小鼠视网膜外植体解剖与 CorePlate™ 记录操作协议

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最后更新: 2025 年 8 月 26 日
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1. 简介

本协议描述了如何使用 CorePlate™ 1W 38/60（以下简称 CorePlate™）记录小鼠视网膜外植体。

有关 CorePlate™ 操作的详细说明，或如何清洁和亲水化 CorePlate™ 以准备本协议，请参考：

高质量的视网膜外植体对于获得可靠的实验数据至关重要。为此，应尽量通过使用清洁、锋利的解剖工具来减少压缩变形、细胞破坏和其他视网膜提取固有的不良效应。

时间至关重要。良好的制备从动物处死到完成视网膜提取大约需要 5 分钟。避免让视网膜暴露在没有通氧溶液的空气中
必须充分通氧，去除眼球和视网膜解剖所在的溶液必须用 95% O₂ / 5% CO₂ 通气
不要在通氧环境外切割或处理取出的视网膜，以保持组织活力
不要使用镊子将视网膜从培养皿移到 CorePlate™ 1W，以免损伤视网膜
如果要研究光刺激，建议在实验前夜对动物进行暗适应/或在记录前至少 2 小时进行暗适应。此外，确保视网膜解剖在黑暗中进行（在微弱红光条件下/红外光下）。并且记录本身应在完全黑暗中进行。此外，可在灌注培养基中补充 4 μM 9-Cis-视黄醛（Sigma）

以下所有步骤在黑暗中进行，仅使用微弱红光进行解剖。

暗适应小鼠后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。通过在眼球和眼窝之间轻轻按压眼球边缘，立即摘除双眼。这将把眼球推出眼窝，使您能够用弯剪剪断视神经。如需记录眼球背侧/腹侧/颞侧/鼻侧方向，请务必做好标记
将眼球转移到含有冰冷通氧 Ames' 培养基（含 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，Sigma）的培养皿中
用针/细剪在靠近角膜缘处刺穿角膜，在角膜缘下方环形切割，一起移除角膜和晶状体
用镊子移除角膜和晶状体后，用镊子从视网膜表面轻轻剥离玻璃体纤维（尽可能靠近视网膜操作，但不要触摸视网膜组织）。确保所有玻璃体已被移除，以确保视网膜神经节细胞与 CorePlate™ 之间的良好接触
用细画笔将视网膜从底层 RPE 和巩膜上轻轻剥离，尽量避免机械应力
用弯剪在视神经处做一个小切口，将视网膜从眼球上取下
做四个径向切割（形成三叶草形状），以使视网膜平整，准备将其放置到 CorePlate™ 上

视网膜组织需要灌注系统来维持长期记录所需的氧气和适量营养。推荐灌注速率为 3-5 mL/min。

有关 CorePlate™ 灌注系统设置和使用的详细说明，请参考：

将视网膜外植体定位到 CorePlate™ 有源区域，按以下步骤操作：

停止灌注，用塑料移液器从 CorePlate™ 储液器中排空培养基
将视网膜外植体从解剖培养皿转移到另一个含有干燥透明多孔膜方块（不超过 5 × 5 mm²）的培养皿中。将视网膜放在膜的顶部，确保光感受器朝下并与膜直接接触。使用切割的巴斯德移液器或宽孔移液器小心转移视网膜
用小移液器吸头小心移除视网膜周围的多余液体，使其在滤纸上平整。然后在视网膜正上方滴一滴溶液，确保其无褶皱
用镊子翻转多孔膜，将视网膜转移到有源区域，神经节细胞层朝下对准电极，多孔膜在上方。确保有源区域没有多余液体（如大滴培养基），否则可能阻碍神经节细胞与电极之间的良好接触
确保视网膜外植体粘附在有源区域。电极与视网膜之间的良好粘附对记录至关重要
插入1W 样品支架（事先用溶液润湿）。（有关如何使用样品支架组的进一步说明，请参考"How to use the 1W sample holder set"视频）
缓慢向腔室中填充 Ames' 培养基并开始灌注
让视网膜静置 1-2 小时后再开始记录

不要将 Ames' 培养基溶液保持低温并通氧，以避免 Ca²⁺ 沉积
如果要从视网膜记录光反应，必须从顶部引入光刺激，因为芯片不透明。这意味着在视网膜解剖过程中，必须移除视网膜色素上皮（RPE）
实验日前后用去离子水清洁灌注线至少 10 分钟。实验 session 结束时，用纯乙醇（EtOH）清洁管线 3 分钟，然后用去离子水冲洗至少 10 分钟

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