¶ CACNA1A功能缺失影响人iPSC衍生神经模型中的神经发生
伊拉莉亚穆桑特1·达维德坎杰洛西2·洛伦佐穆齐3·范妮茹尔当4·马尔科迪杜卡1·萨拉圭里西1·弗朗切斯卡安东妮妮5·耶拉尔丁奇昆基拉卡斯蒂略德斯佩洛尔齐6·洛伦佐A.钦戈拉尼4·费代里科扎拉1,3·保罗斯库迪耶里1,3
收稿日期：2024年10月3日 / 修回日期：2025年4月3日 / 录用日期：2025年5月5日 © 作者（们）2025
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¶ 摘要
CACNA1A编码构成钙离子通道孔道的亚基，其功能改变与多种神经系统疾病相关，包括共济失调、癫痫和偏头痛等类型。本研究通过构建等基因iPSC来源的神经细胞系，成功导入不同程度影响剪接异构体的CACNA1A功能缺失突变。形态学、分子及功能分析揭示了CACNA1A在神经发育过程中的关键作用。我们发现不同CACNA1A功能缺失突变会导致特定的神经发育缺陷：位于通道保守结构域的F1491S突变引发完全功能缺失，在早期阶段即损害神经诱导过程——这通过神经祖细胞单细胞转录组特征的变化和神经元极化缺陷得以证实；相比之下，Y1854X突变选择性影响突触表达型[EFa]异构体，虽不影响神经诱导，但导致神经元网络组成改变及同步化活动缺失。我们的研究揭示了CACNA1A在神经诱导机制和神经网络动态调控中未被认知的新功能，并阐明了不同变异体[EFa]与[EFb]在人类神经元发育过程中的差异化贡献。
¶ 关键词
神经发育 · 动物疾病 · 体外模型 · 诱导多能干细胞 · 高密度微电极阵列 ·单细胞RNA测序
¶ 引言
基因CACNA1A编码电压门控钙通道的成孔亚基，该通道亦被称为P/Q型钙通道。这种通道在多个脑区大量表达，其中小脑和大脑皮质的表达水平最高[1-3]。在这些区域中，分布于不同类型的神经元，主要定位于突触前末梢，对神经递质释放和突触可塑性至关重要[3-7]。的功能可通过可变剪接和亚基组成变化进行精细调控，这种调控取决于发育阶段、组织类型及特定细胞环境[3-5,8-11]。特别值得注意的是，CACNA1A经历广泛的可变剪接，形成多种具有不同结构域组成、表达模式和通道特性的成孔亚基异构体[5,9,12]。例如，在通道近C末端处37a和37b这两个互斥外显子的可变剪接，可产生两种功能迥异的变体，一个类似EF-hand的结构域，命名为EFa和EFb。这些变体在表达模式上不同，其中[EFb]在神经发育早期阶段起主导作用，[EFa]仅在后期阶段表达[13,14]。此外，它们表现出不同的生物物理特性，[EFa]（而非[EFb]）经历钙依赖性易化，且以不同效能调节突触传递，其中[EFa]是更有效的变体[4,9,15,16]。
在塑造大脑发育和功能中的相关性通过广泛谱系的发作性和进行性神经系统疾病得到证明，这些疾病由CACNA1A基因的突变引起。许多杂合突变与发作性共济失调2型（EA2）、家族性偏瘫性偏头痛1型（FHM1）、脊髓小脑性共济失调6型（SCA6）以及某些自闭症谱系障碍相关[11,17–22]。最近，在患者中发现了双等位基因CACNA1A突变，伴有更严重的临床表型，包括早发性癫痫性脑病和进行性脑萎缩[23–25]。通常，CACNA1A相关疾病表现出大的表型变异性，即使在同一种疾病中也是如此，这可能是由于不同类型突变对通道功能的可变影响所致[26–36]。
异源表达CACNA1A变体，结合细胞成像、生化和电生理研究，为某些突变如何影响通道功能提供了见解[37–43]。大多数导致EA2的突变会引起功能丧失，其原因包括提前出现终止密码子导致截短蛋白质的降解、蛋白质产物异常，或错义突变损害蛋白质成熟和运输或通道开放概率及电导[18,37,39,41]。相比之下，FHM1和某些罕见的EA2类型通常与功能获得性突变相关，导致的开放概率或电导增加[40,44–46]，而SCA6与CACNA1A的C端外显子异常CAG重复扩增相关，可能诱导蛋白质的细胞毒性或因α1 ACT蛋白功能改变导致基因表达失调[43,47,48]。
尽管对不同突变在细胞水平上对通道特性的影响的理解日益增长，但与CACNA1A相关的神经功能障碍的病理机制仍有待阐明。此外，尽管基于敲除的CACNA1A基因修饰小鼠模型研究已提供了相关见解[18,49–55]，但将这些数据转化为人类疾病研究仍面临挑战，这凸显了构建合适人源化模型以阐明CACNA1A相关病理学机制及表型的必要性。
为填补这一知识空白，我们培育了携带两个的同基因型人类iPSC来源神经模型功能丧失性突变对CACNA1A剪接亚型产生差异性影响。形态学、分子及功能分析揭示了CACNA1A在神经诱导、神经元分化和成熟过程中的关键作用。此外，我们的研究结果凸显了[EFa]与[EFb]剪接变体在人类神经元细胞中的差异性贡献。本研究开发的iPSC衍生神经元模型将为涉及CACNA1A的神经系统疾病未来治疗测试开辟道路。
¶ 材料与方法
¶ HEK-293细胞培养和转染
HEK-293细胞培养于补充了10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素（完全培养基）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中，并在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中维持培养。转染实验在接种于60 mm培养皿（前一日以80,000细胞/皿的密度接种于完全培养基）且融合度达60%-70%的细胞中进行。采用钙²⁺磷酸盐法[56]进行转染，每培养皿使用12 μg DNA，转染后48小时进行后续实验。
¶ 生物素化测定和Western Blot
用冰冷PBS清洗三次后，将转染的HEK-293细胞与稀释于PBS的2 mM EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素（A39257，赛默飞世尔科技）在冰上轻柔振荡孵育30分钟。游离生物素通过100 mM甘氨酸的PBS溶液淬灭三次。随后将细胞裂解于400 μl RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl pH7.4、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS），该缓冲液补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（无EDTA完全蛋白酶抑制剂[1187358001，罗氏]；丝氨酸/苏氨酸及酪氨酸磷酸酶抑制剂[P0044与P5726，西格玛奥德里奇]）。将总裂解液在4°C下以15,000 rpm离心15分钟，取300 μl上清液与40 μl中性亲和素偶联琼脂糖珠（29,200，赛默飞世尔科技）在4°C下孵育过夜。剩余上清液保留作为输入样本。移除耗竭的裂解液（胞内组分）后，用500 μl RIPA缓冲液洗涤琼脂糖珠四次，最后用2×凝胶上样缓冲液（10% SDS、50%甘油、300 mM Tris-HCl pH6.8、0.005%溴酚蓝、10%β-巯基乙醇）在70°C下洗脱沉淀蛋白（生物素化胞外组分）10分钟。
蛋白质通过SDS-PAGE使用5%丙烯酰胺凝胶进行分离，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。与兔源一抗（抗Ca₂.₁抗体（1:500；152,203，Synaptic Systems）或兔源抗β-微管蛋白III抗体（1:1,000；T2200，Sigma Aldrich））孵育后，将膜与HRP标记的兔二抗（1:5,000；31,460，Thermo Fisher科学）共同孵育，免疫复合物通过化学发光底物（RPN2106，ECL Prime Western Blotting系统（GE Healthcare公司））检测。化学发光信号通过ChemiDoc成像系统（伯乐公司）采集，并利用ImageJ软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/，美国国立卫生研究院）进行定量分析。
¶ 生成携带CACNA1A突变的同基因诱导多能干细胞系
为了生成携带CACNA1A变异的诱导多能干细胞(iPSC)系，我们使用了从Applied干细胞公司购买的对照iPSC系，目录号：ASE-9211。对照iPSCs在玻连蛋白包被板和Essential 8 Flex培养基（A2858501，赛默飞世尔科技）中维持培养，每周两次以1:5比例传代，通过Versene解离。供体信息：年龄：新生儿；性别：男性；种族：非裔美国人；临床信息：正常/健康。
携带F1491S突变的同基因iPSC株系(Chr19:13,257,474 T > C)或Y1854终止(Chr19:13,228,768C > G)由应用干细胞公司通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑服务生成。gRNA序列及基因编辑所用的供体{v*}已在资源表格（补充信息文件）中报告。iPSC克隆经筛选和扩增后，通过桑格测序确认目标{v*}突变的存在，同时使用SurePrint G3人类CGH微阵列试剂盒180 K (G4449 A, 安捷伦)进行阵列比较基因组杂交分析，未检测到染色体重排。成功获得两个独立的F1491S突变克隆，而仅获得一个Y1854X突变克隆，可能由于CRISPR对得分低的外显子37a序列的靶向效率较低。
¶ 生成iPSC衍生的NPCs
iPSC来源的神经祖细胞通过双重抑制SMAD信号传导生成，使用STEMdiff神经系统研究试剂盒（STEMCELL Technologies），根据制造商说明操作。简要步骤：通过StemPro™ Accutase™细胞解离试剂（A1110501, Thermo Fisher Scientific）孵育5分钟分离iPSC集落，使用DMEM/F12培养基（11,330,057，赛默飞世尔科技）移液收集细胞，制备单细胞悬液。然后将细胞以300 g离心5分钟，在添加了RevitaCell（A2644501, 赛默飞世尔科技）的STEMdiff神经诱导培养基+SMADi（08581, STEMCELL Technologies）中重悬。每孔接种3×10⁶个细胞于AggreWell 800孔板（34,811, STEMCELL Technologies公司），总体积为2毫升。将培养板以100×g离心3分钟使细胞捕获于微孔中，连续5天每日更换四分之三培养基。在此期间，聚集于孔底的iPSCs形成胚状体（EBs）。收集胚状体并接种至经Geltrex™基质胶（A1413302，赛默飞世尔科技）包被的6孔板中，继续培养7天形成神经玫瑰花结。随后使用STEMdiff神经玫瑰花结分离试剂（05832，STEMCELL Technologies）解离神经玫瑰花结，并转移至Geltrex包被的6孔板孔内。从神经玫瑰花结中生长的神经祖细胞（NPCs）培养5-7天，经Accutase酶解离制备单细胞悬液，以1×10⁶/孔的密度接种至含STEMdiff神经祖细胞培养基（05833，STEMCELL Technologies）的6孔板中，记为第1代NPCs。神经祖细胞扩增期间每隔一日更换神经祖细胞培养基。
¶ 生成iPSC来源的神经元
同基因对照和突变神经祖细胞以相对较低的细胞密度（2×10⁴个细胞/平方厘米）接种于Geltrex包被的载体上（免疫荧光分析用腔室玻片或RNA提取用24孔板），所用培养基为STEMdiff神经祖细胞培养基，以便在分化初期的数周内对发育中神经元进行形态学分析。24小时后，更换为添加GlutaMax补充剂（1:100）、B-27补充剂（1:50）、BDNF（10纳克/毫升）、GDNF（10纳克/毫升）、视黄酸（1μ摩尔）、抗坏血酸（200μ摩尔）及CulturOne补充剂（1:100）的Neurobasal培养基（21,103,049，赛默飞世尔科技）。持续培养期间每周更换两次半量培养基。从第5分化天（DIV：神经祖细胞接种后的分化天数）起，将Neurobasal培养基和B-27补充剂更换为Neurobasal Plus培养基（A3582901，赛默飞世尔科技）和B-27 Plus补充剂（A3582801，赛默飞世尔科技）。随后在7至42分化天期间的不同时间点固定神经元培养物，通过特定标志物的免疫荧光检测进行形态学表征。
在对对照组和Y1854X细胞进行高密度微电极阵列电生理记录及单细胞转录组分析时，为避免长期培养过程中形成细胞团块，对接种方案稍作调整。具体而言，将神经祖细胞在Geltrex包被的培养瓶中汇合培养48小时，培养液为添加GlutaMax补充剂（1:100）、B-27补充剂（1:50）、BDNF（10 ng/ml）、GDNF（10 ng/ml）、视黄酸（1μM）的Neurobasal培养基。随后收集细胞，以1.4×10⁵细胞/平方厘米的密度接种于多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的载体（电生理记录采用Accura HD-MEA，3Brain AG；单细胞转录组学采用12孔板），并使用添加GlutaMax补充剂（1:100）、B-27补充剂（1:50）、BDNF（10纳克/毫升）、GDNF（10 ng/ml）、视黄酸（1μM）、抗坏血酸（200μM）和CulturOne补充剂（1:100）的新鲜Neurobasal培养基继续培养。培养基更换计划（每周两次半量换液）及配方（从第五天起使用Neurobasal Plus培养基和B-27 Plus补充剂）保持不变。35 DIV后，从培养基配方中去除CulturOne补充剂和抗坏血酸。
¶ 实时定量PCR
总体和异构体特异性CACNA1A的mRNA量化通过实时定量PCR进行，RNA提取使用RNeasy Mini试剂盒（74,104, Qiagen），根据制造商说明书操作，使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）测定RNA浓度。实验采用250ng总RNA进行后续操作。
使用iScript™ cDNA合成试剂盒（1,708,891，伯乐）进行cDNA合成。所使用的正向和反向引物序列列于关键资源表中。PCR在CFX-96实时荧光定量PCR仪（伯乐）中进行，使用SsoFast EvaGreen Supermix（货号1,725,201，Bio-Rad）。
¶ 同基因型iPSC细胞系的免疫荧光和细胞成像
同基因对照与突变iPSC株系的质量控制包括通过免疫荧光检测和定量经典未分化状态标志物。为此，将iPSC株系接种于玻连蛋白包被的8孔腔室玻片（80,841，Ibidi）中，使用Essential 8 Flex培养基（A2858501，赛默飞世尔科技）。48小时后，用PBS清洗iPSC，并加入200μl 10%中性缓冲福尔马林（05-01005Q，Bio-Optica）室温固定5分钟。PBS冲洗3次后，用0.3% Triton X-100的PBS溶液透化5分钟，再用1% BSA的PBS溶液封闭2小时，随后于4°C条件下与200μl一抗溶液（含1% BSA的PBS稀释）共同孵育过夜。使用的一抗及稀释比例如下：兔源OCT4抗体（703,927，赛默飞世尔科技）1:500、鼠源SSEA4抗体（MA1-021，赛默飞世尔科技）1:500、鼠源TRA-1-60抗体（MA1-023，赛默飞世尔科技）1:250、大鼠源SOX2抗体（14–9811-82，赛默飞世尔科技）1:250。一抗孵育后，用PBS冲洗细胞3次，再与200μl二抗溶液（Alexa Fluor标记抗体，赛默飞世尔科技，用含1% BSA的PBS按1:200稀释）避光孵育1小时。PBS重复冲洗3次后移除腔室，用含DAPI的Fluoroshield封片剂进行细胞核染色。
图像采集使用激光扫描共聚焦显微镜TCS SP8（徕卡显微系统）和Eclipse TiE自动化显微镜（尼康）分别获取高分辨率代表性图像和进行定量分析。图像分析采用NIS Elements AR软件中的通用分析包。在应用固定参数的背景扣除和自动对比度后，使用阈值和形态分离工具进行图像分割以检测并计数细胞核（DAPI染色）。通过细胞核掩膜与核标记物掩膜之间的"与"运算进行联合分析，以量化OCT4和SOX2阳性细胞的百分比。在进行此类联合分析前，先对二值化细胞核掩膜执行膨胀（1.5μm）函数以界定细胞体，并计数表面抗原SSEA-4和TRA-1-60呈阳性的细胞。每个样本及标记物在神经诱导前的细胞传代阶段均分析了2000-6000个细胞。
¶ 神经祖细胞（NPCs）
在第3代时检测NPC细胞系经典神经祖细胞标志物的表达。将细胞接种于Geltrex包被的8孔腔室玻片（Ibidi），48小时后固定，固定流程与iPSCs所用方案相同（参见上文）。使用以下一抗及稀释比例：小鼠抗PAX6抗体（MA1-109，Thermo Fisher Scientific）1:200，兔抗SOX1抗体（MA5-32,447，Thermo Fisher Scientific）1:200，兔抗SOX2抗体（PA1-094X，Thermo Fisher Scientific）1:500，小鼠抗Nestin抗体（MA1-5840，Thermo Fisher Scientific）1:500。
图像采集和分析按照iPSC系的方法进行，以量化表达神经标记物的NPC百分比。此外，在图像分割后，针对每个标记物在单细胞水平提取了平均荧光强度。每个样本和标记物在终末分化前的3个细胞传代周期（P2-P3-P4）中分析了2000-6000个细胞。
¶ 神经元
神经元在Geltrex预处理的μ-Slide 8孔板（80,806，Ibidi）中培养，随后参照与iPSCs和NPCs相同的实验方案在不同时间点进行固定与染色。使用的主要一抗及稀释比例如下：豚鼠抗β3-微管蛋白抗体（302 304，Synaptic Systems）1:200、小鼠抗NeuN抗体（MAB377，Sigma Aldrich）1:100、豚鼠抗MAP2抗体（188 004，Synaptic Systems）1:500、小鼠抗神经丝标志物SMI-312抗体（837,904，BioLegend）1:100、小鼠抗GFAP抗体（173 011，Synaptic Systems）1:500、兔抗Ki67抗体（ab15580，Abcam）1:100。
图像采集与分析采用iPSC和NPC系的描述方法进行。NeuN阳性细胞百分比的测定方法同iPSCs实验中的核标记。对于神经突生长测量，膨胀函数（2.5μm）被应用于细胞核二值掩码以定义细胞体，随后通过测量减去细胞体（胞体）后的MAP2阳性区域并归一化到图像中的总细胞数上。轴突规格通过SMI-312阳性面积减去胞体和神经突区域后的面积量化。每个样本、标记物和生物学重复分析100–1000个细胞。
¶ 通过流式细胞术检测细胞凋亡
对照和突变型NPC或神经元用Accutase酶轻柔消化后，根据制造商说明书（膜联蛋白V FITC凋亡检测试剂盒，产品编号：BMS500 F1-100，Thermo Fisher Scientific）进行膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色。洗涤后立即使用贝克曼库尔特CytoFLEX SRT流式细胞仪进行细胞悬液分析。通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）排除碎片并评估细胞活性。膜联蛋白V-FITC荧光在FL1通道（530/30 nm）检测，PI荧光在FL4通道（670/30 nm）检测。数据采集至少包含10,000个事件，并使用Kaluza软件进行分析。结果以凋亡细胞（膜联蛋白V阳性/PI阴性）占总细胞群体的百分比表示。
¶ 伤口愈合和增殖测定
NPCs被接种到Geltrex包被的8孔微载玻片中（80,806, Ibidi），2.5×10⁵细胞/孔，并生长至汇合。然后使用无菌的200-μl微量移液器吸头制造划痕伤口。在指定时间点通过尼康Eclipse TiE自动化显微镜采集明场图像，对伤口闭合情况进行自动化评估。伤口间隙面积使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院）通过应用查锐化处理工具和分析粒子工具量化。
在划痕实验后的24小时内，通过向培养基中添加10μM BrdU（ab142567，艾博抗）评估NPCs增殖情况。24小时后，用PBS清洗NPCs，10%中性缓冲福尔马林固定5分钟，室温下用含2M HCl的0.1% PBS-Tween处理30分钟。PBS冲洗3次后，用0.3% Triton X-100透化5分钟，再用含1% BSA的PBS封闭1小时。随后，将细胞与按1:250比例稀释于1% BSA-PBS溶液的大鼠抗BrdU抗体（ab6326，艾博抗）在4°C下孵育过夜。PBS再次冲洗3次后，于暗室环境中室温孵育1小时，孵育液为含1% BSA的PBS溶液、按1:500稀释的Alexa Flour-488偶联二抗（A-21208，赛默飞）及1μg/毫升Hoechst 33,342（用于标记细胞核）。冲洗后使用尼康Eclipse TiE自动显微镜对NPCs成像，并通过尼康NIS Elements AR软件中的通用分析工具计算BrdU阳性细胞百分比。
¶ 细胞凋亡分析
在10 DIV时，对按照免疫荧光分析条件培养的NPC和神经元进行凋亡评估。通过裂解的caspase‑3检测细胞凋亡免疫荧光：对照组和突变组神经元在Geltrex包被的μ-Slide 8孔板（80,806，Ibidi）中培养10天后，按照上述相同方案进行固定和染色。使用以下一抗及稀释比例：小鼠抗PAX6抗体（MA1-109，Thermo Fisher Scientific）1:200（作为早期神经元标志物），兔抗活性Caspase-3抗体（AF835，R&D System）1:500（作为凋亡细胞标志物）。
图像采集和分析如上所述进行。凋亡细胞百分比测定方法与iPSCs、NPCs和神经元中其他核标记物的定量方法一致。
¶ 单细胞转录组学
¶ 单细胞样本的制备、文库构建和测序
iPSC来源的NPC或神经元经PBS清洗后，使用accutase解离5分钟获得单细胞悬液。将单细胞重悬于不含的PBS缓冲液（含0.04% BSA），经70μm Flowmi™细胞筛（734–2709, VWR）过滤后，采用LUNA-II全自动细胞计数仪（Logos Biosystems）进行计数。根据制造商操作手册（User Guide—Rev E），将细胞悬液加入Chromium Next GEM Chip G（10× Genomics），通过Chromium Controller（10× Genomics）制备单细胞凝胶珠乳液。实验采用Chromium Next GEM Single Cell 3Kit v3.1与Chromium™ Next GEM Chip G Single Cell Kit（10× Genomics）进行cDNA文库构建。
最终文库使用高灵敏度D5000屏幕胶带在TapeStation4150系统（安捷伦科技）上对cDNA质量进行评估。文库质量通过高灵敏度D1000 Screen Tape（安捷伦科技有限公司）进行检测。最终文库在Novaseq6000测序仪（20,028,319,Illumina）上进行测序，使用S1流动池100循环试剂盒，采用双端测序模式（read1：28 bp；read2：测序深度为每个细胞50,000条读数）。
¶ 单细胞RNA测序数据预处理和可视化
原始测序数据（FASTQ文件）通过Cell Ranger [57]版本7.2.0处理，获取特征-条形码矩阵。GRCh38-2020-A被用作参考转录组，用于比对FASTQ文件中的测序序列。来自Cell Ranger计数流程报告中的预估细胞数量、每个细胞的平均读段数和每个细胞的中位数基因数据被用作评估数据质量控制的指标。单细胞RNA测序数据文件被导入、标准化、缩放并使用Seurat R包[58]版本5.1.0进行聚类。细胞异质性通过均匀流形逼近与投影（UMAP）[59]进行可视化。
¶ 在scRNAseq细胞簇中识别标志基因
在R包Seurat [58]中，使用参数为“only.pos = TRUE, min.pct = 0.25”的函数“FindAllMarkers”来识别标记基因。每个细胞簇的前10个标记基因被选择，并通过函数“DoHeatmap”进行可视化。
¶ 单细胞RNA测序细胞注释和基因调控网络推断
使用ScType方法[60]进行细胞身份注释。采用“脑”细胞标记进行细胞注释。聚类中ScType评分低于细胞数量四分之一或ScType分数为负值的细胞被视为低置信度细胞类型注释，分配给“未知”细胞类型[60]。
为深入了解驱动细胞异质性的机制，通过单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC）[61]评估每个细胞中基因调控网络的活动。使用Docker配置的Nextflow流程，参数设置为“TFs: hs_hgnc_curated_tfs.txt, motifs: motifs-v10nr_clust-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl, db: *feather, hr_min_genes: 1”。其中采用genome-ranking.feather和hg38_refseq-r80_10kb_up_and_down_tss.mc9nr.genes_vs_motifs.rankings.feather作为共表达模块和基序的预计算数据库富集。函数“calcRSS”被用来计算调控子特异性得分。函数“binarizeAUC”用于对调控元活性进行二值化处理。ComplexHeatmap R软件包用于可视化二值化调控元活性。
¶ 通过高密度微电极阵列记录进行电生理分析
神经元网络活动的细胞外记录采用Accura HD-MEAs（3Brain AG）高密度多电极阵列完成，该阵列具有3.8毫米×3.8毫米的活性区域，包含4096个CMOS电极，并配合BioCAM DupleX（3Brain AG）仪器使用。在类培养箱条件（37°C、5% CO₂）下，于21至60天体外培养期间每周使用BrainWave 5软件记录五分钟全帧原始电生理信号。数据采样频率为20 kHz。通过评估每个培养体系的阵列总放电率，呈现培养体系整体活动概况。完整记录被划分为1秒时间窗，对每个时间窗内检测到的峰值总数进行评估后除以时间窗长度。
在尖峰检测方面，采用BrainWave 5中实现的精确定时尖峰检测算法（PTSD）。设置阈值为噪声标准差的8倍（THsd），峰值存活期为1毫秒，不应期为1毫秒，并将时间戳标记于动作电位的最高峰点。平均放电率的计算方式为各电极所检测到的尖峰总数与记录时长的比值；仅当电极平均放电率≥0.1次/秒时被视作有效电极纳入分析。平均簇发放率通过有效通道内检测到的所有簇发事件总数（定义簇发为连续3个尖峰且相互间隔不超过100毫秒的序列）与记录时长的比值计算；仅当电极平均簇发放率≥0.1次/分钟时被认定为簇发电极。平均簇发时长为器件内所有检测到簇发持续时间的平均值。随机尖峰占比通过非簇发尖峰数量与尖峰总数的比值计算。同理，簇发通道（电极）占比通过簇发电极数量与有效电极数量的比值计算。网络中发生的同步事件（定义为网络簇发）检测方法参照先前文献[62]。尖峰检测后的所有数据分析均通过定制Matlab脚本完成。
¶ 量化与统计分析
数据以代表性图片和定量图表形式展示，报告单个数据点和/或来自不同生物学重复获得的均值±标准误。每次实验的具体生物学重复次数已在图注中标明。为评估数据组间的显著性差异，采用Kolmogorov-Smirnov检验评估正态分布，继而使用双尾学生t检验比较各突变株系与等基因对照，或使用单因素方差分析（后接Tukey事后检验）用于超过两组的情况。
¶ 结果
¶ 携带CACNA1A功能丧失突变的等基因iPSCs
为模拟CACNA1A缺陷，我们选择了两种可诱发严重型EA2的CACNA1A功能缺失突变（图1A）[37,41]。F1491S突变位于由组成型外显子编码的结构域中，因此会影响所有CACNA1A亚型。与之相反，Y1854X突变位于近端C末端结构域，该区域由互斥外显子37a编码，因此仅影响包含该外显子的亚型（[EFa]），而不影响包含互斥外显子37b的亚型（[EFb]；图1A）。既往研究报道这两种突变均会消除钙通道活性[37,41]。然而，无义突变的功能缺失效应可直接归因于蛋白质功能域中的提前终止密码子，但F1491S导致功能缺失的机制仍不明确。为此，我们在HEK-293细胞中进行异源表达实验，随后进行细胞表面生物素化与蛋白质印迹分析。发现在总细胞裂解液中，野生型与F1491S突变型的表达水平相当；但在质膜组分中，突变蛋白的表达量显著降低（图S1），提示F1491S突变损害了向细胞表面的运输过程。
为了研究CACNA1A功能丧失突变对人类神经发生的影响，我们构建了一套携带F1491S（Chr19:13,257,474 T > C）或Y1854X（Chr19:13,228,768 C > G）突变的等基因iPSC细胞系，通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术实现（图1B-C）。所有iPSC细胞系通过桑格测序验证以确认所需突变的存在，通过阵列比较基因组杂交验证基因组编辑和克隆选择过程后的基因组稳定性，以及通过免疫荧光检测和分析经典干细胞标志物（OCT4、SSEA4、TRA-1–60和SOX2）。每次编辑都导致了纯合突变，并且所有iPSC系都保持了基因组完整性，并显示了未分化状态标记物的均匀表达（图1B和C）。
¶ CACNA1A突变影响iPSC来源神经细胞中CACNA1A的表达
同基因对照和突变iPSC系通过分化方案生成神经模型，该方案涉及依次生成胚状体、神经玫瑰花结、神经祖细胞和神经元（图2A）。基于其增殖和自我更新能力，神经祖细胞在最终分化为神经元之前，于第1至4代间进行扩增、冷冻保存和测试（图2A）。
我们首先检测了CACNA1A在从iPSCs分化为神经元过程中的表达。在对照组细胞中，iPSCs和NPCs中检测到的CACNA1A mRNA水平相近，而在神经元中显示10倍增加（图2B）。与同源对照组相比，突变型iPSCs和NPCs中未发现CACNA1A表达差异，但在携带Y1854X的iPSCs及携带任一突变的NPCs中观察到轻微（无统计学显著性）的下降（图2B）。相比之下，F1491S和Y1854X神经元中CACNA1A表达显著降低，较对照组分别下降5倍和4倍（图2B）。接着我们研究了包含37a和37b外显子的可变转录本表达。对照组细胞中，[EFa]和[EFb]变异体在NPCs阶段均已表达，并在神经元中增加，其中[EFb]是两个神经发育阶段的主要变异体（图2C）。携带F1491S的细胞显示两种亚型表达水平降低（对照组与F1491S神经元中[EFa] mRNA水平分别为2.38±0.34和1.46±0.05；p < 0.05，Student t检验；[EFb] mRNA水平分别为117.29±12.89和28.9±6.2；p < 0.01，Student t检验；图2C）。相反，Y1854X突变细胞中[EFa]亚型几乎完全缺失，表明37a外显子的提前终止密码子在这些细胞中引发了无义介导的mRNA降解（图2C）。该突变体的[EFb]亚型在NPCs阶段表达量与对照组相当，在神经元中降至约35%（对照组与Y1854X神经元中[EFb] mRNA水平分别为117.29±12.89和40.47±9.64；p < 0.05，Student t检验；图2C）。
¶ 携带CACNA1A突变的iPSC衍生神经祖细胞表现出改变的迁移能力
接下来，我们评估了神经标记物的表达以及神经前体细胞（NPCs）的迁移能力（图3）。通过免疫荧光结合共聚焦显微镜技术及标记物强度的单细胞分析，我们发现所有NPC细胞系中SOX1、PAX6、SOX2和巢蛋白均呈现正确定位与高表达（图3A、B）。为检测NPCs的迁移能力，我们在融合NPCs培养层上进行了伤口愈合划痕实验。值得注意的是，F1491S-NPCs的迁移速度显著快于对照组，划痕后仅18-24小时伤口区域即近乎闭合（图3C、D）。Y1854X-NPCs迁移速度略快于对照组细胞，在划痕后30小时伤口面积出现显著差异（图3C、D）。为探究增殖能力差异的可能影响，我们还进行了增殖实验。如图3E所示，两组细胞在划痕后24小时掺入溴脱氧尿苷(BrdU)的细胞比例中未检测到明显差异。综上所述，这些发现表明CACNA1A功能缺失增加了神经祖细胞的迁移能力，尤其是在F1491S变体的情况下。
图1 携带CACNA1A功能缺失突变的同基因iPSC细胞系。(A)显示通道拓扑结构的示意图，标注了F1491S和Y1854X突变位点。F1491S位于由组成性外显子编码的结构域中，因此影响所有CACNA1A亚型。Y1854X位于由选择性外显子37a编码的C端结构域，特异性影响[EFa]亚型。(B)通过CRISPR/Cas9基因组编辑引入指定突变的iPSC细胞系桑格测序结果。在gRNA结合位点同时引入沉默突变以防止重复切割。©显示同基因对照与突变iPSC细胞系未分化状态标志物分析的代表性共聚焦图像（上图）及统计图表（下图）。标尺：10微米。通过免疫荧光对典型干细胞标志物OCT4、SSEA4、SOX2和TRA-1-60进行定量分析。在神经诱导前代次的细胞中，每个标志物和样品至少分析2000个细胞。柱状图显示数据为平均值±SEM，同时将单次生物学重复数据以散点形式叠加显示（n=3）
图2 CACNA1A突变影响iPSC衍生NPC和神经元中CACNA1A转录本的表达。(A) 典型明场图像（上图）和放大区域（下图），显示对照组iPSC集落、神经祖细胞（NPC）和神经元的标准形态。比例尺：100微米。(B) 通过实时定量PCR对对照组和突变型iPSC、NPC及神经元（42 DIV）中CACNA1A mRNA的定量分析。数据以PPIA和RPL13A作为参照基因进行标准化，并以同源对照组iPSC作为参照样本。数据表示为均值±SEM（柱状图）和单次重复数据点（散点）。，p < 0.01对比对照组（学生t检验，n=4）；#，p <0.05；###，p < 0.001神经元对比神经祖细胞（学生t检验，n=4）。© 通过实时定量PCR使用异构体特异性引物在对照和突变的神经祖细胞和神经元（42天体外培养）中对Ca₂.₁[EFa]（左）和Ca₂.₁[EFb]（右）替代异构体进行定量分析。数据通过以PPIA和RPL13A作为参考基因的表达进行归一化，并以对照神经祖细胞作为参考样本。数据以平均值±标准误（条形）和单个重复（点）表示。*，p < 0.05；，p < 0.01；***，p < 0.001对比对照（学生t检验，n=4）。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p <0.001对比神经祖细胞（学生t检验，n=4）
图3 CACNA1A突变改变NPCs的迁移能力。
（A）对照和突变iPSC衍生NPCs的代表性共聚焦图像，显示典型神经前体细胞标志物SOX1、PAX6、Nestin和SOX2的表达。细胞还使用DAPI进行复染以标记细胞核。比例尺：20μm。（B，顶部）点图显示从单细胞免疫荧光图像中量化的指定核标记物相对表达水平（每个标记和样品在3次细胞传代期间（从P2到P4）至少分析2000个细胞）。(B，底部) 条形图显示每个标记和样本中阳性NPCs的百分比。叠加的点表示生物学重复(n=3)。(C-D)通过伤口愈合实验分析细胞迁移。代表性汇合神经祖细胞受伤区域的图像（C）及指定伤后时间点的伤口愈合情况分析（D）。伤口边缘通过图像分割分析识别，用绿色轮廓标出。比例尺：500微米。*，p < 0.05，F1491S组与对照组相比；#，p < 0.05，Y1854X组与对照组相比（学生t检验，n=3）。（E）通过BrdU检测评估细胞增殖情况的分析图。数据以平均值±SEM（条形）和单次重复数据点（散点）表示。将每个突变组与对照组比较，通过学生t检验未发现统计显著性差异（n=3）◂
¶ F1491S突变，但不是Y1854X突变，损害神经元诱导和极化
为研究神经元诱导和成熟过程，我们将对照及突变型NPCs诱导分化为混合神经元培养物，并在不同发育时间点通过多种神经元标记物的免疫荧光进行监测。如图4所示，在早期分化阶段（10 DIV，即体外分化10天），所有细胞系均表达细胞骨架标记物TUBB3和细胞核标记物NeuN（RBFOX3），且阳性细胞比例相近（图4A、B）。此阶段，对照组和Y1854X突变细胞均已开始极化，逐渐形成典型的神经元样形态，具有明显的树突与轴突延伸，MAP2和SMI-31染色结果可证实这一点（图4A、B）。
在更成熟的阶段（42 DIV，即体外培养42天），大多数对照组和Y1854X细胞均表达成熟神经元标志物（MAP2）或星形胶质细胞标志物（GFAP），形成错综复杂的神经元和神经胶质网络，且仅有少数细胞（<1%）对增殖标志物Ki67呈阳性（图4C）。相比之下，携带F1491S突变的培养物呈现出较少且形态异常的细胞：10 DIV时，这些细胞数量减少，形态改变，表现为胞体更大、细胞延伸更少（图4A）；通过膜联蛋白V/PI染色或裂解型caspase-3检测评估细胞凋亡，发现F1491S组凋亡细胞数量显著多于对照组和Y1854X组（基于裂解型caspase-3检测，对照组、F1491S组、Y1854X组神经元凋亡细胞百分比分别为3.70±0.49、8.91±1.77、3.60±0.38；图S2）。
对MAP2和SMI-31的表达及定位分析显示，F1491S组通过MAP2评估的神经突区域显著减少，且SMI-31抗体标记的轴突缺失，反而出现细胞核染色（图4A、B）。培养至42 DIV时，携带F1491S突变的培养体系仍与对照组及Y1854X组存在显著差异，具体表现为非神经元形态特征，且部分细胞同时表达MAP2与GFAP（图4D）。这些结果表明，F1491S突变（而非Y1854X突变）会导致细胞缺失，并在神经元诱导、极化及神经元向胶质细胞定向分化过程中引发严重缺陷。
为验证上述发现，我们获取了更多携带F1491S突变的iPSC克隆，并将其分化为NPCs和神经元。重要的是，在第二个F1491S克隆中，我们再次证实了NPC迁移能力改变和神经元生成受损的现象（图S3和S4）。
图4 CACNA1A功能丧失（F1491S突变而非Y1854X突变）损害神经元极化和成熟。(A) 10 DIV时对照组和突变型iPSC来源神经元的代表性共聚焦图像。细胞使用针对TUBB3和NeuN（上图）或MAP2和SMI-31（下图）的抗体染色，作为神经元成熟的标志物。细胞还使用DAPI复染以标记细胞核。比例尺：20 μm。（B）放大面板A中虚线矩形区域的图像细节，显示对照组和Y1854X神经元中MAP2和SMI-31的染色情况。白色箭头指示MAP2阴性且SMI-31阳性的轴突实例。（C）图表显示10 DIV时NeuN阳性细胞百分比、神经突生长（神经突区域）及轴突规格（SMI-31区域）的定量结果。数据以平均值±SEM（条形）和单次重复数据点（散点）表示。，p < 0.01；*，p < 0.001，与对照组相比（学生t检验，n=3）。(D) 42 DIV时对照组和突变型iPSC来源神经元的代表性共聚焦图像。细胞使用针对MAP2（神经元标志物）、GFAP（胶质细胞标志物）和Ki67（增殖细胞标志物）的抗体染色。细胞还使用DAPI复染以标记细胞核。比例尺：50 μm
¶ F1491S突变改变了神经前体细胞的发育
为探究F1491S突变细胞中早期神经发育缺陷的内在机制，我们通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了神经祖细胞培养物的分子特征。结果显示，与同基因对照组相比，F1491S神经祖细胞呈现出高度差异化的细胞组成，尤其在主要神经干细胞与祖细胞类型方面（图5A-D）。已注释细胞簇的主要标志物见图S5A，所选神经标志物的表达情况如图5E所示。
对照组神经祖细胞中富集的主要细胞类型包括施万前体细胞、放射状胶质细胞和成神经细胞，而这些细胞类型在F1491S神经祖细胞中完全缺失（图5C-D）；相反，F1491S神经祖细胞富集了被注释为癌细胞、小胶质细胞、神经祖细胞、内皮细胞和星形胶质细胞的类型，这些细胞类型在对照组中均未出现（图5C-D）。
针对F1491S组中癌细胞意外成为主要细胞类型的现象，我们通过scRNA-seq数据的差异表达分析检测了其特异性标志物。在表达倍数变化较大且pct.1（特定细胞簇内基因检测率）与pct.2（其他细胞簇平均检测率）差值显著的标志物中，我们发现了诸多与肿瘤发生相关的基因（如LHCGR、RGCC、CRHBP、FOSL1、HHEX和ANKRD1），同时也检测到通常表达于神经元或胶质祖细胞的基因（如CAV1、NPY、MMP10和SRFP4），提示这些细胞簇具有混合特性（图S5B、C）[63–71]。通过ScType层级注释分析进一步发现，第3和第7细胞簇可能包含多种细胞类型：癌细胞、非髓鞘化施万细胞、肿瘤干细胞、内皮细胞、谷氨酸能神经元、星形胶质细胞及施万前体细胞（图S5C），其中“癌细胞”的ScType评分最高，因此被选为该细胞簇的细胞类型分配结果（图S5C）。
对照组和F1491S-NPCs也共享部分细胞类型，包括脑室膜细胞、成熟神经元、多巴胺能神经元和血清素能神经元，但这些细胞类型的相对丰度不同，且转录相似性普遍较低（即此类细胞簇虽具有相同注释，但在二维UMAP图中彼此远离）（图5A-D）。为深入研究其转录状态，我们将scRNA-seq数据与计算分析相结合，绘制了对照和F1491S NPCs的基因调控网络（GRN）。GRN分析揭示，参与细胞周期调控（E2F8）和细胞增殖（ERF）的调节子在对照和突变NPCs的不同细胞簇中均被激活，且在突变组中活性更高（图S6A-C）；此外，部分调节子仅在对照组或突变组细胞中特异性激活（图S6B），其中对照组NPCs中活性得分最高的调节子是JUND，而CREB3L1在突变细胞（尤其是注释为小胶质细胞的细胞簇）中激活程度最高（图S6B、C）。
综上，这些发现表明，F1491S突变诱导的CACNA1A功能缺失会通过改变早期神经诱导阶段神经祖细胞的发育、特化和状态，严重破坏人类神经发生过程。
图5 F1491S突变改变神经前体细胞的发育过程。通过单细胞RNA测序对对照组和F1491S神经前体细胞（NPCs）的分析显示两者细胞组成存在显著差异。(A, B) 通过UMAP图展示基因表达的全局情况。每组分析约10,000个细胞（对照组与F1491S NPCs分别为10,490个和10,166个细胞）。每个点代表单个细胞，其在图中的位置反映与邻近细胞的转录相似性。不同颜色分别表示（A）中的样本来源和（B）中经ScType注释的细胞聚类。© 图表显示分配至各注释细胞类型的细胞百分比。(D) 图表显示分配至各细胞簇的细胞数量。(E) 特征图显示指定基因作为代表性标志物的分布和表达情况，包括神经上皮细胞标志物（Nestin和SOX2）、放射状胶质细胞标志物（HES5和SLC1A3）、施万前体细胞标志物（GAP43）、少突胶质前体细胞标志物（PDGFRA）、中间祖细胞标志物（ASCL1）和未成熟神经元标志物（DCX）。每个点代表一个细胞，颜色深浅表示基因表达水平
¶ Y1854X功能丧失性突变会损害神经元网络同步化和组成
与F1491S不同，Y1854X功能丧失性突变（仅影响[EFa]异构体的提前终止密码子变体）可引导神经元正常诱导和成熟——至少从细胞形态学层面来看如此，携带该突变的细胞可正常极化和分化。为进一步在功能水平上研究Y1854X神经元的特性，我们进行了电生理分析。
我们将对照神经元与Y1854X突变神经元培养于高密度微电极阵列（HD-MEA）上，并在21至60 DIV期间每周记录其自发电活动。如图6A-C所示，随着尖峰检测率的提升，对照组和突变型神经元培养物均发展出自发活动：对照组和突变组的活跃电极数量分别从21 DIV时的225±51.19（平均值±SEM）和97±24增加至60 DIV时的1395.5±275.83和898.25±25.6；平均放电率分别从21 DIV时的0.78±0.04和0.94±0.22增至60 DIV时的1.37±0.13和1.49±0.03（图6C）。上述参数在两组间未呈现统计学显著差异。
平均簇发放率在培养初期（21-35 DIV）两组间相当，但在49和60 DIV时出现分化，Y1854X突变培养物的平均簇发放率显著更高（49 DIV时，对照组与突变组分别为8.96±1.32和15.41±0.12；60 DIV时，对照组与突变组分别为10.99±1.47和15.66±0.39；学生t检验，p < 0.05）（图6C）。所有时间点两组的平均簇发持续时间相近（≈200毫秒）（图6C）。此外，Y1854X突变培养物中随机尖峰占比更低，而簇发通道（电极）占比更高（图6C）。最重要的是，网络级同步簇发活动仅出现在对照组中，Y1854X样本完全缺乏网络同步化（图6A-C）。
协调的网络活动依赖多种因素，包括神经元正常成熟度、网络组成及兴奋性/抑制性输入平衡。为探究Y1854X样本同步化活动缺失的原因，我们对49 DIV的对照组与Y1854X神经元培养物进行了scRNA-seq分析。结果显示，对照组培养物中成熟神经元与星形胶质细胞为主要细胞类型，分别占总细胞数的约60%和20%（6815个总细胞中，注释出3909个神经元和1309个星形胶质细胞）；次要细胞群包括放射状胶质细胞（7.7%）、少突胶质前体细胞（7.9%）、少突胶质细胞（5.9%）及内皮细胞（1.2%）（图7A-D）。
相比之下，Y1854X培养物中大部分细胞（57.8%）未能被注释为特定脑细胞类型（图7A-C中“未知”群组），且成熟神经元与星形胶质细胞占比显著减少，仅分别占总细胞的21.7%和12.4%（图7A-D）；放射状胶质细胞（9.2%）与少突胶质细胞（5.0%）的注释比例与对照组相近，但少突胶质前体细胞占比减少（0.2%），内皮细胞占比增加（3.7%）（图7B-D）。基因调控网络分析通过突出显示在对照和突变神经元培养物中差异激活的多种调节子，进一步证实了这种细胞组成的差异性（图S7A）：对照组神经元中活性得分最高的调节子是BHLHE41，而Y1854X突变细胞中激活程度最高的转录因子调节子是GSX2、E2F8、STAT1、ELF1、JUND和JUNB（图S7A-C）。
为探究“未知”细胞类型（包括细胞簇1、2、3和5）的分子特征，我们通过scRNA-seq数据的差异表达分析检测了其特异性标志物（图S8）。值得注意的是，在表达倍数变化较大且pct.1与pct.2表达差异显著的标志物中，我们发现了许多与GABA能神经元发育、维持及功能相关的基因：DLX1/2/5、KLHL35、NR2F2、CXCR4、CALB2、SCGN、SP8、PDZRN3、ST18、THRB、WNT5A、ADARB2、IGFBPL1、CCND2、TAC3、GABRG3和GABRB2（图S8B）[72–90]。我们还检测了抑制性神经元的其他经典标志物，发现GAD1、GAD2和SLC32A1（VGAT）的表达主要集中在UMAP图中对应“未知”簇1、2和5的区域（图S9A-C和图7E）。这些区域同时富集了未成熟神经元标志物（如DCX和TUBB3），而成熟神经元标志物SYP的表达水平较低（图S9D）。这些表达特征表明，“未知”簇的细胞可能代表未成熟或未完全分化的GABA能中间神经元。
此外，我们检测了经典谷氨酸能标志物（如GLS和SLC17A6（VGLUT2））的表达，发现其在Y1854X突变培养物中的平均表达水平和表达细胞百分比均显著降低（图7E和图S9E）。结合成熟神经元和星形胶质细胞数量的减少，这些发现揭示了Y1854X-CACNA1A功能缺失突变导致的神经网络组成改变、成熟过程异常及兴奋-抑制平衡破坏（图7E和图S9C、E）。
为验证上述假设，我们分别使用荷包牡丹碱（阻断GABA受体）或CNQX/APV（阻断AMPA/NMDA受体）处理细胞，并记录神经网络的自发电活动。结果显示，在对照组网络中，荷包牡丹碱显著增强同步电活动，而CNQX/APV完全抑制这种同步活动（图7F、G）；在Y1854X突变网络中，CNQX/APV降低放电检测率的效果与对照组相当，但荷包牡丹碱处理未产生显著影响（图7F、G）。这种对去抑制缺乏反应的现象表明，突变网络的兴奋性成分成熟度同样不足，这一结论也得到了单细胞RNA测序数据的佐证。
图6 CACNA1A功能丧失（Y1854X突变）损害神经元网络同步化。(A, B) 光栅图（上）和阵列范围放电率图（下）显示对照（A）和Y1854X（B）神经元培养物在28、42和60 DIV时60秒的自发性活动记录。光栅图的y轴表示电极（0至4096），每个点代表检测到的尖峰；阵列范围放电率量化上述光栅图中的活动水平，并突显仅在对照组中出现的同步网络事件（42和60 DIV时的绿色峰值）。© 图表比较对照和Y1854X突变iPSC衍生神经元在活跃电极数量、平均放电率、平均簇发放率、平均簇发持续时间、随机尖峰百分比、簇发通道百分比、网络簇发率和网络簇发持续时间方面的活动差异。数据以平均值±SEM表示。*，p < 0.05；**，p < 0.01，与对照组相比（学生t检验，每个时间点和样本n=3-6次重复）
图7 CACNA1A功能丧失（Y1854X突变）改变神经元网络组成。(A, B) 通过UMAP图展示基因表达的全局情况。对照组和Y1854X神经元培养物分别分析了6815个和11,551个细胞。每个点代表单个细胞，其在图中的位置反映与邻近细胞的转录相似性。不同颜色分别表示（A）中的样本来源和（B）中经ScType注释的细胞聚类。© 图表显示分配至各注释细胞类型的细胞百分比。(D) 图表显示分配至各细胞簇的细胞数量。(E) 点图显示对照组和Y1854X神经元中指定基因的表达情况。点颜色强度表示指定基因的平均表达水平，点大小表示表达该基因的细胞百分比。(F) AWFR图显示基础条件下及给予30 μM荷包牡丹碱后，对照组和Y1854X培养物2分钟记录的自发活动。(G) AWFR图显示基础条件下及给予50 μM CNQX和80 μM APV后，对照组和Y1854X培养物2分钟记录的自发活动
¶ 讨论
本研究探究了iPSC衍生神经模型的分子与功能特性，旨在阐明CACNA1A在人类神经发生中的作用，并揭示CACNA1A缺陷引发神经系统疾病的细胞发育机制。我们通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了等基因人类iPSCs，确保在相同遗传背景下研究CACNA1A突变的效应[91]。研究选择了两种导致严重EA2表型的CACNA1A功能缺失突变——此前研究已证实这两种突变可完全消除钙通道活性[37,41]。为在体外模拟人类神经发育过程并研究CACNA1A突变的影响，我们采用了基于顺序生成中间前体细胞和神经元网络的神经分化方案。
单细胞转录组分析和自动化细胞类型注释显示，我们获得的神经细胞群体具有异质性：对照组神经前体细胞培养物包含多种神经前体类型（放射状胶质细胞、施万前体细胞、成神经细胞）及定向于不同谱系（谷氨酸能、多巴胺能、GABA能、血清素能）的未成熟神经元；终末分化后，神经前体细胞形成由多种神经元（谷氨酸能、GABA能、多巴胺能）和胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞）亚型组成的混合网络。值得注意的是，对照组神经元网络发展出了自发且协调的电生理活动，标志着功能成熟的实现。
这种培养物的异质性与近期在离体组织和体外模型（包括通过类似方案生成的二维培养物及大脑类器官）中获取的数据一致[92–95]。由于该异质性反映了人类新皮质中存在的多种细胞类型，这些模型特别适用于研究遗传性神经发育障碍的细胞机制，同时为进一步探索相关机制提供了可能。考虑到驱动大脑正常发育的复杂细胞间交互作用，此类特征无法在由单一细胞类型组成的简单神经元培养中准确模拟，且在结合不同物种来源或不同遗传背景的共培养方法中也可能被破坏。
通过将人类iPSC来源的神经元模型与单细胞转录组学及高密度微电极阵列电生理技术相结合，我们揭示了CACNA1A在神经诱导、特化与成熟早期阶段中此前未被认识的重要作用。此外，研究发现不同CACNA1A功能缺失突变会引发显著不同的神经发育缺陷：CACNA1A功能丧失对神经细胞转录景观的深远影响已通过scRNA-seq得到证实，F1491S功能丧失突变影响所有剪接异构体，阻碍神经前体细胞的正常发育和特化（表现为放射状胶质细胞数量减少，癌细胞和小胶质细胞数量富集）；而提前终止密码子突变Y1854X仅选择性影响包含互斥外显子37a的亚型，导致神经元网络成熟异常和组成改变（表现为大量未成熟神经元样细胞、GABA能中间神经元相对兴奋性神经元增加、星形胶质细胞数量减少）。结合在维持突触传递中的已知作用[3,4]，上述网络组成的改变可能是突变培养物中同步活动缺失的原因。
此前研究报道，功能缺失小鼠会出现神经功能障碍（包括共济失调、肌张力障碍和癫痫），且这些障碍主要通过发育非依赖性机制产生[96–105]。事实上，在先天性Cacna1a敲除和条件性（成人发病型）Cacna1a敲除动物模型中，已观察到重叠的表型[96–106]。此外，研究表明通道及、通道对动作电位触发的神经递质释放至关重要，但对培养小鼠神经元中的突触组装非必需[107]。因此，与相关的神经系统功能障碍通常被认为与多种脑回路中神经突触传递的改变有关[3,96–105]。值得注意的是，本研究结果表明可能发挥超越神经递质释放调节的作用，并突显了CACNA1A在人类细胞早期神经发育机制中的更广泛参与。
关于CACNA1A功能丧失可能影响神经细胞发育命运和成熟的直接及间接机制，可提出多种假说，例如钙信号在基因表达调控中的已知作用。已有研究证实，其他电压门控钙离子通道（如和）的钙流损失不仅影响突触传递，还会改变多种钙信号通路及下游过程，进而影响核基因表达和细胞分化[108–111]。在这一背景下，此前报道的CACNA1A在不同类型神经元（包括谷氨酸能神经元和表达小白蛋白的GABA能中间神经元）及星形胶质细胞中的表达[112–115]表明，其功能缺失可能影响这些神经细胞组分的正常功能和成熟过程，进而导致神经细胞转录组改变。值得注意的是，在携带突变的名古屋小鼠和蹒跚小鼠中，也观察到了类似的转录组改变[108,117,118]。
CACNA1A相关神经系统疾病谱广泛，这源于大量不同的致病变异。目前ClinVar数据库中已报告超过3700种CACNA1A变异，其中约560种被列为致病性或可能致病性。这些变异可在单等位基因或双等位基因状态下被检测到，从功能角度而言，它们通过不同机制对通道产生功能获得性或功能丧失性影响。通道具有高度分子复杂性——基于不同亚基和剪接异构体的组合，存在多种复合体形式——这也可能导致突变效应的差异性，进而形成多样化的基因型-表型关联。例如，多项研究已揭示，通过37a和37b外显子选择性剪接产生的CACNA1A异构体具有多样化功能[4,5,7,9,13–16]。
本研究中，我们发现了与剂量及异构体依赖性缺陷相关的细胞表型：由于在纯合条件下引入CACNA1A突变，F1491S突变通过影响所有异构体导致通道完全功能丧失，而Y1854X突变因保留完整的[EFb]异构体，仅选择性导致[EFa]异构体功能丧失。携带F1491S突变的细胞表现出更严重的表型，涉及神经发生早期受损（神经前体发育异常），阻碍其分化为神经元；相反，携带Y1854X突变的细胞能产生具有电生理活性的神经元培养物，但这些细胞无法成熟为具有协调活动的网络。这些发现表明，功能性[EFb]通道在一定程度上足以维持早期神经元发育，这与既往研究提出的“[EFb]在啮齿类动物早期大脑发育中主导[EFa]”的观点一致[13,14]。然而，神经元网络的完全成熟及同步化活动的形成仍需依赖[EFa]异构体——该异构体在维持突触传递方面效率更高[4,13,14,16]，且参与神经元网络形成，这与我们研究中发现的兴奋性和抑制性神经元发育改变及星形胶质细胞异常一致。
CACNA1A也可能通过α1ACT直接影响其他神经基因的转录调控——α1ACT是由CACNA1A信使RNA编码的一种次级蛋白，可作为转录因子发挥作用，且已被发现能协调参与小脑早期发育的动态基因表达[48,116]。此外，我们的基因调控网络分析揭示，携带F1491S突变的细胞中，由CREB3L1调控的内质网应激相关转录途径的激活减弱。由于该突变损害了的功能，使其无法正常运输至细胞表面，因此推测突变在细胞内区室的积累可能诱导细胞毒性并激活信号通路，进而导致发育异常。
总之，本研究结果揭示了CACNA1A在神经诱导、神经元分化和成熟中此前未被认知的作用，并强调了[EFa]与[EFb]两种不同变体在人类神经元细胞发育中的差异性贡献。未来研究需阐明这些体外实验结果是否与CACNA1A功能缺失的体内系统性影响相一致，尤其需考量大量致病变异与多样遗传模式的因素，同时还需探索新型治疗策略，例如通过拯救CACNA1A功能或调节替代靶点来规避CACNA1A缺陷。在这一背景下，本研究开发的iPSC衍生模型可为未来测试针对CACNA1A相关神经系统疾病的潜在治疗方法提供基础。
¶ 补充信息
在线版本包含补充材料，可在 https://doi.org/10.1007/s00018-025-05740-7 获取。
¶ 作者贡献
IM、LM、FJ、MDD、SG、DV、FA、YCCDS 收集数据；IM、LM、DC、PS 分析数据；LC、FZ、PS 设计并监督研究；IM 和 PS 准备图表并撰写手稿；所有作者均已阅读并同意最终版本的手稿。
¶ 资助
开放获取资金由热那亚大学在CRUI-CARE协议框架内提供。本研究获得Telethon基金会资助（项目编号#GJC22053A致LC与PS，GGP19181致LC与FZ），并获意大利大学与研究部（PNRR扩展合作伙伴关系—MNESYS）对FZ的资助。同时，本研究得到意大利卫生部支持，包括“2024年经常性研究基金”（RRC-2024–2787194）、“5×1000-2020”项目（5M-2020–23682531与5M-2018–23680429）对DC的资助，以及“5×1000-2017”项目（5M-2017–23684149）对FZ的资助。
¶ 数据可用性
单细胞RNA测序数据已存入GEO数据库，自发布之日起公开可用。存取编号列于资源表中。本文报告的其他数据将根据要求由主要联系人提供。
¶ 声明
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- 同意参与：不适用。
- 同意发表：不适用。
- 利益冲突：作者声明无利益冲突。
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