新生大鼠/小鼠（P0-P2）原代神经元 CorePlate™ 培养与记录操作协议

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最后更新: 2025 年 8 月 27 日
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目录

1. 简介
2. CorePlate™ 培养前准备
3. 解剖与细胞分离
4. 记录

1. 简介

本协议描述了如何使用 CorePlate™ 1W 38/60 和 6W 38/60（以下统称 CorePlate™，单独提及时分别称为 CorePlate™ 1W 或 CorePlate™ 6W）从新生大鼠或小鼠幼崽（P0-P2）中分离、培养和记录皮层/海马组织。

1.1 CorePlate™ 操作、清洁、灭菌和亲水化

有关 CorePlate™ 操作的详细说明，或如何清洁、灭菌和亲水化 CorePlate™ 以准备本协议，请参考：

• CorePlate™ 1W 38/60 操作、清洁、灭菌和亲水化指南
• CorePlate™ 6W 38/60 操作、清洁、灭菌和亲水化指南

2. CorePlate™ 培养前准备

为了使 CorePlate™ 电极上形成健康的细胞层，芯片的有源区域必须涂覆适当的粘附因子。

⚠️ 注意：不要将 CorePlate™ 6W 直接放置在金属工作台上。在培养箱或超净工作台中使用时，请在 CorePlate™ 6W 下方放置塑料托盘。金属表面的静电荷可能损坏片上电路并导致设备损坏。

2.1 CorePlate™ 涂覆

涂覆应在灭菌后在层流罩下进行，步骤如下：

1. 用 1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）* 填充储液器

2. 对于 CorePlate™ 1W，放入无菌培养皿中并盖上盖子，在 37°C 过夜孵育。对于 CorePlate™ 6W，确保盖上其自带盖子，在 37°C 过夜孵育

3. 移除 PBS，用无菌 ddH₂O 清洗一次。移除无菌 ddH₂O 并让芯片干燥

4. 干燥后，在有源区域添加一滴（70-80 µL）多聚鸟氨酸（100 μg/ml）或多聚赖氨酸（100 μg/ml）

图 1：CorePlate™ 1W 和 6W 孔示意图，有源区域中间的粘附因子溶液滴（黑色圆圈）。参比电极仅存在于 CorePlate™ 1W 上。

💡 提示：为避免小体积液体蒸发，CorePlate™ 1W 可放在培养皿中，旁边放一个装有 2 mL 无菌水的较小敞开培养皿。使用 CorePlate™ 6W 时，在孔间空间添加无菌水。

5. 将 CorePlate™ 按第 2 点描述在培养箱中过夜孵育

6. 用约 100 µL 无菌 ddH₂O 清洗有源区域两次，以去除粘附因子溶液。将 CorePlate™ 放在层流罩下直至完全干燥

*此步骤可增加芯片亲水性，从而促进细胞粘附。

可选层粘连蛋白（Laminin）涂覆：

在第 6 步后，可额外添加一层层粘连蛋白（50 μg/ml）：

a. 添加溶解在无菌 ddH₂O 中的层粘连蛋白（50 μg/ml）

b. 按上述第 2 点将板在培养箱中孵育至少 4-6 小时，最长过夜

c. 移除层粘连蛋白，将 CorePlate™ 放在层流罩下直至完全干燥（通常 5 分钟），然后用培养皿盖覆盖 CorePlate™ 1W 或用自带盖覆盖 CorePlate™ 6W

*此步骤可增加芯片亲水性，从而促进细胞粘附。

3. 解剖与细胞分离

使用以下溶液对小鼠或大鼠幼崽（P0-P2）脑组织进行解剖：

• HBSS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）+ 庆大霉素 10 μg/ml

将解剖后的组织收集在 15 mL 锥形管中。溶液和分离的组织必须保持在冰上。

3.1 酶解离

移除生理盐水溶液，将组织重悬于以下溶液中：

• 小鼠：木瓜蛋白酶 2 mg/ml
• 大鼠：胰蛋白酶 0.25%

1. 在 37°C 孵育 10 分钟，最好在水浴中
2. 加入溶于 HBSS 的 DNA 酶 50 μg/ml，再孵育 10 分钟

3.2 终止酶活性

移除酶溶液后，加入以下溶液约 3-5 分钟，以终止木瓜蛋白酶/胰蛋白酶的蛋白水解作用：

• 预热的完全 Neurobasal-A 培养基：
  • Neurobasal
  • 2% B27
  • 1% Glutamax
  • 10 μg/ml 庆大霉素
• 补充：
  • 10% FBS（热灭活）

3.3 机械解离

1. 移除溶液，用完全 Neurobasal-A 清洗两次。从底部轻轻摇动锥形管（约 5 次），将组织重悬于完全 Neurobasal-A 中

2. 用火焰抛光的巴斯德移液器轻轻切碎组织，直至溶液均匀（约 10-15 次）

3. 可选：为去除过量细胞碎片，可使用 4% BSA 梯度（溶于 Neurobasal-A，50 mL Neurobasal 中加 2 g BSA，使用前用 0.2 μm 孔径滤器过滤）

   • 将细胞悬液转移到含 BSA 溶液的锥形管中，室温下 300 × g（1500 rpm）离心 8 分钟
   • 弃去上清液，将沉淀重悬于预热的完全 Neurobasal-A 中

4. 将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 0.4% 台盼蓝混合，进行细胞计数

3.4 接种程序

细胞计数后，将细胞重悬于完全 Neurobasal-A 中：

1. 稀释细胞悬液，以 1500-3000 个细胞/mm² 的密度，以 1200-1500 个细胞/μL 的浓度，在有源区域接种 50-70 μL 体积的细胞悬液

⚠️ 注意：接种时移液器吸头不要接触有源区域。

2. 让细胞在 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中粘附预处理过的记录区域 1.5-2 小时

💡 提示：为避免因强烈蒸发导致的渗透压失衡，CorePlate™ 1W 可放在培养皿中，旁边放一个装有 2 mL 无菌水的较小敞开培养皿。使用 CorePlate™ 6W 时，在孔间空间添加无菌水。

3. 细胞牢固附着在记录区域后，加入 500 μL 预热的完全 Neurobasal-Plus + B27-Plus

4. 接种后 24 小时，体积达到 1.5 mL

5. 为最小化胶质细胞过度生长，添加抗有丝分裂试剂如 阿糖胞苷（ARA-C），浓度 0.5-1.5 μM，持续 24 小时。ARA-C 可在接种后 24-48 小时添加。进行完全换液

6. 可选：为支持细胞生长和网络发育，添加生长因子 BDNF 10 ng/ml 和 IGF-1 1.5 ng/ml

4. 记录

建议在记录前 24-36 小时内避免对培养物施加任何压力。

在 CorePlate™ 上多个时间点对神经元进行记录时，保持无菌状态至关重要。

4.1 CorePlate™ 1W 记录期间的无菌维持

使用 CorePlate™ 1W 在多个时间点进行记录时，使用层流罩将 CorePlate™ 1W 带膜盖放在 CorePlate™ 1W 上以防止污染。透明氟化乙烯丙烯（FEP）膜允许气体扩散，但限制蒸发，从而减少对湿润大气的需求。盖子可在 120°C 高压灭菌 20 分钟。

放置 CorePlate™ 1W 带膜盖后，即可进行记录。

记录 session 结束后，在层流罩中移除 CorePlate™ 1W 带膜盖，将 CorePlate™ 1W 放入无菌培养皿中。将 CorePlate™ 1W 保存在 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中，直至下次记录。

⚠️ 注意：如果在层流罩外打开运输 CorePlate™ 的培养皿，请在将 CorePlate™ 放入培养箱之前，更换为新的无菌培养皿。

4.2 CorePlate™ 6W 记录期间的无菌维持

使用 CorePlate™ 6W 在多个时间点进行记录时，使用 CorePlate™ 6W 盖子以防止污染。确保在记录期间始终盖上盖子，除非在层流罩中。盖子可通过紫外线和/或乙醇灭菌（请参考 CorePlate™ 6W 操作、清洁、灭菌和亲水化指南）。记录 session 结束后，将 CorePlate™ 6W 放回 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中，直至下次使用。

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