¶ 通过高分辨率生物电传感实现海马体网络层面长时程增强的动态映射
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沙鲁克·汉扎达¹、胡鑫¹、布雷特·艾迪生·埃默里¹、弗拉迪斯拉夫·斯雷德尼亚瓦²、丹尼尔·K·沃伊奇克³、格尔德·肯佩曼⁴ˌ⁵以及海德尔·阿明¹ˌ⁶ ᵃ
所属机构
1.生物混合神经电子学（BIONICS）小组，德国神经退行性疾病中心（DZNE），塔茨贝格41号，01307德累斯顿，德国
2.心智神经生理学实验室，神经可塑性与脑障碍卓越中心（BrainCity），波兰科学院内基实验生物学研究所，巴斯德街3号，华沙02-093，波兰
3.神经信息学实验室，波兰科学院内基实验生物学研究所，巴斯德街3号，华沙02-093，波兰
4.成人神经发生小组，德国神经退行性疾病中心（DZNE），德累斯顿，德国
5.德累斯顿工业大学再生疗法中心（CRTD），费切尔大街105号，01307德累斯顿，德国
6.德累斯顿工业大学，卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯医学院，贝格大街53号，01069德累斯顿，德国
a) 通讯作者：hayder.amin@dzne.de
¶ 摘要
理解神经网络动力学的复杂性需要能够以高空间和时间精度捕获大规模相互作用的先进生物传感技术。传统方法，如膜片钳和场电位记录，由于其局部范围和间接访问海马亚区，在解析全网络突触连接方面存在固有局限，尤其是长时程增强（LTP）。为了应对这些挑战，我们引入了EvoNES，一种基于CMOS的高清4096微电极阵列平台，该平台利用双向刺激响应生物传感功能。通过将针对谢弗侧支和内侧穿通通路的精确外部电极刺激与同步的片上生物电记录相结合，EvoNES首次实现了对整个海马回路中诱发响应和LTP动力学的实时量化。该系统弥补了传统技术的关键空白，提供了细胞组装相互作用的介观尺度视图，并为记忆编码和学习过程背后的分布式机制提供了前所未有的见解。先进的计算分析生成变异图，揭示了在突触增强过程中海马亚区内不同的电压波动模式和差异敏感性。我们的研究结果在CA1–CA3网络中识别出四种不同的波形类别，并在齿状回（DG）中识别出三种独特的诱发放电模式。强直后响应显示出更快的诱导、扩展的激活区域以及先前沉默细胞组装的激活，表明显著的网络重构。在老年小鼠中应用时，EvoNES展示了网络LTP的年龄依赖性变化，无论是在定量还是定性上。这种在活体神经环境中的高分辨率生物传感平台为海马记忆形成提供了前所未有的见解，并为研究健康和疾病状态下的神经可塑性和网络相互作用提供了一个强大工具。
¶ 一、引言
记忆，作为一种关键的认知功能，远不止是我们获取信息的储存库。它是一个动态的神经生物学构建，与我们的感知、行为以及对未来的期待相互交织1。学习与记忆涉及一系列分子、细胞和神经回路事件通过编码、存储、巩固和提取经验，塑造我们的认知与行为体系2。如同万花筒通过镜面旋转与玻璃排列创造图案，记忆被认为是通过细胞间相互作用形成的协调活动模式来呈现的。
在特定体验和行为期间，分布式大脑网络中的神经集群活动3–5。尽管研究广泛，但通过大规模神经元相互作用形成记忆的机制仍不明确。理解记忆机制的计算动力学能够阐明认知能力，并促进记忆障碍的干预治疗。虽然多个脑区共同参与学习记忆的不同方面，但海马体在空间和情景记忆场景中处于核心地位——其独特的结构布局与特化细胞类型能够将经验编码为持久记忆痕迹6–8。在海马体环路中，信息流经由相互连接的齿状回（DG）、CA3、CA2及CA1区域传递，各区域以独特方式参与记忆的处理与存储6,9,10。这一传输过程由穿通通路、苔藓纤维和谢弗侧支等通路介导，并受突触可塑性调控11。活动依赖的突触可塑性，特别是长时程增强效应（LTP），已被确认为学习记忆的细胞基础，涉及复杂的突触前与突触后修饰机制12。
长时程增强（LTP）表现为高频刺激后突触传递的持续强化，而长时程抑制（LTD）则以突触强度的持久减弱为特征。LTP与LTD通过调控细胞集群内的突触连接，实现记忆编码、巩固与提取所必需的高效信号传输。13这种由突触可塑性主导的调节机制，使得特定细胞集群能够形成并稳定其有序放电模式，从而构成记忆印迹的物理载体。14,15
长时程增强效应（LTP）与海马体突触可塑性已通过尖电极记录、膜片钳技术、细胞外场电位测量及传统微电极阵列（MEA）生物传感器得到广泛研究。16–18 脑切片模型的应用显著丰富了研究手段，为解析这些现象背后的细胞与网络机制提供了可控环境。19 尽管这些方法提供了宝贵见解，其局限性也逐渐显现：包括缺乏精确映射突触活动依赖性变化的空间分辨率，以及存在显著实验间变异度，这些因素阻碍了研究结果的可复现性，并掩盖了不同实验条件下突触可塑性与LTP的细微改变。20–22 这些局限凸显了对新型大规模多位点生物传感技术的需求——该技术不仅能深化我们对LTP背后细胞与网络机制的理解，更能为学习记忆过程所依赖的海马体各分区细胞集群计算提供完整的时空动态视图。20–22
采用高密度CMOS-MEA的先进电生理记录技术代表了生物传感创新的前沿，极大增强了我们对多模态神经动力学的理解。这些平台能够从数千个位点进行精确同步记录，提供前所未有的时空分辨率，从而全面捕捉神经相互作用。这种能力对于旨在解码复杂神经功能与交互作用的生物电传感器至关重要。 。22–26本研究推出的EvoNES是一种尖端高密度生物传感平台，专用于海马体环路中网络水平长时程增强效应和细胞外诱发突触电位的长期无标记监测。该平台集成了最先进的CMOS-MEA技术，强化了其在需要详细神经映射和分析的生物传感应用中的关键工具作用。通过整合来自4096个微电极的大规模神经记录、先进的计算工具以及对神经动力学的深入理解，本研究旨在通过研究网络范围内的长时程增强和突触可塑性，来绘制学习过程和记忆编码背后的大规模细胞集群重构图谱。
我们的方法促进了来自两个海马经典通路——内侧穿通通路（mPP）至齿状回（DG）以及CA3至CA1的谢弗侧支（SCs）——的双向刺激响应生物传感功能。我们采用基于时空波形的自动分类方法，将网络诱导突触反应的细胞层与海马亚区内的解剖结构对应对齐。这些场兴奋性突触后电位（fEPSPs）及其诱导的突触反应谱系，可从DG、CA3和CA1编码的细胞集群放电组中同步识别。我们的全网络记录还通过核电流源密度（kCSD）方法实现了神经元跨膜电流源与汇生成器的精细化计算。27 最后，我们评估衰老海马环路中的全网络诱发表征，以揭示失活细胞集群如何促进功能重塑。28 研究结果表明，衰老通过减少特定海马层的特异性放电模式来削弱突触可塑性，从而导致大规模记忆编码网络发生显著改变。本研究深入揭示了突触效能与连接性的年龄相关变化如何影响海马环路的整体组织与功能运作。
这是首份关于在海马体中通过电刺激同时调节无标记、大规模功能性突触活动依赖性变化和网络水平长时程增强诱导的报告。虽然主要旨在以前所未有的生物传感时空分辨率理解学习和记忆，但我们的研究具有更广泛的影响。该平台为神经科学、技术、人工智能和自适应学习系统的进步铺平了道路，可能彻底改变终身学习机器、神经形态计算和脑启发机器学习算法。29,30
¶ 二、结果
¶ A.EvoNES平台的实现
为全面研究海马网络中的突触传递和长时程增强（LTP），我们开发了诱发网络电生理传感器（EvoNES），该平台融合了先进的计算实验特性（图1）。其核心是配备4096个微电极的高密度平面CMOS微电极阵列（HD-CMOS-MEA）24,25，为同步大规模记录与刺激提供了前沿生物传感方案。该平台通过实现功能神经动力学的实时映射，以空前的时空分辨率突破了传统电生理技术的局限。作为多功能生物传感工具，EvoNES通过专用输入输出模块连接的外部铂双极电极对神经组织进行精准刺激，最大限度减少刺激伪影。零漂移三轴微操纵器确保电极定位的精确性与稳定性，而定制立体显微镜则将海马组织与CMOS-MEA精准对位，从而优化记录信号的保真度与准确性[图1(a)]。该系统能够捕获CA1-CA3和DG网络的多层突触响应，填补了神经监测技术的关键空白，实现了神经元可塑性的高通量、无标记探索。通过谢弗侧支（SCs）和内侧穿孔路径（mPP）的双通路刺激，可采用两种外部电极或针对特定CA1-CA3/DG网络的靶向刺激实现[图1(b)]。该平台还配备基于Python的集成计算框架，可处理分析海量多维数据集，提取时空特征（如网络强化图谱、多层波形和聚类算法），包含时频动态分析、核电流源密度（kCSD）分析等工具，以及多种统计指标，提供了对基于突触可塑性的实时网络动态的全面理解[图1©]。该方法能够细致探索网络突触动态，为深入研究这些动态如何支撑全网络的长期增强及其在记忆编码中的作用奠定了基础，我们将在第II B节中展开讨论。
图1. 具有双向刺激响应生物传感功能的EvoNES平台概览，用于网络层级突触与长时程增强（LTP）的测量分析。(a) 该平台通过配备4096个微电极的高密度CMOS微电极阵列（HD-CMOS-MEA），实现对海马网络的突触传递与网络层级LTP研究。实验装置采用零漂移三轴微操纵系统实现刺激电极的精确定位，并配备定制立体显微镜确保与海马组织的准确对准。实验流程时间轴包含从基线测量到通过单次 高频刺激（HFS）诱导强直增强的全过程。(b) 系统可刺激谢弗侧支（SCs）和内嗅皮层穿通通路（mPP），利用双极刺激电极测量全网络范围的诱发活动，同步捕获CA1-CA3区域和齿状回（DG）层特有的兴奋性突触后电位（EPSP）与种群锋电位（PS）特征。© 基于Python的集成分析流程概览，用于处理和可视化高维神经数据。该流程可提取时空特征、计算网络增强指标、生成多层波形表征，并应用聚类与多元模式分析来表征海马各层的LTP动力学。该平台提供灵活的多格式部署方案，支持深度探索、数据共享和可视化研究。
¶ B.全网络LTP顺序编码模式的表征
EvoNES的一个关键特性在于其能够将功能性生物电网络数据与相应的海马体亚区。这种整合使EvoNES能够作为动态生物传感器，精确映射包括锥体神经元和中间神经元在内的多种神经元群体中特定层级的突触激活。通过实时提供生物电反馈，该平台能够对细胞集群及其功能重组进行高分辨率分析，这对于理解记忆处理中突触可塑性的机制至关重要。31 详细映射涵盖多个层级，包括CA1-CA3网络中的腔隙层（SO）、锥体细胞层（SP）、辐射层（SR）和分子腔隙层（SLM），以及齿状回网络中的分子层（ML）、颗粒细胞层（GCL）和门区（H）32 [图2(a)和2(b)]。
为了研究网络范围长时程增强（LTP）序列编码模式的诱导及其对突触可塑性的影响，我们采用高频强直刺激（HFS）方案，施加持续1秒、频率100赫兹的序列电脉冲。该方法旨在模拟导致突触强化的神经元自然活动模式，确保实现稳健的LTP诱导。刺激后我们观察到海马网络中突触增强效应的提升。多位点记录为LTP的时空依赖性提供了详细见解，揭示了不同海马区域中刺激模式与LTP诱导之间复杂的相互作用。
利用伪彩色图谱（高级生物传感数据可视化套件的一部分），我们动态呈现了CA1–CA3与DG网络的基线状态（BS）及强直刺激诱导的强化状态（LTP）[图2©–2(f)与补充材料视频1、2]。这些图谱清晰勾勒出突触强化状态，精准定位网络中突触增强的具体位点，并揭示LTP效应的空间异质性。值得注意的是，基线状态下原本不活跃的区域在LTP诱导后表现出显著的增强效应[图2(d)与2(f)]。
我们进一步基于归一化场兴奋性突触后电位（fEPSPs）量化了网络层面的长时程增强（LTP），将CA1-CA3网络[图2(g)]和齿状回（DG）网络[图2(h)]中突触增强达到基线水平40%的时刻定义为LTP起始点。刺激Schaffer侧支（SC）和内嗅皮层-海马穿通通路（mPP）纤维后，LTP呈现出双阶段模式：初始5分钟内出现快速增强达峰，随后进入持续增强阶段并在后期（最长120分钟）逐渐衰减。该模式在所有海马亚区中保持一致，证明了我们刺激方案的稳健性。量化分析实现了空间激发响应的图谱绘制，并揭示了突触强化的时间动态特征。我们还通过整合强直刺激后即时期、中期和长期阶段的测量值，计算了相对于基线的突触可塑性百分比，以捕捉持续的突触动态变化。结果显示显著的网络水平可塑性：CA1-CA3网络中起层（SO）为 、锥体层（SP）为 、辐射层（SR）为31%±5.3、腔隙分子层（SLM）为 ；齿状回中分子层（ML）为 、颗粒细胞层（GCL）为 、门区（H）为 （ ，Kolmogorov-Smirnov检验）。
接下来，我们计算了各海马亚层的归一化电压变化伪彩图[图2(i)与2(j)]，以识别长时程增强效应引发的反应在空间分布上的依赖性。这些图谱揭示了网络层面突触增强过程中微妙的电压波动，显示出不同海马层次间的显著差异。在整个增强阶段，CA1-CA3区的腔隙层/分子层以及齿状回颗粒细胞层均观察到显著的电压变化，表明不同层次对LTP诱导具有特异性敏感度。这与早期小规模电生理记录的观察结果一致。33 该分析强调了海马体内突触调节的时空复杂性及其对神经元回路、记忆形成、巩固与提取的影响，反映了大脑通过特征编码细胞集群库处理和存储信息的精密机制。15,34
我们的研究结果证实，记忆是由神经活动模式动态塑造的，而非静态表征。35,36通过将多种研究方法37,38整合为单一强大工具，我们为绘制完整海马网络提供了前所未有的分辨率。这为探索记忆在这一关键脑结构中如何被编码和操控开辟了新途径。通过表征全网络长时程增强的连续编码模式，我们能更深入地理解学习与记忆的神经基础。
在描绘了海马网络中的顺序编码模式后，我们现在利用无监督分类方法，探究这些模式产生的特定突触特征，以揭示定义突触可塑性的复杂波形模式库。
¶ C.通过波形库的无监督分类揭示突触特征
一个关键问题在于，对基于层次的波形特征进行详细分析如何增强我们对海马体突触可塑性与网络动力学的理解。兴奋性突触后电位（EPSPs）和群体峰电位（PSs）是海马体内诱发神经活动与突触功能的标志性特征，通常通过各种传统记录方法进行研究。13,39,40 虽然这些现象常作为神经元强化和群体神经元放电的替代指标，但我们的方法通过利用大规模记录获取的多维综合数据深化了这一认知。这些丰富数据使我们能够识别复杂的波形特征及其时空特性，从而更深入地理解记忆过程中的突触相互作用及神经回路功能。41 该方法实现了对CA1-CA3网络和齿状回（DG）网络不同层次中大量波形模式的无监督分析，涵盖基线状态和强直刺激后的不同条件。
采用主成分分析（PCA）和k均值聚类24 (见第四节)，我们在CA1-CA3网络中划分出四种不同的波形类别，分别对应SO、SP、SR和SLM[图3(a)和3©]。类似地，我们在齿状回（DG）网络中表征了三种独特的诱发发放模式，分别与ML、GCL和H相关[图3(e)-3(g)]。这种空间分辨分类揭示了不同海马层如何特异性地贡献于突触可塑性与功能重组。
对这些波形进行时间分析显示，强直后刺激引起显著变化，表明神经激活增强及神经表征辨别力提升。刺激后PCA图谱中数据点密度增加和分离度提高[图3(b)、3(b0)、3(f)和3(f0)]，突显了突触连接的选择性强化。分类准确率较高，CA1-CA3网络在基线期和强直后期的真实概率得分分别为 与 。齿状回网络在相同阶段的得分分别为 $9 9 . 3 % 2 0 . 6 $ 与 阶段，证实了我们分类方法的稳健性 [图3(d)、3(d0)、3(h)和3(h0)]。
图2. 全海马网络LTP诱导突触改变的精细定位。(a) 海马分区荧光图像，用于识别网络中不同的神经元层。(b) 将功能性生物电信号叠加于海马分区光学图像的分析平台，描绘CA1-CA3网络中各海马层（SO、SP、SR、SLM）及齿状回（ML、GCL、门区）不同神经元群体的突触激活模式。©-(f) 伪彩色图谱展示CA1-CA3与齿状回网络的基线状态与强直刺激诱发突触增强（LTP）的动态表征，突出空间异质性并精确定位突触强化位点。(g)和(h) 标准化场兴奋性突触后电位（fEPSPs）量化结果，呈现以即时增强与持续增强为特征的双相LTP模式。(i)和(j) 各海马亚层标准化电压变化色谱图，揭示不同层级对LTP诱导的特异性响应及突触增强过程中独特的电压波动特征。
我们进一步分析了这些波形在基线和强直后阶段的峰峰值幅度和斜率特征。分析结果显示，这两个特征在所有条件下均出现显著增强海马体层对强直刺激的反应[图3(i)–3(l)]。这些变化凸显了基于增强效应的波形形态作为生物标志物的潜力，可用于识别海马回路中的层特异性特征。42 此外，长时程增强诱导的神经活动模式改变也强调了该系统的动态特性突触可塑性的本质及其在信息处理与记忆形成中的关键作用。
图3. 全网络诱发突触响应模式的分类与分析。(a)–© 主成分分析（PCA）与k均值聚类在CA1-CA3网络层（SO、SP、SR、SLM）的基线期和强直刺激诱发增强期识别出四种不同的EPSP与PS波形类别。(e)–(g) 齿状回网络层（ML、GCL、门区）的类似分类。(d)、(d0)、(h) 和 (h0) k均值聚类准确度的混淆矩阵，显示CA1-CA3与齿状回网络在强直刺激前后对诱发放电模式具有高精度分类和明确分离特性。(i)–(l) 突触响应峰峰值振幅与斜率特征的定量分析，表明强直刺激后海马各层的突触响应均显著增强，提示神经激活与突触可塑性提升。
我们的研究结果强调了整合放电特征的空间和时间维度以全面理解与长时程增强相关的突触可塑性及网络重组的重要性43 这构成了神经回路活动依赖性修饰和记忆印迹形成的基础。 44 这种精细化的分析超越了传统二元指标，揭示了海马体不同阶段和层次中神经元活动的复杂相互作用。基于时空依赖性识别出的波形特征，凸显了其发现突触性能与神经回路完整性的新型生物标志物的能力。
在对海马体层内基于增强的波形特征有更清晰的理解后，我们接下来专注于绘制诱发突触传递的时空动态，为了深入了解这些动态如何促进整个网络中复杂学习和记忆过程。
¶ D. 全网络诱发传输的时空动态映射
理解海马体内突触激活的时空动态对于阐明学习和记忆的潜在机制至关重要。尽管神经元放电模式和突触可塑性在这些过程中的作用已得到确认，但全面绘制这些动态仍面临挑战。45,46 突触时序依赖性可塑性（STDP）凸显了时间精度在学习机制中的重要性。47 此外，突触激活的空间组织对海马体内高效信息处理至关重要，支撑着空间导航与记忆整合功能。48,49 尽管研究不断进展，完全理解这些时空动态仍存在重大挑战，这构成了学习记忆研究的关键前沿领域。
为探究这些动态特性，我们通过刺激后潜伏期表征了细胞外突触响应。将处理后的诱发波形峰值时间索引聚类为初始群、中央群和终端群。如图4(a)-4(d)伪彩色潜伏期图谱所示，我们建立了突触事件相对于刺激电极的空间分布与其在CA1-CA3和DG网络中时间特性的关联关系，涵盖基础状态和强直后阶段。基于时间的波形聚类显示出突触响应相对于刺激点的明显时序特征[图4(e)-4(h)]。利用EvoNES平台的先进生物传感能力，我们计算了时间延迟动态并追踪了从基础状态到强直后阶段初始群、中央群和终端群中激活电极的分布。值得注意的是，在强直后阶段观察到新发火电极的出现，表明网络内先前沉默或低活性区域被激活。这证明了该平台具有揭示潜在神经元功能的独特能力，可能与联合长时程增强（LTP）机制相契合。50 这种激活反映了与LTP诱导后突触网络功能重构相一致的介观重组，包括跨海马层级的回路水平反应的招募和强化。此外，该阶段突触响应潜伏期显著缩短，表明突触效能提升及网络内信号传导更高效。虽然这些动态变化暗示可塑性诱导的改变，但它们是基于细胞外群体记录推断得出，并不代表直接观察到突触超微结构或分子重塑。
对多组记录中时间延迟和活跃电极数量的定量分析证实，强直后时期时间延迟显著缩短（即更快诱发），激活区域扩大，表明突触活动的时空效能增强[图4(i)–4(l)]。新激活的放电电极——尤其是在先前被归类为沉默或低活跃度的区域——标志着突触网络发生了显著重组。这一现象在CA1–CA3网络（SO、SR、SP和SLM层）中均明显可见，其起始层、中间层和终末层的活跃度分别提升了1.5倍、1.8倍和2.25倍。同样地，齿状回（分子层、颗粒细胞层和海马门区）的起始簇、中央簇和终端簇也分别呈现1.8倍、1.7倍和1.9倍的增强，突显了突触活动的强化效应[图4(i)和4(j)]。从基线期到强直后阶段的时间延迟归一化百分比变化[图4(k)和4(l)]分别降低了：CA1-CA3网络初始、中央和末端集群中降低 、 和 ；DG网络初始和中央集群中降低 和 ，而DG末端集群的时间延迟则增加了 。
我们在CA1-CA3海马网络中的时间映射揭示了强直刺激引发的响应序列：始于SR区——该区域首先整合来自CA3区的直接兴奋性输入。这一初始响应之后是SP区的活动，在此处输入信号被处理为神经元输出。随后SO和SLM区相继响应，反映出它们通过复杂输入和间接通路调控并整合网络输出的功能。这种从初始整合（SR）到神经元处理（SP）再到调控（SO与SLM）的独特有序进程，凸显了理解海马突触激活序列与可塑性机制的重要性。同样，我们绘制了齿状回各层在强直刺激前后的时间动态图，展示了从输入层（ML）经处理层（GCL）至调控回路（门区）的突触激活与可塑性诱导序列。这一进程揭示了高频刺激下信息处理与突触修饰的复杂性。
我们的研究结果突显了突触激活的空间定位与其对神经刺激的时间响应之间复杂的相互作用。这种时空框架增强了我们对海马体各层突触组织以及长时程增强（LTP）和网络适应动态过程的理解。这些发现通过展示突触效率的改变和新细胞集群的激活如何促进认知功能，揭示了海马体在记忆和学习中的作用。我们的研究结果可能为海马体如何处理潜在信息——尤其是在齿状回-CA3回路中51——以及它如何响应外部刺激和经验动态重组并编码新信息提供了实证依据。
基于对突触传递时空动力学的详细理解，第II-E节将探讨介观跨膜发生器对这些动力学过程的贡献，从而深化我们对海马网络内复杂突触相互作用的理解。
¶ E. 识别顺序网络水平长时程增强模式的跨膜中尺度生成器
细胞外突触激活过程中，电位分布与其对应的汇电流和源电流之间的关系，揭示了海马回路中跨膜发生器与功能性细胞集群的基本原理52。在长时程增强调控的突触事件中，这些电流幅度与持续时间的变异，为理解突触传递效能以及跨时空协调的复杂神经元集群激活机制提供了更深入的视角。要阐明这种中观尺度的突触动力学并推进对学习记忆过程的理解，具备高时空分辨率的记录方法至关重要。
图4. 网络突触活动的高阶时空动态特性。(a)–(d) 伪彩色延迟图显示CA1–CA3与DG网络在基线期和强直后阶段突触响应的空间分布。这些图谱根据突触事件相对于刺激电极的时间关系，将其分为初始簇、中心簇和末端簇。(e)–(h) 突触响应的时间聚类展示了海马各层内的精确激活时序，凸显强直刺激后响应模式的显著变化。(i)–(l) 定量分析显示强直刺激后响应延迟显著缩短且活跃电极数量增加，表明突触效能增强及网络重构。值得注意的是，先前静默区域出现新的放电电极，印证了突触网络的动态重组过程。
在此，我们构建了两种不同的时空二维图谱——基于电位的和基于核的电流源密度（kCSD）53——覆盖在模拟HD-CMOS-MEA几何结构的 网格上。该方法实现了对CA1–CA3网络中海马各亚层（SO、SP、SR、SLM）在基线状态和强直后状态下跨膜电流动态变化的量化分析[图5(a)–5(h)]。基于电位的图谱提供了细胞外场电位的高分辨率可视化，而kCSD图谱则能精确识别各层次间的特异性差异。
电流汇-源分布和极性。强直后刺激作用下，我们观察到SR层内向电流汇的显著增强——这与顶端树突兴奋性输入的强化一致——同时SP层出现更尖锐局部化和空间重构的电流源，标志着体细胞整合作用的加强。在SLM层，增强效应导致电流极性锐化及局域性源-汇耦合，可能反映了回流电流的改变或远端输入的衰减。在SO层，我们检测到电流汇活动的大范围增强和轻微的空间扩展，表明胞体周围和基底树突区室。这些具有层级特异性的突触特征反映了可塑性重组中不同亚区依赖的机制，捕捉了网络水平长时程增强如何整合于海马各层。我们CMOS-MEA平台的高空间分辨率实现了直接、大规模电流图谱绘制——无需依赖在侵入性或不可行的密集电极配置上——提供层状特异性可塑性的精确电生理读数。这些发现明确了海马体不同层次如何响应增强效应进行重组，从而建立了一种可扩展的系统级方法，用于追踪空间分辨的突触重塑。
图5. 网络突触活动与连接动态的介观尺度映射。(a)、(b)、(f) 和 (g) 显示在基线和强直后刺激条件下CA1-CA3网络中基于电位与核电流源密度（kCSD）的突触活动二维图谱。© 和 (h) 跨海马各层的细胞外电位特征，阐释了从基线到强直刺激诱发增强过程中网络层面的突触动态与连接变化。(d)、(e)、(i) 和 (j) 时间分辨的突触活动图谱，其x轴代表诱发事件的时间点，y轴对应各层内放电电极。这些图谱清晰呈现了汇点（与输入性EPSP相关）和源点（与同步神经元放电相关）的细节特征。(k) 和 (l) 将量化后的电位源汇与kCSD图谱识别结果进行对比，凸显kCSD分析在定位突触事件方面的卓越精度。该方法深化了我们对长时程增强（LTP）背景下突触传递与网络动力学的理解，揭示了基线与强直后条件下源汇值的精微差异。
此外，我们整理了强直刺激前后诱发的突触数据，将x轴与每个诱发事件的时间点对齐，y轴与特定放电电极对应。这种排列方式结合基于计算电位的数据和kCSD推导的源/汇生成器数据，提供了具有层状特异性的突触活动模式的动态时空视图[图5(d)、5(e)、5(i)和5(j)]。虽然电位图仅显示从汇到源的二元变化，但kCSD方法揭示了LTP诱导过程中更细微复杂的动态变化。通过对比强化时间线上的三个选定事件——从事件#1到强化作用回归基线最终阶段的事件#3——kCSD清晰展现了强化期间更为错综复杂的活动模式，这些模式在强直刺激后变得日益复杂且增强。这种双重映射技术实现了突触模式的分层时间解析呈现，突显了与传入EPSP相关的汇（洋红色/蓝色）以及与同步神经元放电群体锋电位相关的源（绿色/红色）。这些发现精准捕捉了突触的细微变化，为网络层面理解突触可塑性与记忆编码机制提供了更深刻的见解。
对量化潜在源和汇的比较分析与kCSD图谱所识别结果的对比，突显了这些显著差异[图5(k)和5(l)]。基于电位的分析虽能提供突触增强的整体概览，但难以精确解析突触事件的空间起源，导致在区分与精确源-汇发生器相关的EPSP和PS响应时面临挑战。相比之下，kCSD分析能更精准定位突触事件，为理解底层突触动态提供更清晰的视角。尽管这两种分析方法因信息本质的根本差异而难以直接比较，但结合使用对全面理解突触活动与连接至关重要。这种细胞外电位与重建跨膜电流的整合量化方法，提升了我们解析层级特异性突触整合的能力，从而实现对不同海马亚层如何协调全网络增强机制的精细剖析。这些发现巩固了介观尺度电流图谱在揭示记忆编码背后突触协调机制中的作用。基于这些先进见解，第二F节将探讨衰老如何改变这些突触过程，并系统分析不同海马层间的差异性影响。
¶ F. 衰老中的网络解析LTP和突触传递
研究衰老神经回路中网络层面的突触动态，对于理解衰老如何影响学习和记忆至关重要。要全面把握衰老对海马网络的影响，需要对整个海马体的突触活动进行综合性同步监测，这主要体现在长时程增强诱导过程中。方法学上的限制阻碍了人们对这些年龄相关突触改变形成更深入的认识。
在此，我们利用EvoNES通过检测CA1-CA3网络中长时程增强诱导的层次特异性反应，来探索衰老如何改变突触功能。这一方法使得我们能够细致研究突触效能与神经元失活序列，从而揭示内在衰老如何影响神经环路功能。
在建立稳定基线后，单次高频刺激在老年小鼠全网络中引发了长时程增强现象。与青年对照组相比，CA1-CA3网络中穿通通路层和辐射层的场兴奋性突触后电位均出现量化衰减[图6(a)]。值得注意的是，老年神经环路的突触可塑性较青年组显著下降，具体表现为场兴奋性突触后电位测量值的大幅降低：穿通通路层降幅为 ，辐射层降幅为 ；而青年对照组两项数值分别为 与 （ ，柯尔莫戈洛夫-斯米尔诺夫检验）。
此外，归一化电压变化的彩色编码图揭示了老年组与年轻成年组中海马SP层和SR层空间分布如何影响LTP诱发响应[图6(b)与6©]。更重要的是，对SP层和SR层突触诱发活动的定量波形分析，揭示了强直刺激诱发增强阶段中空间定位响应的振幅与斜率特征关键信息[图6(d)与6(e)]，凸显了衰老对网络突触功能的影响。这些结果支持海马回路中存在层级特异性的增强特征，而衰老会调节这种响应的强度与空间分布。EvoNES技术能够可靠检测此类层状特异性改变，为前瞻性识别电生理生物标志物——如层级依赖性波形偏移和电极激活模式——提供了框架，这些标志物或可作为衰老与神经退行性疾病中网络脆弱性的早期指标。
我们的全面检测还涵盖了CA1-CA3网络中的其他层次（即SO和SLM层），在此我们通过活跃电极数量从基线到强直后阶段的减少[图6(f)]，观察到神经元放电关联性的改变。这种空间分布放电区的缩减可能反映了老年海马环路中功能细胞集群的募集能力减弱及其诱发反应时间精确性的下降，表明突触协调功能受损。尽管我们的方法未能解析单细胞集群，但记录数据的中尺度分辨率能够捕捉群体神经元动态，从而推演出集群层面的活动模式。这些发现为衰老相关的突触响应时空结构紊乱提供了可靠的数据驱动解读，这与类赫布可塑性机制受损的论断相一致。54
总之，我们的研究结果描绘了衰老海马网络中突触可塑性的改变图景，具体表现为强化幅度降低、波形特征偏移以及功能性放电区失活。这些变化共同揭示了与衰老相关的神经回路重组，为未来研究海马体在年龄相关认知衰退中的脆弱性和可塑性韧性建立了理论框架。
¶ 三. 讨论
我们的研究标志着在利用生物传感技术解析网络层面海马回路中突触可塑性与长时程增强（LTP）时空动态的重要进展。通过将高分辨率CMOS生物传感器与先进计算工具、双向刺激记录功能相结合，EvoNES为揭示突触增强与LTP动态过程中海马各子区的交互作用提供了前所未有的洞察。凭借其作为新一代生物传感平台的革新性作用，EvoNES成功解决了传统方法（包括锐电极记录、膜片钳等技术）的关键局限性。
图6. 老化对海马网络层级突触可塑性与LTP的影响。(a) 老年与年轻标准小鼠CA1-CA3层（SP与SR）标准化网络基础fEPSPs对比，显示老年组突触可塑性显著下降。该下降现象在增强曲线下的特定层EPSP与PS模式中亦得到确认。(b)和© 标准化电压变化伪彩图呈现老年组与年轻对照组海马各子层LTP诱发响应的空间分布，揭示复杂的层特异性静息与增强依赖关系。(d)和(e) SP与SR层突触诱发活动的量化波形分析，显示强直刺激增强阶段振幅与斜率特征的老化相关改变。(f) CA1-CA3各层活跃电极计数的标准化差异（强直后 –基线 ），表明老年小鼠相比年轻对照组放电活动增幅显著减小。这些结果反映了海马网络响应能力与可塑性的老化相关缺陷。
钳制技术、细胞外场测量、传统微电极阵列与光学成像方法。这种生物传感驱动的技术进步，实现了网络层面突触动力学的精准、可扩展、无标记、全面测绘——对于解码支撑学习记忆过程的复杂细胞相互作用至关重要。本研究的一个核心优势在于能够通过直接电强直刺激，在网络层面模拟自然神经元活动，提供了高度模拟体内条件的受控离体环境。海马各层实时突触动力学的中尺度建模，为提供了关于协调突触活动如何支持记忆相关处理的新颖系统级观点，与分布式网络中既定的印迹动力学和记忆痕迹形成框架相一致36,55。
通过EvoNES技术在海马体层间提取的波形信号库进一步证实了这一系统级观点，它将特定信号类别与解剖和功能上截然不同的子层相联系。在CA1-CA3区域，始层（SO）的信号反映了由局部中间神经元和反复侧支驱动的多相响应；锥体细胞层（SP）捕获来自同步化锥体细胞放电的群体锋电位；腔隙层（SR）信号则表征着树突EPSPs来自谢弗侧支输入；而SLM反映内嗅区投射的远端EPSPs。类似地，在齿状回中，ML波形表示穿通通路激活，GCL反映同步化的颗粒细胞胞体活动，门信号则整合了更广泛的兴奋性和抑制性输入。虽然这些波形类别不能解析单细胞放电，但它们作为可重复的突触动力学中尺度模式，能够绘制LTP期间输入特异性募集的高分辨率功能图谱。
我们的研究结果突显了空间和时间依赖性如何关键地影响突触效能，揭示了塑造学习与记忆的复杂调节机制。这些发现证实了大规模神经动力学在协调记忆形成与提取过程中的重要意义，展现了神经网络的动态本质。56,57
我们阐明了海马体的功能动态，重点强调了从内侧穿通通路（mPP）到齿状回（DG）以及从穿通纤维（SC）到CA区的顺序激活的关键作用。这支持了海马体作为动态索引器的概念，通过协调良好的细胞集群精细连接遍布皮层的记忆58。我们在特定层中发现网络水平长时程增强（LTP）对记忆编码的关键作用，显著推进了对复杂神经机制的理解。这些发现强调了研究网络水平突触过程对于解析记忆形成复杂性的重要意义。本研究中采用的kCSD分析为解读海马网络响应增添了强大的空间维度。通过从高密度细胞外信号重建源-汇分布，kCSD技术实现了LTP诱导后层特异性突触激活的精细可视化。与原始电压轨迹不同，这些空间解析图谱捕捉到了跨膜电流的流向变化，揭示了海马各亚区活性通路动态重组的过程。该分析方法通过确认新增网络元件及其空间定位，对我们的波形和潜伏期分析形成了有效补充，从而强化了在环路水平对可塑性诱导重加权现象的解读。
该研究利用EvoNES的生物电传感精度，为表征漂移提供了实证依据。这一机制揭示了记忆系统的适应性，对记忆的持续更新与提取至关重要。59 该现象可能是神经元群体放电模式随时间演化的基础，表现为从基线活动模式向强直后诱导模式的转变。这种适应性对于将新获取信息整合到长期记忆中至关重要，能增强记忆网络的灵活性与韧性。60 我们的发现通过证明在长时程增强诱导过程中，兴奋性驱动的神经元群体募集以层级特异性方式发生，也可能支持记忆分配假说。61 虽然未分析单个细胞集群，但通过介观方法捕获的全网络长时程增强特征揭示了增强与抑制的选择性模式（如年轻组与老年组对比），反映了海马各层兴奋性的动态变化。值得注意的是，特定条件下观察到的失活现象可能反映了募集的差异阈值，进一步强调了特定神经元群体通过非均匀、活动依赖的机制参与可塑性及记忆编码的特性。
虽然本研究聚焦于全网络范围的长时程增强，但长时程抑制同样通过微调突触连接在记忆过程中发挥着至关重要的作用并防止记忆泛化，从而促进空间学习和信息编码。62尽管我们的研究结果强调了网络层面的长时程增强作用，该平台同样具备研究长时程抑制动态的能力。其双向刺激和高分辨率传感特性使其成为探究突触增强与抑制在记忆编码存储中互补作用的综合工具。
在衰老背景下，我们的数据揭示了突触可塑性如何受到影响：与年轻个体相比，老年个体特定海马层表现出突触传递功能和LTP诱导能力的下降。这些与年龄相关的变化为认知衰退提供了潜在的生物标志物，不仅揭示了海马区内衰老的突触基础机制，也为早期检测阿尔茨海默病等神经退行性疾病提供了重要线索。31,63
此处开展的基础研究成功揭示了突触动态与可塑性的关键方面，为一系列超越初始研究范围的未来探索奠定了基石。这些探索包括研究元可塑性64、细胞集群的互联性65，以及支撑突触可塑性的更广泛细胞机制，例如NMDA受体动态和神经调节剂的作用13。未来研究可借助我们的发现，弥合神经科学与实践类脑技术应用（如机器学习和神经形态计算）之间的鸿沟，从而增强人工智能系统的学习能力66。这种综合性研究不仅拓展了我们最初的发现，更为神经科学与技术创新的突破性跨学科研究开辟了新道路，为未来探索设定了新航向——通过深度理解神经动态，有望彻底革新神经科学的理论与应用领域。
¶ 四、方法
¶ A. 动物和饲养条件
为研究网络突触传递与长时程增强效应，实验采用12周龄（青年组）与56周龄（老年组）C57BL/6J雌性小鼠，这些小鼠均购自德国Charles River实验室。所有实验操作均遵循欧洲及德国相关动物保护法规（《动物保护法》），并获萨克森州地方主管部门批准（批准文号：25-5131/476/14）。
¶ B. 急性海马脑片制备
小鼠在断头前用异氟烷麻醉，切片制备方法参照我们先前的研究方案24–26。将大脑从颅骨中小心取出，置于冰镇的高蔗糖切片液中，随后牢固固定于定制琼脂糖基容器并安装至切片平台。使用Leica VT1200S振动切片机（德国Leica Microsystems）制备300微米厚水平脑片。切片过程在 的高蔗糖人工脑脊液（aCSF）中进行，该溶液持续通入 和 (混合气（ ），其组分浓度为（ ）：250蔗糖、10葡萄糖、 、 、 、0.5抗坏血酸、 、 、 。随后将海马-皮层脑片在 C下孵育45分钟，再于室温恢复至少30分钟。用于电诱发突触反应记录的aCSF溶液成分为（ ）： 、 、1.25 , , 10 葡萄糖, , , 并以 和 饱和。
¶ C. EvoNES平台中的细胞外诱发突触反应与网络水平长时程增强
EvoNES平台作为新一代生物传感系统，通过其定制化高清CMOS微电极阵列生物传感器（瑞士3Brain AG公司）实现刺激响应型生物传感功能。该生物传感器系统配备4096个电极，电极间距42微米，有效传感面积约7平方毫米2，专为实现高分辨率大规模神经活动图谱而设计。为建立脑组织切片与电极的接口，我们采用定制铂金竖琴结构直接固定于组织上方以确保最佳接触。为维持组织活性与实验条件稳定，我们搭建了温控灌流系统，以4.5毫升/分钟的流速持续向组织-电极界面灌注人工脑脊液，实验全程恒温37摄氏度。所有细胞外突触记录均在14千赫兹/电极的采样频率下进行。为深入研究大规模诱发突触响应与长时程增强现象，我们为EvoNES平台集成高精度零漂移三轴微操系统（芬兰SENSAPEX公司），同时采用铂铱合金双极电极（铂 ，铱 ，德国World Precision Instruments公司）。该电极尖端直径3微米，外径0.356毫米，长度51毫米，双极间距125微米，标称阻抗2兆欧，可通过调节刺激参数与定位实现局部或广泛神经通路激活。
¶ D. EvoNES技术刺激—记录方案
为产生顺序性场兴奋性突触后电位，作为生物传感工作流核心部件的双极电极被策略性地定位于齿状回的内穿质通路或CA区的辐射层，以刺激Schaffer侧支通路。平台零漂移操纵器确保的电极定位精度，凸显了针对靶向神经刺激与高保真响应采集的先进生物传感能力。实验采用单相恒压脉冲，脉冲半宽范围为70-140微秒，并同步监测诱发响应。为校准最佳刺激强度，我们通过以30秒间隔、10微安步长从20微安递增至130微安（保持相同脉冲半宽）建立输入/输出曲线。将诱发 最大场兴奋性突触后电位斜率的强度确定为基准值，并应用于基线和强直刺激诱发增强阶段。该选定强度通过0.033赫兹测试脉冲每30秒自动施加一次，直至获得持续10-20分钟的稳定基线记录。长时程增强通过单次100赫兹高频刺激序列诱导（间隔10毫秒，脉冲半宽相同）。我们在长达2小时内记录海马区诱发响应，若强直刺激诱发增强阶段的响应较基线阶段增强至少40 ，则判定为显著长时程增强。16 记录诱发突触响应后，通过光学模块化立体显微镜（德国徕卡显微系统）采集网络刺激期间与高密度CMOS微电极阵列耦合的脑切片图像，这也有助于分析组织空间构型及其与电极排布相关的集群特征。
¶ E. 数据分析
数据分析管道作为EvoNES生物传感平台的核心组成部分，开发了定制化Python脚本来处理并提取神经活动的时空模式。这一计算框架与生物传感器的高分辨率数据采集功能形成互补，能够识别并量化海马体中细微的电生理变化。所有使用的软件包扩展模块均已标注相应引用来源。
¶ 1. 面向时空分析的功能结构聚类
为分析特定海马层诱发的突触反应和长时程增强效应，我们将刺激电极配置于海马体的指定区域。根据记录数据绘制了大尺度诱发放电模式的地形伪彩图，并将其叠加在海马结构图像上。此外，通过光学显微镜采集的图像被叠放在高密度CMOS微电极阵列布局图上，以便利用Brainwave软件（3Brain AG，瑞士）实现精确定位。我们系统地将电极聚类为若干簇群，分别对应海马切片内不同的结构标志区。这些簇群覆盖了海马环路中的六个关键区域：齿状回内的分子层、颗粒细胞层和海马门区，以及CA区的起层、锥体细胞层、辐射层和腔隙分子层。
¶ 2. 波形特征的自动分类
为了系统分析不同海马层中诱发的突触响应的波形特征，我们采用了一种集成主成分分析（PCA）与均值聚类的自动分类系统24,67。该方法旨在解析从海马回路记录到的复杂波形形态，特别关注刺激后齿状回（DG）和海马角（CA）各层的响应特征。首先利用PCA对连续不同刺激事件衍生的数据进行降维处理，捕捉表征不同神经活动类型的波形主要特征，重点关注波形中最具信息量的维度及其样本间变异。随后对PCA降维数据应用均值聚类算法，将波形划分为特定集群24。每个集群对应海马特定层的诱发响应：DG区的分子层（ML）、颗粒细胞层（GCL）和门区（H），以及CA区的起层（SO）、锥体细胞层（SP）、辐射层（SR）和腔隙分子层（SLM）。该分类体系有效识别了对应不同突触活动类型（即EPSP和PS）的独特波形模式，这些模式受到内侧穿通通路（mPP）或谢弗侧支（SC）通路刺激的调控。为量化分类效能，我们通过混淆矩阵分析计算准确率，通过矩阵对角线概率均值评估平均真阳性率，该指标通过对比预测类别标签与实际类别标签得出，其概率值域为0-1，数值越高表明分类准确度与类别特异性越优。混淆矩阵结果具有说服力，显示与特定海马层相关的波形类别之间存在清晰分离界线和高度分类准确性。该流程部分通过Scikit-learn 1.0.2机器学习工具库实现，相关资源可见于GitHub (https://github.com/scikit-learn/scikit-learn/blob/main/sklea rn/decomposition/_pca.py)。
¶ 3. 基于网络的诱发突触响应时间聚类框架
为分析海马各层内诱发突触响应的时间动态，我们采用了一种聚焦于电诱发突触响应峰值时间延迟的改进时空聚类算法。该方法能识别反映突触时间协调性变化的 distinct 聚类簇，这些变化暗示了潜在的突触可塑性与功能连接。该技术还支持跨实验和动物个体分析诱发事件，并能比较多个脑片的响应特征——即使外置双极电极在刺激目标区域（内侧穿通通路或谢弗侧支）的定位存在微小差异。我们通过四阶巴特沃斯带通滤波器（ ）消除噪声与伪影干扰，同时确保波形完整性得以保留。随后采用峰值检测算法精确定位波形中各峰值的时间点，此为后续时间聚类的基础。根据峰值相对于刺激起始的时间延迟，通过层次聚类法将识别出的峰值归入三个时间簇——初期、中期与末期，依据其与刺激的时间邻近性进行组织，从而揭示不同海马层中突触激活的时间模式。为验证可靠性，我们通过分析多次实验会话中时间分组的一致性来评估聚类过程的稳健性，同时检验簇内与簇间变异性以确保时间分类的可信度。最后通过创建伪彩色延迟图谱实现时空维度突触事件分布的可视化，直观呈现不同海马区域随时间推移对刺激的响应差异。这种对从基线期到强直后阶段放电时间与电极激活变化的可视化呈现及统计分析，为理解突触激活动力学及突触可塑性内在机制提供了深刻见解。通过该方法，我们成功捕捉并阐释了突触响应复杂的时空模式，这对理解海马在学习记忆中的功能至关重要。
¶ 4. 核电流源密度 (kCSD) 分析
为利用EvoNES阐明海马层内突触活动的源与汇，我们采用了通过开源kCSD-python工具包（https://github.- com/Neuroinflab/kCSD-python/blob/master/kcsd/KCSD.py）实现的kCSD分析27。该方法特别适用于高密度CMOS微电极阵列，因其能处理任意电极分布，即使在接触失效时仍保持稳定性68。它通过正则化降低噪声对分析的影响，并考虑脑组织与覆盖脑切片盐水之间的电导率差异69。kCSD方法采用平滑核估计切片各处的电势，并利用对应交叉核将电势转换为电流源密度27。这些核函数封装了介质的导电特性与系统几何结构。
该分析的最终输出是一个与海马各层电极布局对齐的电流源密度二维空间分布图，可详细可视化突触活动。与传统基于电势的分析方法相比，kCSD增强的映射能力在检测和定位细微突触修饰方面具有更高的分辨率和灵敏度68。强直刺激后突触事件映射的清晰度和精确度，揭示了动态突触相互作用与连接性变化。将kCSD与EvoNES平台结合使用，显著推进了我们对突触响应复杂动力学的理解，这对探索神经环路功能与突触可塑性的潜在机制至关重要。
¶ F. 免疫荧光方案
固定的小鼠大脑被水平切割成14微米厚的切片，并采用既定方案进行免疫荧光处理70。冷冻切片首先在 中复水，随后使用Triton X-100进行梯度透化处理（浓度从 递减至 ，溶于PBS制成PBST）。通过将切片置于 的 M柠檬酸缓冲液（ ）中加热10分钟进行抗原修复，随后冷却20-30分钟，并在室温下用 PBST充分洗涤。切片在含 正常山羊血清的 PBST封闭液中于室温封闭1小时，随后与按1:1000比例稀释于封闭液的一抗在 黑暗环境中孵育过夜（14-16小时）。经过数次洗涤后，切片与按1:1000比例稀释于封闭液的二抗在室温孵育2小时。经 PBST和 交替洗涤后，切片在黑暗环境中用Hoechst染料（按1:1000比例从 原液稀释，赛默飞世尔）染色30分钟，以 彻底冲洗后，使用Fluoromount-G（英杰公司，德国）封片，并于黑暗环境中空气干燥过夜。最后使用指甲油（电子显微镜科学公司，德国）密封样本，通过LSM 980 Airyscan 2显微镜（蔡司，德国）进行观测。免疫标记使用的一抗包括：Tuj1（兔源，Synaptic Systems，302302，1:500）、Map2（豚鼠源，Synaptic Systems，188006，1:250）和NeuN（鸡源，Synaptic Systems，266006，1:200）。所有一抗均经过抗原修复处理以确保最佳染色效果。
¶ G. 统计分析
所有统计分析均使用Python和Originlab 2024完成。本研究中所有数据均以均值 标准误（SEM）表示。箱线图的箱体由25–75百分位数确定，须线表示5–95百分位数，其长度不超过四分位距的1.5倍。图中线条标示中位数，方块标示均值。组间差异的统计学显著性检验酌情采用Kolmogorov-Smirnov检验、单因素方差分析（ANOVA）及事后Tukey检验。P值 视为具有统计学显著性，n.s.表示无显著性差异。
¶ 补充材料
请参阅补充材料中实时伪彩图视频，其展示了大尺度基线和强直刺激诱发突触强化过程（LTP）状态。电影1显示了在谢弗侧支刺激后CA1–CA3网络中的诱发活动，而电影2捕捉了在穿通路径刺激后DG网络的动态。
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