¶ 用于从单细胞到大规模神经元网络的高时空分辨率电生理记录的有源像素传感器阵列
卢卡·贝尔东迪尼,*a 基利安·伊姆费尔德,b 亚历山德罗·马乔内,a 玛丽亚特蕾莎·特德斯科,c 西蒙·纽科姆,d 米莱娜·库德尔卡-赫普b 和塞尔吉奥·马蒂诺亚ac
2009年4月14日收稿，2009年7月1日接受，2009年7月15日作为先进文章首次在线发布 DOI: 10.1039/b907394a
本文提出一种基于芯片的电生理平台，可用于研究体外神经元制备中的微观与宏观神经环路。该技术采用 微电极阵列器件，能够以高空间分辨率（电极间距21微米）和高时间分辨率（4096个微电极时达0.13毫秒，64个微电极时达8毫秒）记录细胞外电生理活动。通过应用于体外神经元制备，我们展示了该方法如何获取神经元信号，从而研究从单细胞、微环路到大规模神经网络的多层级神经活动。该平台核心组件包括：采用类似光学成像仪CMOS工艺实现的金属微电极阵列、像素内集成低噪声放大器（11微伏 ）及高速随机寻址逻辑电路。该芯片与实时采集系统结合，可实现全阵列7.8千赫兹/电极的记录速率，并对采集信号进行实时处理。
¶ 引言
当代神经科学的核心概念之一是：主要大脑功能通过神经元的协同作用实现。单个信息要素并非由单一细胞编码，而是由细胞群体和/或动态实现的细胞集群共同编码。1 单个细胞、小型细胞网络（即微电路）与大规模细胞集群之间的相互作用机制目前仍属未知领域。2 为弥合单细胞/多细胞电生理学3与神经元群体电生理学4之间的鸿沟，亟需开发适用于离体与在体实验的新型赋能技术。5
在此背景下，微电极阵列（MEAs）作为一种有价值的实验工具，正越来越多地被使用。在神经科学研究中，无论是集成于平面基底用于体外研究6,7，还是适配于体内植入的异形基底8,9，微电极阵列都发挥着重要作用。在体外实验中，微电极阵列既可用于分散的神经元制备物10，也可用于脑切片研究11。多项研究已探索基于微电极阵列的平台在药物筛选与生物传感方面的潜在应用价值12–16。
在过去的三十年中，市售（例如德国罗伊特林根Multi Channel Systems、日本大阪松下、瑞士洛桑Ayanda Biosystems）并持续改进的微电极阵列已成为多项微技术发展的主题。17 相关研究致力于通过改进电极材料（如TiN、Pt、Au、IrOx、黑铂及近年来的碳纳米管18–20）和电极形态（如平面型、神经笼型21或尖端结构22,23）来提升记录与刺激性能。借助微电极阵列的核心特性——长期记录与双向交互，其他进展聚焦于完善其功能特征，包括集成物理化学传感器24、用于网络构型的微结构25–28以及微流控技术29,30。最新研究中，通过集成PDMS微通道来引导和隔离轴突生长，微电极阵列的记录能力已扩展至轴突信号采集领域。31
尽管旨在提升MEA设备性能的研究影响力和相关贡献日益增强，但利用该方法在空间分辨率低至细胞水平的大规模网络中绘制神经元信号传导的潜力仍未实现。这一改进需要创新性方法集成大规模高密度微电极阵列，并以足以执行尖峰检测和数据分析（如 ）的时间分辨率读取信号。事实上，当前基于薄膜技术的可用设备在空间分辨率（通常为100微米）和集成数量方面均存在局限。由于外部布线以及放大和信号调理电路的影响，微电极（数百个范围）的测量分辨率受限。在当前技术下，只有小有效区域才能实现高分辨率测量。32
我们的工作旨在克服当前时空分辨率的限制，并在体外领域验证所开发的系统。为此，我们开发了基于单片互补金属氧化物半导体技术的平台，能够以 的全帧率和 的空间分辨率（电极间距）从4096个微电极采集信号。基于有源像素传感器（APS）概念，该平台的开发、电气特性表征及初步验证均在心脏组织上完成33。本文展示了最新的APS-MEA芯片世代及其在培养神经元组织上取得的成果。图1通过示意图对该平台进行简要介绍：其两大核心要素包括（i）采用类似光学成像仪结构实现的金属微电极阵列，具有像素内集成微电极与低噪声放大器（ ）；（ii）实时采集处理板卡。基于硬件实现的图像/视频概念，信号与数据处理系统经过专门优化，可应对极大数据流（典型值为0.5Gbit/s）。该平台支持的空间分辨率相当于哺乳动物神经元胞体尺度（即微电极尺寸与 间距），在64个选定的像素-微电极上可实现高达8毫秒/像素的时间分辨率。
我们的系统性能优于文献34–36中最近提出的类似CMOS-MEA器件，因为它能够实时获取从4096个微电极采集的局部和网络层面活动的时空相关性。
¶ 结果与讨论
实验工作侧重于在神经元培养上验证该平台的性能，所展示的结果旨在突出该平台在神经生理学应用中的潜力。如图2所示，该方法采用定制微电极阵列集成高速电路，用于采集电生理图像，并从中实时提取和重建单像素活动。根据Imfeld等人先前发表的研究报告33，该芯片已通过全面的电学验证。本文采用的末代版本在整体特性上未作改变，但针对放大电路的稳定性进行了优化。系统特性总结见表1。
为了验证所开发的平台，我们使用了取自大鼠胚胎（即胚胎日：E18）的海马细胞培养物，以中高浓度接种（即最终密度为1000–1500细胞/毫米2），并进行了长期培养（最多35个体外培养天数）。随后在自发条件或化学刺激下对该实验模型进行了全面表征（参见材料与方法部分）。
图1 高分辨率电生理平台概览。该系统由三个硬件层级构成，即CMOS–MEA芯片、接口板以及配备帧捕捉器以捕获和存储视频流的工作站。
图2 高分辨率平台的工作原理。神经元在高分辨率微电极阵列上长期生长发育。通过将细胞外电压信号编码为像素数据，可快速采集细胞外电生理信号并形成连续帧序列。借助伪彩色图技术，既能基于单个像素数据实现局部活动的视频观测，也能呈现整体网络活动状态。通过整合连续帧中的单像素数据，可重建单个微电极的原始数据。
表1 APS–MEA平台特性总结
| Number of electrodes | 64× 64 |
| Electrode size | 21 μm × 21 μm |
| Electrode separation | 21 μm |
| Active area | 2.67 mm × 2.67 mm |
| Chip power consumption | 132 mW |
| Input-referred noise | 11 μVrms |
| Minimum sampling rate (4096 electrodes) | 7.8 kHz |
| Maximum sampling rate (64 electrodes) | 125 kHz |
| ADC resolution | 12 bits |
| Data rate | 0.5 Gbit/s |
从4096个微电极以 通道的采样率获取了体外神经元网络的细胞外活动记录。尽管APS-MEA与传统MEA平台相比具有更高的噪声水平（ vs. ），但仍观测到良好的信噪比（典型值5–10 vs. 10–15）。我们通过芯片表面涂层所用的粘附层（参见材料与方法）与电极位点的嵌入式结构（深度约2毫米）共同作用来解释这一现象（该研究仍在进行中）——这两种因素共同促进了神经元在电极表面的密封性。电极位点。我们无法访问像素内电极进行阻抗测量，但信噪比的结果也表明电极阻抗远低于像素内放大器输入阻抗（ TU在1.1千赫兹下）。
从接种后的第二周开始，海马培养物呈现出典型的波动网络放电频率特征，表现为快速连续的小簇发（即持续100-300毫秒的密集堆叠的尖峰活动）与静默期交替出现。如文献所述37,38，根据实验条件和发育阶段的不同，电生理活动在网络层面呈现高度同步化。本平台获取的电生理数据证明，相较于传统微电极阵列方法，其空间分辨率实现革命性提升，从而能以前所未有的精细度观测网络表达的动态模式。图3通过记录到的自发电生理活动（涵盖多达2000个微电极）生动展示了这一优势。点阵图清晰呈现了这2000个微电极的集群行为，突显出特征性簇发活动中观测到的显著活动爆发（采集时长为10分钟）。典型的振荡性准同步活动通过全网络层面的平均放电频率得到完整呈现。该采集示例展现了在数千个微电极上实现的空间（图3A）与时间（图3C）分辨率，并演示了该方法如何能够追踪神经元信号传导与传播模式。
图3 高密度成熟海马神经元培养物（铺板密度600细胞/毫升，培养27天）的自发电生理活动。（A）全局网络层面的单次爆发活动，以从采集影片（在线提供为EIS S1.A）中提取的图像序列呈现。通过计算信号方差（20毫秒时间窗）将细胞外信号以伪彩图谱显示。（B）涵盖5分钟内数次网络爆发的2000个活跃电极像素点光栅图。底部面板显示平均放电频率，呈现网络层面的准同步振荡活动。（C、D）光栅图的两处局部特写，对应（B）中红线标明的两次爆发起始点。同时展示两个代表性通道的原始数据（对应两次爆发起始），以便观察记录的电生理细胞外信号。
ESI电影S1.A–C†展示了高密度培养（最终密度约为1500个细胞/平方毫米2）的第26-28天海马神经元培养物记录样本。电影S1-A†呈现了图3所示的爆发活动及帧序列。爆发起始阶段的自发活动始于少数聚焦空间位点，随后扩散至网络内绝大多数神经元。电影S1-B和C†展示了典型活动模式案例（与电影S1-A不同制备批次），其中活动传播方向依具体爆发事件呈顺时针或逆时针方向。影片时长约9秒，呈现150毫秒的爆发传播起始过程。作为参照对比，电影S1-D†展示了传统微电极阵列（MEA，60电极，直径30微米，间距200微米，Multichannelsystems系统）记录的海马电生理活动片段。其较低的空间分辨率与有限的电极数量制约了信息传输特性与活动传播动力学的研究。尽管如此，通过所有可视为活跃状态的微电极计算所得的平均放电率（即棘波发放率 >0.1{ > } 0 . 1>0.1 脉冲/秒) 在密度和年龄相似的神经元培养物中处于相同范围。
该方法的独特记录分辨率还使得能够引入源自图像处理领域的替代分析工具，用于直接在获取的图像序列上研究神经元信号传导和激活（比较顺序爆发放电传播的示例参见ESI影片S1.B和S1.C†）。一种在不同空间分辨率下（从详细细胞水平到平均群体水平）表征神经元网络动态的前沿方法，是基于对活动图像实施的多级空间小波变换（另见材料与方法部分）。为追踪有序活动的起始与传播过程，我们通过计算不同分解层级下小波变换活动重心39，着重突出了该技术的多分辨率特性。图4展示了前40毫秒内爆发放电起始点的多级空间轨迹。较低空间分辨率 ）捕获群体水平的信号传播轨迹，而较高分辨率 ）则能追踪细胞水平的传播路径。当爆发放电起始于特定位置（无多点燃灶）时，该方法表现优异，同时还能区分不同活动模式以用于模式分类。在此示例中，三种传播模式可通过视觉直观辨识，这亦印证了不同空间层级下分类的稳健性。
图4 不同空间分辨率下的爆发动力学特征。本例中，活动重心轨迹针对点阵图所示六个连续爆发事件进行绘制。较低分辨率可监测网络的"平均"行为，而较高分辨率可在细胞层面表征网络特性。各爆发事件起始后40毫秒期间的不同分辨率重心轨迹如所示。
图5 化学诱导网络活动模式改变的高分辨率记录示例。在培养基中施加30毫摩尔/升浓度的荷包牡丹碱（BIC）后，通过对比（A）中施加荷包牡丹碱前后20分钟的点阵图，可清晰观察到其对网络活动的影响（26DIVs的皮层培养物，最终密度为1200细胞/毫米2)。（B）各电极计数峰值的伪彩色图示（黑色表示0计数，白色表示超过50个峰值）显示，荷包牡丹碱增加了活跃通道数量并扩展了相关网络区域。（C）汇总表格报告了化学诱导活动变化的主要参数。在荷包牡丹碱作用下，峰值数量和平均放电率（MFR）上升，而峰值间隔（ISI）、簇发间隔（IBI）及平均簇发持续时间均下降，表明网络活动同步性增强。簇发内峰值频率
我们还通过化学刺激进行了广泛表征，以评估与传统微电极阵列上开展的类似研究结果的对比。图5展示了化学诱导活性变化的示例性结果。该图呈现了在培养液中添加 荷包牡丹碱阻断GABA-A受体前后，从皮层网络（DIV26）记录到的两分钟神经元信号。图5A展示了对应的点阵图。正如预期且文献广泛报道的40,41，网络兴奋性增强，我们观察到活跃像素数量增加（ 增幅达 ，图5B）、爆发频率升高以及网络动态特征变化（图5C）。爆发频率和整体同步性的提升确实与既往研究结果完全一致。值得注意的是，凭借庞大的电极数量和高空间分辨率，我们发现在施加荷包牡丹碱后活跃神经元数量显著增加。本研究虽不旨在深入神经生理学机制探讨，但这一现象可被系统研究，以进一步探索自发发育神经元培养体系中爆发活动形成的机制。
相对密集的神经元培养会限制成像能力，阻碍神经元回路的清晰辨识，且无法确保电极位点与单个神经元的耦合。在这方面，低密度培养提供了独特优势。事实上，该开发系统在单神经元测量方面的高分辨率潜力，在较低细胞铺板密度制备的神经元培养物中更能得到充分体现，从而实现对功能回路的形态学识别。图6A展示了通过海马细胞神经元核与树突染色（可见黑色方框电极）获取的DIV14网络感兴趣区域图像（ 像素）。实际神经元密度在整个阵列上并不均匀，从外围到中心分别估算为150-600个细胞/平方毫米2。该细胞密度与像素-电极密度（570像素/平方毫米2）处于同一量级，从而趋近一对一的电极-神经元对应关系。图6B作为示例展示了我们设备在三个可能参与简化细胞集群或微电路的选定神经元上获取的相关电生理活动（原始数据）。这些结果虽属初步，但揭示了APS-MEA可达到的最精细观测尺度。在此特定实验配置中，免疫细胞化学成像与我们高分辨率电生理记录系统的结合，或可以单神经元分辨率研究神经微电路（即少数互连神经元）与大型神经集群（即数千细胞）中结构与功能的相互作用。
¶ 材料与方法
¶ 芯片设计与获取系统
所设计和开发的芯片能够在 毫米2的有效区域内记录细胞外电位，其空间分辨率达到该成像系统具有21毫米的分辨率（即像素间距），在全帧采集时采样频率为 通道，而对感兴趣区域（ROI）进行局部放大采集时可采用更高频率。基于最初为光学成像器开发的有源像素传感器（APS）概念，该技术通过在微电子芯片（采用互补金属氧化物半导体——CMOS——工艺实现）上集成 像素阵列，在每个像素中提供了尺寸为 微米2的微电极和第一级放大电路。在芯片上，像素输出信号经过总增益450倍的进一步放大，并通过16个模拟输出通道进行多路复用。由于像素内电路对噪声性能的主导影响，噪声水平的优化需要与像素尺寸进行权衡。对于 微米2 (的像素尺寸（电极面积 21微米2)），实现了11毫伏的静态均方根噪声。
图6 高分辨率电生理记录与免疫荧光成像相结合的技术，能够解析单个神经元及互连微环路。(A) 与我们的设备耦合的海马神经网络（培养14天）电极在培养物下方显示为黑色方块（其中一个电极被高亮标出），并经neuN（神经元细胞核-红色）和MAP2（神经元突起与胞体-绿色）染色；特定感兴趣区域图像（ 电极阵列）。(B) 参与小型微环路活动的三个选定电极的电生理信号（原始数据）。
该采集系统能够以平均62 MB/s的速度将原始数据存储为帧序列，并提供芯片控制、高速数字寻址、信号采集（12位分辨率）以及实时图像/视频处理功能。这些功能由连接商用帧捕获器（Leonardo PCI64-CL-P-FL-X300-C-128，荷兰沃登Arvoo公司）的定制平台实现。
¶ 神经元细胞培养和免疫细胞化学
在制备分离神经元培养物时，遵循了欧洲共同体委员会实验室动物护理原则（86/609/EEC）。原代培养物取自胚胎第18天（E18）的斯普拉格-道利大鼠脑组织，采用既往文献报道的方案。简言之，在无菌条件下取出胚胎并进行解剖。通过酶消化法（ 胰蛋白酶， 处理20分钟）分离皮层与海马体，最后用火焰抛光的巴斯德吸管进行机械吹打。将分离的神经元接种于预先包被聚D-赖氨酸和层粘连蛋白的APS-MEA活性区域。为覆盖 的整个活性区域，我们使用了25至40微升不同体积的细胞悬液及可变细胞浓度（即200至2000细胞/毫升）。最终获得的细胞密度约为150至1500细胞/平方毫米2。不同实验条件所获结果使我们能够探索不同的网络动态，并在低密度接种情况下实现单个神经元胞体与像素点的一一对应。一小时后，待细胞贴壁时，向每个装置添加1毫升培养基。细胞在含 Glutamax、 B-27补充剂的Neurobasal培养基（Invitrogen）中，于 、 及 空气的湿润环境下培养；每周更换 培养基。因无血清培养基可限制非神经元细胞增殖，故未使用抗有丝分裂药物。42海马及皮质神经元网络的最终密度范围为150至1200细胞/平方毫米2。自细胞培养第二周起开始记录自发放电活动。
电生理记录结束后，将细胞在室温下用 多聚甲醛PBS溶液固定，经 Triton-X100与 叠氮化钠溶液透化处理10分钟，随后在含 BSA、 Triton-X100的PBS封闭缓冲液中处理30-40分钟。接着将培养物与两种一抗混合液共同孵育2小时：兔多克隆抗MAP2抗体（Chemicon-Millipore AB5622 稀释比1:500）43及小鼠单克隆抗NeuN抗体（Chemicon-Millipore MAB377 稀释比1:200），该混合液使用封闭缓冲液稀释以降低非特异性结合。最后用以下二抗进行标记：MAP2采用Alexa-Fluor488标记的山羊抗兔抗体，NeuN采用Alexa-Fluor546标记的山羊抗小鼠抗体（稀释比均为1:1000）。
所选抗体用于表征培养物内神经元的分布与连接。MAP2免疫染色用于识别成熟神经元的树突状分枝结构，而NeuN免疫染色则用于显示有丝分裂后神经元的数量，这些神经元已开始形态分化。
¶ 数据分析
细胞外电生理神经元信号采集自海马和皮层自发活性培养组织，采用全帧分辨率（从4096个电极以 采样频率采集），记录时长为2至10分钟。在获取电生理神经元活动期间，APS-MEA平台能够观测信号传播与神经元激活现象。该系统通过将每个电极的瞬时细胞外电位编码为伪彩色图谱，实时处理采集到的电生理数据并生成动态影像。为提升神经元信号可视化对比度，系统针对采集影像的每一帧计算各电极在20个采样点上的信号方差。此外，可选择单像素电极并以多通道示波器形式显示原始数据。由此实现了活体神经信号时空动态的可视化，同时将采集的影像与原始数据存储供离线处理使用。
单通道原始数据首先通过结合连续帧的电极信号从采集电影中提取。随后，使用集成已验证算法的专用分析软件处理这些单通道原始数据，该软件专门用于处理通过集成60个微电极的微电极阵列记录的生理电信号。我们采用可靠的尖峰检测算法，以实现识别尖峰和簇发事件的高性能时间精度。44 随后利用这些尖峰事件，通过统计分析工具计算全局活动参数45,46，如图5所示针对化学刺激的示例实验所总结。
将高分辨率MEA数据解释为图像序列，为替代性和互补性分析方法开启了新途径。尽管可监测包含数千个细胞的大型培养网络，但密集集成的电极同时能够测量至细胞级别的活动。这种多分辨率特性同样可通过适当的信号处理方法得到体现，特别是通过小波分析或滤波器组理论47,48。该概念可扩展至图像领域，以便在不同关注分辨率下分割和量化原始信息，并可通过实时硬件实现49。我们可以将活动分解为用于全局（即网络）表征的粗略（平均）视图，以及多个更高分辨率视图来获取直至细胞级别的活动细节。为进一步利用功能图像序列提供的多分辨率能力，我们开发了专用算法，用于在不同分辨率下研究爆发事件时空模式的信息传输。其中一种算法包括计算所有近似值 的重心轨迹，将活动降至低分辨率j（图4）。
¶ 结论
本研究旨在验证我们用于神经元网络芯片集成电生理研究的高分辨率记录平台（APS–MEA），并展示这种大活性区域内集成的高空间分辨率所具备的潜力。
特别是，我们展示了所开发的APS–MEA装置如何用于研究同步活动、爆发启动与传播，以及如何在保留较小网络贡献和可能性的同时，有效探究全局网络水平的电生理活动，观察单神经元贡献。通过化学操作诱导不同活动模式，进一步验证了该系统，并展示了利用这一新型平台研究生化修饰网络动态、信息传递与处理的可能性，同时保持高时空分辨率。
APS–MEA平台设计用于处理4096个微电极全活性区域的记录，在这方面它优于文献中近期提出的其他CMOS系统。Hutzler等人36展示了一款连接海马脑片的芯片，该芯片包含 个电极，电极间距为7.8毫米，全帧频达2千赫。虽然该系统能够获取图像序列，但主要缺陷在于时间分辨率不足（无法解析峰值活动）以及高噪声水平（50至250毫伏 ）。近期Frey等人34提出了一种新型芯片，其特点在于拥有 个微电极和极高的空间分辨率（3500电极/毫米2）。然而，由于集成微电子电路的结构限制，用户只能选择部分电极（最多128个），因为每个选定位点在实验开始时都需主动连接至专用片上放大器。这种方案因可在较大电路区域集成放大器而实现优异的噪声性能，但阻碍了从数千个电极记录信号以及获取全网络区域信号传播功能影像的可能性。最后，电压敏感染料（VSD）代表了一种可能的替代方案。这类光学技术在空间分辨率（可达亚细胞水平）方面优于我们的方法，但当前最先进技术在相似活性区域上表现出较慢的时间分辨率、更低的信噪比，且通常存在额外的光漂白和光毒性效应50,51。
提出的APS–MEA在噪声水平、空间分辨率和记录单元数量之间实现了平衡，为研究大规模神经元群体动态提供了独特机遇。其信噪比与传统MEA观察值相当，这得益于神经元在电极位点良好的黏附与密封特性。事实上，这些优势弥补了因片上复用技术和CMOS工艺非优化电极材料带来的本平台噪声性能略逊的问题。通过纳米材料（如碳纳米管）修饰电极可改善这种对细胞黏附的依赖性——增大有效电极面积、降低电极阻抗，从而有效抑制噪声。
电极材料的优化或许还能提高APS–MEA芯片的重复使用率——目前该技术受限于电极降解问题。通常情况下，我们的器件可重复使用4-5次（每次实验持续30-40天），与传统薄膜制备的MEA（经适当清洗后可重复使用数十次）相比使用寿命较短。在良好条件下，APS–MEA并未出现持续失效的电极，仅观察到不足 的电极存在短暂功能异常。这种瞬时故障源于像素失配与电极行为微差异引起的漂移效应。由于集成电路设计持续以2.5Hz频率对像素内放大器进行校准以重置工作状态，该异常持续时间被限制在极短范围内（最长0.4毫秒） 。
需要注意的是，当前实施方案并未在所有电极中集成像素内刺激功能。该功能仅限位于有效区域边缘的专用电极使用（仍处于测试阶段）。在所有像素中集成刺激功能确实是一项重要改进，将在后续芯片版本中实现。然而，由于高度集成的微电子电路可能受到低噪声记录通路与大振幅刺激信号线路之间串扰的影响，像素内刺激功能的实施存在关键技术难点。
总之，本文提出的高时空分辨率设备，结合优化的细胞培养与微图案技术，必将成为解析神经元细胞集群的形成机制、功能意义及动态特性的有力工具。为进一步拓展该方法的应用范围，我们还在急性脑切片上测试了该平台（数据未显示），并预见可将相同理念整合于适配在体测量装置中，从而通过功能性电生理特写为脑图谱研究提供新见解。
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