提取工作区的纸巾上,并用手术剪刀将其斩首。
¶ 3. 将虹膜剪刀插入脑干,并保持剪刀底部与颅顶齐平。沿矢状缝切割,直到到达冠状缝。将虹膜剪刀放入眼窝,切开额缝。使用弯曲镊子将颅顶的两侧向下移动,暴露整个大脑。注意:使用虹膜剪刀和镊子时要小心,不要在切割缝合线时刺破大脑。
¶ 4. 用弯钳的钝边将大脑滑入装有30mL高蔗糖切割溶液冰泥的 50mL烧杯中。让其静置1分钟。
¶ 5. 将大脑转移到90毫米的塑料培养皿中,皿中装有冷却的碳氧化切割溶液,放置在大脑准备工作区。将大脑定向以便在琼脂糖模具中定位。
¶ 6. 在琼脂糖模具的喙端添加一小点强力胶。用抹刀将大脑放入模具中。确保大脑以背侧朝下的方式放置,以便进行水平切片。
注意:模具中胶水的位置会根据感兴趣区域(ROI)的不同而变化。对于海马-皮层(HC)和嗅球(OB)切片,确保嗅球(OB)被稳定住,并且大脑的两侧不被胶水粘住。过多的胶水会影响切片质量,并在振动切片时导致撕裂。
¶ 7. 将样品板移入缓冲托盘,将刀片以正确的角度移至适当位置,并提高缓冲托盘的高度,使刀片尽可能靠近大脑。
¶ 8. 以0.20 mm/s 的速度切片 HC 和 OB 组织，每隔 300 µm切一次，然后在每次切片后用玻璃巴斯德吸管收集它们。
¶ 9. 将切片放在充满aCSF的恢复室中，在32°C的水浴中放置45分钟，然后在室温下放置1小时。确保切片不重叠并完全暴露在碳氧合溶液中。
注意:请确保对所有溶液和提到的含有溶液的任何腔室进行持续的碳氧合。可以使用压力调节器来维持一致的碳氧合。
¶ 2. 基于In-vitro人类iPSC的HD-MEA神经网络
注意:本研究中使用的所有iPSC神经元均为商业获取(见材料表)。这些人类细胞从人外周血或成纤维细胞衍生的稳定iPS细胞系分化而来。
¶ 1. HD-MEA芯片的涂层用于in-vitro人类iPSC细胞培养(图2B)
¶ 1. 将HD-MEA芯片放置在采集记录平台上,用PBS填充储液池,并在涂层前测试芯片。启动Brainwave软件。选择文件>新建录制会话。将录制参数设置为录制频率 50Hz 和采样频率 18kHz电极。更改放大器偏移以校准芯片。有关故障排除提示,请参见表2。注意:录制频率和采样频率参数将取决于数据类型和个别系统要求。
¶ 2. 灭菌和预处理 HD-MEAs。
¶ 1. 在引擎盖下，用浸有96%乙醇（EtOH）的纸巾擦拭芯片和玻璃环，然后将每个设备放入无菌的100 mm x 20 mm培养皿中，并用70%乙醇填充MEA储液池20分钟。
¶ 2. 吸取 EtOH，并用无菌过滤的双蒸水清洗储液池3次。加入1 mL预处理培养基，并在37°C和5% CO2条件下孵育过夜。
注意：预处理介质需要是基于盐的溶液，以使HD-MEA 表面更具亲水性。这可以包括先前准备的 BrainPhys (BP) 完全培养基（不超过 >3 个月）（表 1C）。
¶ 3. 涂覆 HD-MEAs。第二天，吸出预处理培养基。加入1mL 0.1 mg/mL的聚-dl-鸟氨酸 (PDLO) 涂覆整个活性区域。在 37 °C 的培养箱中孵育过夜。
¶ 4. 准备并将培养基加热至室温。此处的方案利用了来自两个商业来源的功能性人类 iPSC 神经元,因此每个供应商的培养基成分各不相同。一个方案在(表 1C, D)中描述。
¶ 5. 吸取PDLO,用dd-water洗涤3次,并在通风橱下晾干芯片10分钟。
¶ 6. 用无菌过滤的dd水填充一个35 mm x 10 mm的培养皿，并将其放置在芯片旁边，以保持适当的湿度并避免在接下来的步骤中播种的细胞蒸发。
¶ 2. HD-MEA 中人类 iPSC 神经元的培养和维护(图 2B)
¶ 1. 1. 解冻并稀释细胞至所需的每微升细胞浓度（例如，1000 个细胞/µL，以在 HD-MEA 上的 50 µL 液滴中获得 50,000 个细胞密度）（表 1C）。 2. 使用高层粘连蛋白点状培养基将细胞悬液移液到芯片活性区域的表面（表 1D）。
¶ 3. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45-60 分钟。
¶ 4. 轻轻地在 HD-MEA 储液池中加入 2 mL 培养基（表 1C）。
¶ 5. 在播种后的第 1 天（DIV1）使用 RT 培养基（表 1C）进行 100% 培养基更换。每 3-4 天更换 50% 的培养基。在整个实验过程中，将 HD-MEA 保持在 37 °C 和 5% CO2 的环境中孵育。注意：轻轻使用移液器以避免细胞脱落。检查培养基的颜色以防止污染。间隔和培养基更换量可以根据个别研究问题或细胞需求/规格来确定。
¶ 6. 可选：在用 >70% EtOH 清洁载物台后，使用正置微分干涉对比（DIC）显微镜检查 DIV4-DIV8 之间细胞培养生长的进展。
¶ 3. 使用 HD-MEAs 进行 Ex-vivo 和 in-vitro大规模神经记录
¶ 1. 准备脑片记录工作区(图2A)
¶ 1. 在脑片恢复的同时,将所需工具放置在每个指定的工作区(见表材料)。
注意:主要系统设置必须在脑切片实验日之前进行优化和充分测试。灌流系统(入口管线、泵出口管线、管道和接地)需要使用 PBS 或 aCSF 以及 HD-MEA 在记录平台上进行测试,以确保信号清晰、信噪比提高,并且没有灌流噪音。
¶ 2. 用 0.1 mg/mL 的 PDLO 涂覆 HD-MEA 芯片以增强组织与芯片的耦合，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。
¶ 3. 在芯片孵育期间，用记录用aCSF填充重力灌注系统和管线。确保灌注系统的持续碳氧合。设置流速为4.5 mL/min，温度为37 °C。
¶ 4. 将 HD-MEA 芯片放置在采集记录平台上,用 aCSF 填充储液池,测试灌注系统,并排除任何剩余的系统噪音。
¶ 1. 启动 Brainwave 软件。选择 文件 > 新建录音会话。将录音参数设置为录音频率 1 Hz 和采样频率 14 kHz/电极。更改放大器偏移以校准芯片。有关故障排除提示，请参见表 2。注意：录音频率和采样频率参数将取决于数据类型和个别系统要求。
¶ 5. 通过房间照明系统或光学平台上的遮光笼确保记录区域处于黑暗状态。
¶ 6. 将体视显微镜与HD-MEA芯片储液池和活动区域对齐,以进行图像采集。
¶ 7. 将锚放置在芯片储液池中以达到平衡。注意:锚是定制的铂金竖琴,带有最少的导线以促进氧合;然而,一些商业产品也可用。
¶ 8. 将药理化合物添加到适当的灌注管中。
注意:在此协议中,获得了自发和 -氨基吡啶(4-AP)药理诱导的记录,如前所述。药理化合物可以根据具体研究问题进行定制。
¶ 9. 在脑切片制备工作区，将一个新的90 mm塑料培养皿放入一个150 mm玻璃培养皿中。加入aCSF并开始通入碳氧合气体。
¶ 2. 使用高清多电极阵列(HD-MEAs)对海马体(HC)和嗅球(OB)切片进行全电路记录
注意：切片耦合应尽快进行，以避免切片缺氧。从将显微解剖的切片放置在芯片活性区域到最终灌流系统启动，耦合只应花费~1分钟。1. 用玻璃移液管从脑切片恢复室中取出切片，并将其放置在一个90毫米的塑料培养皿中，持续通入碳氧混合气体。使用显微解剖工具，将HC或OB从周围的脑切片组织中分离出来。2. 用玻璃移液管将分离出的HC或OB急性切片移入HD-MEA储液池。用细刷轻轻将切片对齐在MEA活性区域。用抽吸系统吸出HD-MEA芯片孔中的所有溶液。3. 用镊子轻轻将锚放置在切片上方。注意：锚应在不移动切片的情况下放置，以避免耦合丢失。4. 轻轻向芯片储液池中添加溶液并启动灌流系统。注意：确保灌流入口和泵出口的层流，以获得最佳的记录参数。5. 通过房间照明系统或在光学桌面设置上使用遮光笼，确保记录区域适当调暗。6. 让切片适应10分钟，然后开始记录或进行额外的药理学调节。7. 启动Brainwave软件。选择文件>新建记录会话。将记录参数设置为记录频率1Hz，并且每个电极的采样频率为 14 kHz。更改放大器偏移以校准芯片。注意：如在第 3.1.4.1 节中所述，在进行系统测试时，请确保应用这些相同的记录参数。
¶ 8. 按下 Record 开始以预设的实验条件进行采集。
¶ 9. 在最终记录之后,立即对急性脑切片进行光成像。将切片移回切片恢复室,用刷子去除附着在芯片上的任何有机物质,然后继续进行下一个切片。按照第3.4节所述清洁HD-MEAs。
¶ 3. 准备人类iPSC记录工作区和在HD-MEA上的网络范围记录(图2B)注意:在记录前一天或在人类iPSC记录后立即更换培养基(表1C)。在使用功能性神经元的研究中,每4天更换一次培养基,并且在4、8、16和24 DIV时,在iPSC记录后立即更换培养基。
¶ 1. 通过使用>70% EtOH清洁HD-MEA采集平台,确保无菌工作环境。
¶ 2. 在罩子下轻轻放置带有参考的聚二甲基硅氧烷(PDMS)基帽在HD-MEA环上。将HD-MEA芯片移动到iPSC记录工作区,并将HD-MEA芯片连接到采集平台。
¶ 3. 确保通过房间照明系统或光学平台上的遮光笼将记录区域充分调暗。
¶ 4. 在开始记录或进行额外的药理学调节之前,让 HD-MEA 芯片平衡 10 分钟。
¶ 5. 启动 Brainwave 软件。选择 文件>新建录音会话。将录音参数设置为录音频率 50Hz 和采样频率18kHz电极。更改放大器偏移以校准芯片。
注意:如在第2.1.1节中所述,在进行涂层和电镀前的系统测试时,请确保应用这些相同的记录参数。
¶ 6. 在实验计划的每一天(即4、8、16、24 DIVs),记录人类iPSC网络的自发放电活动或药理诱导的反应。
注意:不要让芯片在孵化器外停留超过 分钟,以保持温度和湿度的稳定,防止细胞受到温度冲击
¶ 7. 在实验过程中,将HD-MEAs在在37°C、5% CO2的条件下孵育。
¶ 8. 实验完成后,固定芯片上的神经网络并进行染色以便进一步的光学成像,或直接清洁HD-MEAs,如步骤3.4所述。
¶ 4. HD-MEA芯片的清洁
¶ 1. 实验结束后,根据适当的废物处理方法丢弃溶液,并用dd水冲洗。
¶ 2. 加入选择的清洁剂,用棉签清洁活性区域和整个储液槽,然后丢弃清洁剂。重新加入清洁剂,孵育20分钟,然后丢弃清洁剂。
¶ 3. 用实验室级水彻底冲洗。然后用dd水冲洗3-4次。
¶ 4. 使用气压将HD-MEA芯片彻底吹干。
¶ 4. 从 HD-MEAs 分析大规模神经记录
注意:虽然步骤4.1是Brainwave软件特有的,但步骤4.2可以根据每个用户的商用HD-MEA设备类型进行修改。
¶ 1. 原始数据预处理和事件检测
¶ 1. 在 Brainwave 软件中打开一个已记录的原始数据文件 (brw)。选择 分析>LFP 检测 或 Spike 检测。
注意：LFP检测采用IIR滤波，使用低通4阶Butterworth滤波器（1-100 Hz）。硬阈值算法包括150 µV的高阈值、-150 µV的低阈值、70-120 ms之间的能量窗口、10 ms的不应期，以及1 s的最大事件持续时间。单次和MUA尖峰检测采用IIR滤波，使用高通4阶Butterworth滤波器（300-3500 Hz）。应用PTSD算法，标准差因子为8，峰值寿命期为2 ms，不应期为1 ms。
¶ 2. 对于 HC 和 OB 电路记录,在检测到的事件文件 (.bxr)中添加高级工作区选项,以导入从体视显微镜捕获的结构光图像。在检查大规模 HC 电路时,创建包含齿状回 (DG)、门区、Ammon 角 1 (CA1)、Ammon 角 3 (CA3)、内嗅皮层 (EC) 和旁嗅皮层 (PC) 的结构层。在检查大规模OB 电路时,创建包含嗅神经层 (ONL)、球状层 (GL)、外丛状层的结构层(EPL)、僧帽细胞层(MCL)和颗粒细胞层(GCL)。将EPL和MCL视为投射层(PL),包括嗅觉皮层(OCx)。
¶ 2. 使用自定义Python计算管道进行数据处理
¶ 1. 去噪
¶ 1. 使用自定义编写的Python脚本26,29,32和h5py 3.6.0Python包读取.bxr文件。
¶ 2. 提取与诱导多能干细胞（iPSC）网络记录相关的脉冲序列，以及与海马体（HC）和嗅球（OB）脑切片神经回路记录相关的局部场电位（LFP）事件序列
¶ 3. 将活跃电极总数少于平均事件活跃电极的 0.1%或 10% ,或检测到的事件落在统计合理的发放率范围之外的事件表征为随机事件并移除。此外,应用幅度和事件持续时间阈值。注意:对于发放率范围,考虑0.1-15次尖峰/秒和0.1-60次LFP事件/分钟。这些是用于分析数据集的示例速率阈值。速率、幅度和持续时间阈值将取决于个别数据。
¶ 2. 栅格图
¶ 1. 读取过滤后的事件.npy和.bxr文件,并使用Matplotlib生成栅格图
pyplot 函数 (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html)。
¶ 2. 此外,对于具有层特异性的脑切片记录,根据步骤4.1.2中产生的层对电极ID进行排序和分组。
¶ 3. 平均放电活动
¶ 1. 处理.bxr文件中的时间序列数据,计算每个电极的平均发放率(事件数/记录时间)。
¶ 2. 构建一个数据矩阵,其中行和列代表HD-MEA 64x64 阵列中电极的坐标,每个矩阵值表示平均发放率。
¶ 3. 使用Python中的绘图库,如Matplotlib的imshow或Seaborn的heatmap函数。
¶ 4. 在此使用“ hot” 色彩图,创建一个信息丰富的热图,直观地概括电极阵列中平均发放率的空间分布。
¶ 4. 代表性波形轨迹
¶ 1. 从 .brw 文件中读取时间序列数据，并使用 Matplotlib 的 pyplot 函数生成波形跟踪。(https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html)。
¶ 2. 输入所需的电极ID、时间区间和频率带以获取代表性波形轨迹。这些分析中定义的频率带包括低频LFP振荡（1-100 Hz），带通滤波的δ、θ、β和γ频率带；尖波涟漪（SWR）（140-220 Hz）；以及高频单一。 和 MUA (300-3500 Hz)。频段 δ、θ、β 和 γ 分别是 1-4 Hz、5-12 Hz、13-35 Hz 和 35-100 Hz。
¶ 5. 功率谱密度
¶ 1. 从 .brw 文件中读取时间序列数据,并计算周期图以识别每个时间序列中振荡活动的主导频率。
¶ 2. 构建频率-时间动态的伪彩色频谱图。注意:谱是通过使用快速傅里叶变换对记录的LFP进行Welch方法计算来估计谱功率密度41。
¶ 3. 输入所需的电极ID、时间区间和频带以获取功率谱密度图。这些分析中定义的频带包括步骤4.2.4中描述的频带。
¶ 6. 功能连接
¶ 1. 对于脑切片电路记录，遵循步骤4.2.6.2-4.2.6.4。
¶ 2. 从.brw文件中读取时间序列数据，并使用皮尔逊相关系数（PCC）计算64 x 64阵列中活跃电极对之间的互协方差。
¶ 3. 使用多变量Granger因果关系拟合向量自回归模型，以量化一个时间序列对另一个时间序列的影响。
¶ 4. 应用定向传递函数（DTF）评估相关链接内的方向信息流。
注意:多层网络中的功能连接是通过设置一个相关值阈值来建立的,该阈值基于所有互协方差值的平均值和两个标准差以上。
¶ 5. 对于iPSC记录，遵循步骤4.2.6.6-4.2.6.8。
¶ 6. 从.bxr文件中读取尖峰序列数据，并使用spike_train_correlation函数（https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html）计算所有组合的分箱尖峰序列之间的PCC相关系数的64x64矩阵。
注意：多层网络中的功能连接是通过设置一个相关值阈值来建立的，该阈值基于所有互协方差值的平均值和两个标准差以上。
¶ 7.此外，在连接矩阵上实施时空滤波器（STF）和距离依赖的延迟阈值（DdLT）过滤程序，以消除超过最大传播速度（设定为400 mm/s）的潜在配对连接。
¶ 8.从结果的互相关矩阵中提取负峰，通过过滤和阈值操作使用过滤和归一化的互相关直方图（FNCCH）算法识别抑制连接。
¶ 9. 将每个连接矩阵转换为动态图（.gexf）文件。
¶ 7. 网络连接图
¶ 1. 在 Gephi 程序 9.2 版本 (https://gephi.org) 中打开数据实验室,以绘制特定时间段的动态图。
¶ 2. 在布局窗口中应用 Geo Layout 进行空间映射。
¶ 3. 对度范围和边权重施加参数约束以进行比较。
¶ 4. 分配节点颜色、边大小和度大小以获得更好的可视化效果。
¶ 代表性结果
多模型时空映射和振荡发放特征提取为了量化从动态神经元群体中出现的全网络LFP和尖峰事件,我们研究了HC和OB电路以及人类iPSC网络中的同步大规模放电模式。根据步骤4.1-4.2的协议,分析了步骤3.2中记录的脑片电路和步骤3.3中记录的iPSC网络。首先,对所有记录的数据集进行事件检测和去噪,并根据电路规格进行区域解析。接下来,绘制了平均大规模LFP和尖峰放电模式的地形伪彩色空间映射、检测事件的栅格图以及过滤波形的代表性5秒轨迹(图3A-I)。大规模LFP和尖峰放电率模式的地形伪彩色映射叠加在HC(图3A)、OB(图3B)和人类iPSC神经网络(图3C)的显微镜捕获光学图像上。这使得可以研究个体电路和基于网络的振荡模式和响应。HC和OB的栅格图包含检测到的LFP事件计数,这些计数在DG、Hilus、CA3、CA1、EC和PC层中排序。
HC电路和OB网络的ONL、OCx、GL、PL和GCL层在60秒时间窗口内(图3D,E)。人类iPSC栅格图显示了互联培养网络在20秒时间窗口内的同步检测尖峰事件(图3G)。接下来,来自大规模HD-MEA记录点的5秒代表性事件轨迹显示了HC(即,CA3中选定电极)(图3G)和OB(即,GL中选定电极)(图3H)电路中记录的振荡频率范围,以及来自阵列中四个选定活跃电极的人类iPSC网络中的多单元尖峰爆发活动(图3I)。这些示例信号显示了生物信号特征,包括低频LFP振荡( 1-100Hz )与带通滤波的δ、θ、β和γ频带;尖波涟漪(SWR)( 140–220Hz );以及高频单一和MUA( 300–3500Hz )。最后,功率谱密度(PSD)分析用于同时量化从HD-MEA记录的互联HC和OB电路中特定振荡频带的功率幅度(图3J,K)。
¶ 多模态全网络功能连接组
为了从同时活跃的神经元群体的同时发射模式中推断多层神经网络的大规模连接性,根据协议的步骤4.2.6,计算了检测到的事件中活跃电极对之间的互协方差。在这里,相关系数根据HC和OB电路中的层进行排序,或者在iPSC网络中未排序,然后存储在对称矩阵中。通过应用多变量Granger因果关系和定向传递函数(DTF)来生成HC和OB电路的功能连接组图,以量化一个时间序列对另一个时间序列的影响,并评估不同网络中相关链接内的方向性信息流。HC(图4A)和OB(图4B)的连接组图映射和网络可视化
使用 Gephi 程序 9.2 版本 (https://gephi.org) 进行。对功能连接施加了类似的参数约束,以比较 HC 和 OB 脑切片电路,并展示了检测到的 LFP 事件的 100 秒功能连接。节点根据度强度进行缩放,节点颜色表示层,链接颜色标识层内和层间连接。通过应用生成人类 iPSC 网络的功能连接组。
时空滤波器(STF)和距离依赖延迟阈值(DdLT)通过应用过滤和归一化的互相关直方图(FNCCH)分析来增强显著连接的选择并优化有意义连接的识别。使用Gephi对整个HD-MEA芯片上的人类iPSC网络进行连接组映射(图4C)可视化。节点颜色表示兴奋性或抑制性输入,连接颜色标识连接。
图1:大规模HD-MEA实验和计算平台概述。(A) 我们的多模态生物混合神经电子平台的等距示意图,采用基于CMOS的HD-MEA实现,从HC、OB和人类iPSC神经回路和网络中捕获神经动态。(B) 小鼠脑切片的示意工作流程及其工作场景,以获得HC和OB切片。(C) 从整个HC和OB切片同时记录的大规模放电模式的地形表示,与提取的细胞外波形叠加到切片光学图像上。(D) 从人类获得的iPSC神经网络的示意图。(E) 荧光显微照片显示在HD-MEA芯片上整个人体神经网络的细胞c-fos和体/树突MAP-2(left),与整个平均放电活动图(right)相匹配。 (F) 计算框架包括高级数据分析、连接性映射和AI机器学习工具,用于分析从HD-MEAs大规模记录中获得的多维神经数据。请点击此处查看此图的更大版本。
图 2:ex-vivo 脑切片和 in-vitro 人类 iPSC 培养制备及记录工作区的布局。(A)示意性工作流程图,说明准备HC和OB切片的设置,展示每个工作区所需的工具和设备。(B) 人类iPSC培养准备的示意图,包括所需的工具和设备。完整的材料清单包含在步骤1.2.2、2.1、2.2、3.1.1、3.3和材料表中。请点击此处查看此图的更大版本。
图3：网络动态的时空模式映射和提取。(A-C) 平均LFP和尖峰率空间图，基于五分钟记录计算，叠加在显微镜光学图像上。(D-F) 栅格图显示在60秒数据子样本中检测到的去噪LFP事件和在20秒数据子样本中的尖峰。(G-I) 从栅格图数据子样本的5秒段中提取的代表性波形轨迹（在栅格图中以红色突出显示），显示为原始LFP振荡带（1-100 Hz）；δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β(13-35 Hz), 和 γ (35-100 Hz) 频带；SWR (140-220 Hz)；以及高频单一和MUA尖峰 (300-3500 Hz)。(J,K) 功率谱快慢振荡LFP（1-100 Hz）和SWR（140-220 Hz）的密度图。请点击此处查看更大版本。
图4：多模态网络范围功能连接组的组织。(A-C) Gephi地图展示节点功能连接，其中节点对应于示例颜色条图例之一（below），而链接（或边）则根据连接的节点进行着色。（A）HC、（B）OB 和（C）iPSC 层的示例图例显示在 64 x 64 阵列上。HC 和 OB 层在 100 秒的时间段上绘制，以有效减少可见节点和链接的数量以便于可视化。请点击此处查看此图的更大版本。
¶ 讨论
神经元活动的时空动态复杂性,从相互连接的神经元群体中涌现,一直是神经科学中引人入胜的研究课题。传统的方法,如膜片钳、标准MEA和Ca2+成像,提供了对大脑复杂性的宝贵见解。然而,它们往往难以捕捉到全面的网络范围内的计算动态21,22,23。本文在JoVE研究中详细介绍的HD-MEA平台的技术协议,代表了一个显著的进步,提供了从细胞集合到广泛网络(即急性,ex-vivo小鼠脑切片和in-vitro人类iPSC网络)26,29,30,32的神经动态全景视图。
急性,ex-vivo小鼠脑切片一直是神经元研究的基础工具,促进了分子和电路层面的研究6,7。然而,维持组织活力的挑战一直是一个持续的瓶颈。本研究中描述的方案引入了关键的修改,以优化这些切片的质量和寿命,从而在HD-MEA平台上充分利用其优势。该方案强调了以下重要性 - i) 实现切片均匀性,为此,使用振动切片机优于组织切片机,因为其精度高且组织损伤小,尽管切片时间较长。ii) 确保从提取到记录的整个过程中持续的碳氧化,以维持组织活力。iii) 调节温度并在记录前给予足够的恢复时间。iv) 使用琼脂糖块或模具来稳定大脑,防止撕裂,并尽量减少胶水接触。v) 在HD-MEA储存器中维持最佳流速的碳氧化aCSF,以确保切片健康,同时避免解耦、噪声和漂移等问题(表2)。
对于小鼠脑切片和人类iPSC制备,增强电极-组织界面耦合是至关重要的30,46,47。我们的协议强调了使用促进粘附的分子Poly-dl-ornithine(PDLO)的重要性。该分子不仅增加了检测电信号的表面积,还提高了电导率46 。通过这样做,它促进了细胞粘附、生长和功能网络特性的发育。这种优化在提高HD-MEA平台的效能中起着关键作用。这反过来又确保了对微尺度ex-vivo和in-vitro 连接组及其时空发射序列的准确和一致的分析。值得注意的是,PDLO在促进神经元培养中的自发发射活动和对电刺激的响应方面,已被证明优于其他基质如聚乙烯亚胺(PEI)和聚-l-鸟氨酸(PLO)。此外,PDLO已被用于HD-MEA的表面功能化,并显示出增强电极-切片耦合界面和提高OB和HC切片中的信噪比26,29。添加定制的铂锚进一步增强了电极-切片界面耦合,导致记录具有更高的信噪比o
HD-MEA在ex-vivo小鼠脑切片和in-vitro人类iPSC网络中的应用引入了一种擅长探索广泛、多尺度和多模态动态的方法。然而,这种创新方法带来了相当大的挑战,特别是在数据管理方面48,49,50,51。单个HD-MEA记录在18kHz电极采样频率下生成惊人的155 MB/s数据。当考虑到多个切片、多种药理条件或长时间记录时,数据量迅速增加。如此大量的信息需要强大的存储基础设施和先进的计算能力。
工具用于简化处理。HD-MEA平台能够同时收集数千个神经元群体的数据,这既是一个福音,也是一个障碍。它提供了对大脑功能计算动态的极佳见解,但也需要一个精细的分析框架。在这个JoVE协议中,我们提供了计算策略的示例,包括大规模事件检测、分类、图论、频率分析和机器学习。这些方法强调了为解决复杂神经数据分析挑战所做的巨大努力。然而,仍有相当大的空间来开发更先进的计算工具以分析这些多维神经数据集。配备适当的工具和方法,HD-MEA平台的潜力被放大,提供了对健康和病理状况下大脑功能复杂性的深刻见解。
本质上,HD-MEA 平台在结合详细的协议和讨论的计算工具时,提供了一种变革性的方法来理解大脑的复杂运作。通过捕捉大规模、多尺度和多模态的动态,它为学习、记忆和信息处理等过程提供了宝贵的见解。此外,其在体外人类 iPSC网络中的应用有可能彻底改变药物筛选和个性化医学。然而,尽管该平台代表了神经科学研究的重大进步,但必须承认并解决其固有的技术挑战。随着不断的改进和先进计算工具的整合,HD-MEA 平台有望引领精确诊断工具的新时代,识别特定生物标志物,并为神经系统疾病提供针对性治疗。
¶ 致谢
本研究得到了机构资金(DZNE)、亥姆霍兹协会亥姆霍兹验证基金(HVF-0102)以及德累斯顿国际生物医学与生物工程研究生院(DIGS-BB)的支持。我们还要感谢DZNE-德累斯顿的行为动物测试平台(Alexander Garthe、Anne Karasinsky、Sandra Günther和Jens Bergmann)的支持。我们要承认,图1的一部分是使用平台BioRender.com创建的。
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