CERO 各类型细胞样本培养方法

干细胞、球状体、类器官、组织培养方案

一、CERO 系统概述

核心特点

核心优势

二、培养方案目录

1. iPSC 和 ESC 的扩增
2. 类器官的分化和培养（来源 CERO 培养的 iPSC 和 ESC）
3. 类器官和肿瘤状细胞转移培养（来源传统 2D 培养的 Organoids 和 Tumoroids）
4. 间充质干细胞、祖细胞/成体干细胞、细胞系的培养
5. 球状体培养和成熟（适用于大部分细胞系，区别于第 4 类的培养方式，该步骤细胞具有高度均质性）
6. 组织碎片培养（原代）

三、干细胞培养（iPSC & ESC）

优势

• 自由悬浮的单分散 3D 细胞聚团
• 无自发细胞分化
• 稳定的多能性
• 灵活的接种密度
• 极大化细胞产率
• 无微载体吸附

操作步骤

步骤 1：接种前准备

• 使用 PSC 培养基（含相关营养物质）培养
• 传代比例 1:6，每 4 天传一代

步骤 2：接种

1. 消化计数
2. 接种于 10mL PSC 培养基
3. 添加 10μM Y-27632（Rho-Kinase Inhibitor）

步骤 3：培养扩增

• 每 24 小时添加 5mL PSC 培养基
• 3 至 7 天后即可收获细胞

步骤 4：收获

1. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
2. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
3. 使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS（15mL）洗涤细胞
4. 离心：500g，3 分钟
5. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
6. 加入约 10mL 细胞消化液，按设定参数孵育
7. 将细胞转移至 Falcon 离心管，500g，3 分钟
8. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
9. 重悬于 10mL PSC 培养基，添加 10μM Y-27632（Rho-Kinase Inhibitor）
10. 经 40μm 过滤器过滤细胞悬液

四、类器官分化&培养

优势

• 适用类型：脑、心脏、肝、上皮等
• 自由悬浮的类器官，无需基质胶
• 促进分化，优良的细胞极性
• 高产率 - 低成本
• 无剪切力影响
• 极大化均质性

操作步骤

步骤 1：诱导

建议用 iPSC 和 ESC 细胞诱导，也可用其他来源细胞诱导。

1. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
2. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
3. 使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS（15mL）洗涤细胞
4. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
5. 加入 15mL 诱导培养基
6. 视情况每周更换 2 次培养基，每周更换 1 次 CEROtube
7. 诱导 7 至 12 天

步骤 2：培养扩增

1. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
2. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
3. 使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS（15mL）洗涤细胞
4. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
5. 加入对应分化培养基
6. 根据细胞类型对应参数更换培养基

步骤 3：培养基更换与收获

1. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
2. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
3. 加入上表对应体积的培养基

五、类器官&肿瘤状细胞培养（from 2D）

适用场景

从传统 2D 培养的 Organoids 和 Tumoroids 转移到 CERO 系统。

优势

• 优化实验操作
• 高产率，耗时短
• 更均一 & 高水平基因表达
• 无生长空间限制
• 标准化流程

操作步骤

步骤 1：传代（从 2D 转移）

1. 选择合适的试剂盒去除基质胶
2. 收集细胞至 15mL Falcon 离心管
3. 离心：300g，6 分钟
4. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
5. 重悬于 5mL TrypLE Express（Gibco），体积可视情况增至 10mL
6. 使用移液枪吹匀混悬液（50 次/分钟）
7. 37℃ 孵育 5 分钟
8. 离心：300g，6 分钟
9. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
10. 重悬于 1mL 培养基

步骤 2：培养扩增

1. 将细胞平均接种至 4 个 CEROtube
2. 每管添加 12mL 扩增培养基
3. 按设定参数培养 3 至 4 天

步骤 3：传代扩增

1. 收集细胞至 15mL Falcon 离心管
2. 离心：300g，6 分钟
3. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
4. 重悬于 5mL TrypLE Express（Gibco），体积可视情况增至 10mL
5. 使用移液枪吹匀混悬液（50 次/分钟）
6. 37℃ 孵育 5 分钟
7. 离心：300g，6 分钟
8. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
9. 重悬于培养基，1:3 传代（每管原来 12mL，现在 36mL）
10. 继续扩增培养

六、间充质干细胞&祖/成体干细胞&细胞系培养

优势

• 自由悬浮的单分散 3D 细胞聚团
• 高细胞产率
• 灵活的接种密度
• 无微载体吸附

操作步骤

步骤 1：接种

1. 细胞消化
2. 离心：300g，6 分钟
3. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
4. 重悬于 10mL 培养基
5. 添加 10μM Y-27632（Rho-Kinase Inhibitor）

步骤 2：培养扩增

• 每 24 小时添加 5mL 培养基
• 重复上一步直至达到预期产率
• 根据细胞类型选择收获或其他分化、扩增培养

步骤 3：收获

1. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
2. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
3. 使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS（15mL）洗涤细胞
4. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
5. 加入约 10mL 细胞消化液，按设定参数孵育
6. 将细胞转移至 Falcon 离心管，500g，3 分钟
7. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
8. 重悬于 10mL PSC 培养基，添加 10μM Y-27632（Rho-Kinase Inhibitor）

七、球状体培养&成熟

适用场景

适用于大多数细胞系和预分化的细胞。区别于第 6 类的培养方式，该步骤细胞具有高度均质性。

优势

• 适用于大多数细胞系和预分化的细胞
• 促进细胞分化和极性
• 稳定的长时间分化和存活
• 每个球状体聚团的细胞数极大均质化
• 高产率，耗时短
• 无剪切力影响

操作步骤

步骤 1：接种

1. 细胞消化计数
2. 重悬于新鲜培养基，添加 10μM Y-27632（Cell Signaling Technologies）
3. 接种 15 个细胞或球状体于 Aggrewell 800 24 孔培养板（Stem Cell Technologies）
4. 每 24 小时更换一次培养基（不含 Y-27632），持续 5 天
5. 收集 2 孔细胞至 1 个 CEROtube，添加 45mL 培养基（含 CEROSolution 1，1:30）

步骤 2：培养扩增

1. 将细胞转移至 10cm 细胞培养皿
2. 使用真空泵吸走 30mL 培养基（70 或 100μm 滤膜）
3. 重复上一步
4. 添加新鲜培养基至 45mL，转移至新的 CEROtube

步骤 3：成熟

1. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
2. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
3. 使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS（15mL）洗涤细胞
4. 小心吸走上清，不要碰到细胞沉淀
5. 加入对应分化培养基

八、组织碎片培养（原代）

适用场景

适用于肝脏、脑、胰脏等其他组织。

优势

• 适用于肝脏、脑、胰脏等其他组织
• 相较于 2D 静态培养显著延长生存时间
• 易于标准化
• 无包埋培养
• 自由悬浮的组织碎片
• 无剪切力影响

操作步骤

步骤 1：接种前准备

1. 剪碎组织，碎片尺寸直径约 1.5-1.8mm
2. 选择合适的培养基，如果必要，可收集宿主血清
3. 设置温度 37℃，CO₂ 浓度 5%

步骤 2：培养扩增

1. 培养基加入 10%-20% 的宿主血清，或者人血清蛋白（Takeda）
2. 添加 CEROSolution 1（1:30）
3. 控制密度：每 30mL 培养基含 400 组织碎片
4. 每 3 天更换一次培养基
5. 停止旋转，静置 5 至 10 分钟
6. 小心吸走 20mL 上清，不要碰到细胞沉淀
7. 加入新鲜的 20mL 培养基（含 CEROSolution 1）

九、通用操作规范

离心参数汇总

通用注意事项

• ⚠️ 每次离心后吸走上清时，不要碰到细胞沉淀
• ⚠️ 停止旋转后务必静置 5-10 分钟再操作
• ⚠️ Y-27632（Rho-Kinase Inhibitor）浓度：10μM
• ⚠️ CEROSolution 1 稀释比例：1:30
• ⚠️ PBS 洗涤使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS，用量 15mL
• ⚠️ 培养基更换频率根据细胞类型调整，组织碎片每 3 天一次

联系人｜李东伟
📞 18045130660
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