基于 CMOS 集成高密度微电极阵列记录和分析多模态大规模神经元集合动力学

作者: Brett Addison Emery*, Shahrukh Khanzada*, Xin Hu*, Diana Klütsch, Hayder Amin
机构: 德国神经退行性疾病研究中心 (DZNE) / 德累斯顿工业大学
期刊: J. Vis. Exp. (205), e66473, doi:10.3791/66473 (2024)
发表日期: 2024 年 3 月 8 日
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摘要

大规模神经元网络及其复杂的分布式微电路对于产生感知、认知和行为至关重要，这些功能从时空神经元活动模式中涌现。这些由相互连接的神经元集合功能组产生的动态模式，促进了处理和编码多尺度神经信息的精确计算，从而驱动高级脑功能。

为了探究这种复杂性背后神经动力学的计算原理，并研究生物过程在健康和疾病中的多尺度影响，大规模同步记录已成为不可或缺的工具。

本研究采用**高密度微电极阵列（HD-MEA）**研究两种神经动力学模态：

• 离体小鼠脑切片的海马和嗅球回路
• **体外人诱导多能干细胞（iPSC）**衍生的神经元网络

HD-MEA 平台拥有 4096 个微电极，能够以高时空分辨率同时从数千个神经元集合中进行非侵入性、多位点、无标记的细胞外放电模式记录。该方法可表征多种电生理网络范围特征，包括单/多单元尖峰活动模式和局部场电位振荡。

为深入分析这些多维神经数据，我们开发了多种计算工具，整合了机器学习算法、自动事件检测和分类、图论及其他高级分析方法。

引言

神经元集合（通常称为细胞集合）在神经编码中至关重要，促进了处理多尺度神经信息的复杂计算。这些集合支撑了大规模神经元网络及其细微微电路的形成。

本研究协议重点介绍两个关键脑回路：

• 海马-皮层（HC）：参与学习和记忆过程
• 嗅球（OB）：负责气味辨别

在这两个区域，新的功能神经元在整个哺乳动物生命过程中通过成年神经发生不断产生。两种回路都展示出多维动态神经活动模式和固有的可塑性，在需要时参与重新连接现有神经网络并促进替代信息处理策略。

虽然离体脑切片模型对于深入研究脑功能和理解疾病机制至关重要，但来自人 iPSC 的体外细胞培养神经元网络为转化研究提供了一条有前景的途径，无缝连接动物实验发现与潜在人类临床治疗。

这些电活性神经模块通常使用钙成像、膜片钳记录和低密度微电极阵列（LD-MEA）等技术进行研究。然而，这些方法各有局限性。为应对这些挑战并有效探测网络范围活动，大规模同步神经记录已成为理解脑复杂性背后神经动力学计算原理及其在健康和疾病中影响的关键方法。

在本 JoVE 协议中，我们演示了一种基于 HD-MEA 的大规模神经记录方法，用于捕获各种脑模态的时空神经元活动。HD-MEA 基于互补金属氧化物半导体（CMOS）技术构建，具有片上电路和放大功能，可在 7 mm² 阵列尺寸上实现亚毫秒级记录。

协议

所有实验均按照适用的欧洲和国家法规（Tierschutzgesetz）进行，并获得当地当局批准（Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14）。

1. 离体脑切片在海马-皮层和嗅球回路的 HD-MEA 记录

1.1 实验切割和记录溶液的制备

在实验当天，制备 0.5 L 高蔗糖切割溶液和 1 L 人工脑脊液（aCSF）记录溶液：

1. 将所有固体化学品加入干燥容量瓶中，然后部分填充双蒸（dd）水
2. 从 1 M 储备液中加入 MgCl₂ 和 CaCl₂，然后用 dd 水填充剩余部分。开始用磁力搅拌器持续搅拌，直到可见固体溶解（约 5 分钟）
3. 使用冰点渗透压计验证高蔗糖切割溶液的渗透压在 350-360 mOsm 之间，aCSF 记录溶液在 315-325 mOsm 之间
4. 使用 pH 计验证高蔗糖切割溶液的 pH 在 7.3-7.4 之间，aCSF 记录溶液在 7.25-7.35 之间。开始持续通入 95% O₂ 和 5% CO₂
5. 将高蔗糖切割溶液放在冰上至少 30 分钟，然后开始持续通气

💡 注意：所有溶液应在每次实验时新鲜制备。

1.2 脑切片工作区的准备

1. 将动物带入实验房间（本协议中使用 8-16 周龄 C57BL/J6 雌性小鼠）
2. 在动物适应和高蔗糖溶液冷却期间，将所需工具放置在每个指定工作区
3. 准备脑切片恢复和维护工作区：用通气的 aCSF 记录溶液填充切片恢复室，并将室放在设置为 32°C 的水浴中。在整个实验过程中保持持续通气
4. 准备脑切片制备工作区：设置振动切片机——将刀片放入振动切片机刀架中，并校准到正确设置（刀片行程速度：0.20 mm/s，高度振幅：95 µm，刀片角度：45°）。在振动切片机冰盘中加入冰，在缓冲盘中加入高蔗糖切割溶液，并开始通气
5. 准备脑准备工作区：在 150 mm 玻璃培养皿中加入冰，并在其中放置带滤纸的 90 mm 塑料培养皿。用高蔗糖切割溶液填充塑料培养皿并开始通气。在冷却的样品板上滴一滴强力胶并附上琼脂糖模具
6. 准备脑提取工作区：用纸巾覆盖铝箔，取出含有高蔗糖切割溶液冰浆的 50 mL 烧杯，并向麻醉室中加入异氟烷

1.3 小鼠脑的提取和切片

⚠️ 注意：整个过程应尽快进行，以避免脑缺氧。从断头到浸入高蔗糖切割溶液冰浆中，脑提取应仅需 1-2 分钟。

1. 用适当剂量的异氟烷麻醉动物（0.5 mL/1 L 麻醉室）。通过爪捏确定麻醉深度；在继续之前确认无爪撤回反射
2. 将动物转移到脑提取工作区的纸巾上，用手术剪断头
3. 将虹膜剪插入脑干，保持剪刀底部与颅骨齐平。沿矢状缝切割直到冠状缝。将虹膜剪放入眼窝并切割额缝。用弯镊移动颅骨两侧，暴露整个脑
4. 用弯镊的钝边将脑滑入含有 30 mL 高蔗糖切割溶液冰浆的 50 mL 烧杯中。停留 1 分钟
5. 将脑转移到脑准备工作区的含有冷通气切割溶液的 90 mm 塑料培养皿中。定向脑以定位在琼脂糖模具中
6. 在琼脂糖模具的吻端加一小点强力胶。用刮刀将脑放入模具中。确保脑背侧朝下进行水平切片
7. 将样品板移入缓冲盘，将刀片移至正确位置并调整角度，增加缓冲盘高度使刀片尽可能靠近脑
8. 以 0.20 mm/s 速度按 300 µm 间隔切割 HC 和 OB 组织，然后在每次切割后用玻璃巴斯德移液管收集
9. 将切片留在 32°C 水浴中充满 aCSF 的恢复室中 45 分钟，然后在室温下 1 小时。确保切片不重叠并完全暴露于通气溶液中

2. 体外人 iPSC 神经元网络在 HD-MEA 上

注意：本研究中使用的 iPSC 神经元均为商业获取。这些人类细胞从稳定的人外周血或成纤维细胞衍生的 iPS 细胞系分化而来。

2.1 HD-MEA 芯片的涂覆

1. 将 HD-MEA 芯片放在采集记录平台上，向储液器中填充 PBS，并在涂覆前测试芯片。启动 BrainWave 软件。选择 文件 > 新记录 session。设置记录参数：记录频率 50 Hz，采样频率 18 kHz/电极。更改放大器偏移以校准芯片
2. 灭菌和预处理 HD-MEA：
   • 在超净工作台下，用浸有 96% 乙醇（EtOH）的纸巾擦拭芯片和玻璃环，然后将每个设备放入无菌 100 mm × 20 mm 培养皿中，向 MEA 储液器中加入 70% EtOH 放置 20 分钟
   • 吸出 EtOH，用无菌过滤 dd 水清洗储液器 3 次。加入 1 mL 预处理培养基并在 37°C、5% CO₂ 中过夜孵育
3. 涂覆 HD-MEA：次日，吸出预处理培养基。加入 1 mL 0.1 mg/mL 聚-dl-鸟氨酸（PDLO）以涂覆整个有源区域。在 37°C 孵育过夜
4. 准备并预热培养基至室温
5. 吸出 PDLO，用 dd 水清洗 3 次，让芯片在超净工作台下干燥 10 分钟
6. 在芯片旁边放一个装满无菌过滤 dd 水的 35 mm × 10 mm 培养皿，以保持适当的湿度并避免下一步中接种细胞蒸发

2.2 人 iPSC 神经元在 HD-MEA 中的铺板和维护

1. 解冻并将细胞稀释至所需的每微升细胞浓度（如 1000 个细胞/μL，在 HD-MEA 上 50 μL 滴中获得 50,000 个细胞密度）
2. 使用高层粘连蛋白点种培养基将细胞悬液移液到芯片有源区域表面
3. 在 37°C、5% CO₂ 中孵育 45-60 分钟
4. 在 HD-MEA 储液器中轻轻填充 2 mL 培养基
5. 在接种后第 1 天（DIV1）用室温培养基进行 100% 换液。每 3-4 天换 50% 培养基。在整个实验过程中将 HD-MEA 保持在 37°C、5% CO₂ 中孵育
6. 可选：在 DIV4-DIV8 之间，在用 >70% EtOH 清洁载物台后，在正置微分干涉对比（DIC）显微镜下检查细胞培养生长进度

3. 离体和体外大规模神经记录

3.1 脑切片记录工作区的准备

1. 脑切片恢复期间，将所需工具放置在每个指定工作区
2. 用 0.1 mg/mL PDLO 涂覆 HD-MEA 芯片以增强组织 - 芯片耦合，并在 37°C 孵育 20 分钟
3. 在芯片孵育期间，用记录 aCSF 填充基于重力的灌注系统和管线。确保灌注系统持续通气。设置流速为 4.5 mL/min，温度为 37°C
4. 将 HD-MEA 芯片放在采集记录平台上，向储液器中填充 aCSF，测试灌注系统并排除任何剩余的系统噪声
5. 通过房间照明系统或光学平台上的遮光罩确保记录区域黑暗
6. 将立体显微镜与 HD-MEA 芯片储液器和有源区域对齐以进行图像采集
7. 将锚放置在芯片储液器中使其平衡
8. 将药理学化合物添加到适当的灌注管中

3.2 使用 HD-MEA 从 HC 和 OB 切片进行回路范围记录

⚠️ 注意：切片耦合应尽快进行，以避免切片缺氧。从将显微解剖的切片初步放置在芯片有源区域到最终灌注系统启动，耦合应仅需约 1 分钟。

1. 用玻璃移液管从脑切片恢复室中取出切片，放在持续通气的 90 mm 塑料培养皿中。使用显微解剖工具从周围脑切片组织中分离出 HC 或 OB
2. 用玻璃移液管将分离的 HC 或 OB 急性切片移入 HD-MEA 储液器。用细刷将切片轻轻对齐在 MEA 有源区域上。用吸引系统从 HD-MEA 芯片孔中吸出所有溶液
3. 用镊子将锚轻轻放在切片顶部
4. 向芯片储液器中轻轻添加溶液并启动灌注系统
5. 确保记录区域通过房间照明系统或光学平台上的遮光罩充分调暗
6. 在开始记录或额外药理学调节之前，让切片适应 10 分钟
7. 启动 BrainWave 软件。选择 文件 > 新记录 session。设置记录参数：记录频率 1 Hz，采样频率 14 kHz/电极。更改放大器偏移以校准芯片
8. 按记录开始采集，使用预设的实验条件
9. 在最终记录后立即捕获急性脑切片的光学成像。将切片移回切片恢复室，用刷子去除耦合到芯片的任何有机材料，然后继续下一个切片

3.3 人 iPSC 记录工作区的准备和网络范围记录

1. 用 >70% EtOH 清洁 HD-MEA 采集平台，确保无菌工作环境
2. 在超净工作台下将带有参比的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基盖轻轻放在 HD-MEA 环上。将 HD-MEA 芯片移至 iPSC 记录工作区并将 HD-MEA 芯片连接到采集平台
3. 确保记录区域通过房间照明系统或光学平台上的遮光罩充分调暗
4. 在开始记录或额外药理学调节之前，让 HD-MEA 芯片平衡 10 分钟
5. 启动 BrainWave 软件。选择 文件 > 新记录 session。设置记录参数：记录频率 50 Hz，采样频率 18 kHz/电极。更改放大器偏移以校准芯片
6. 在实验计划的每一天（如 4、8、16、24 DIV）记录人 iPSC 网络的自发放电活动或药理学诱导的响应

⚠️ 注意：不要让芯片在培养箱外停留超过 30 分钟，以维持稳定的温度和湿度并防止细胞温度休克。

7. 在实验过程中将 HD-MEA 在 37°C、5% CO₂ 中孵育

4. HD-MEA 芯片的清洁

1. 实验后，根据适当的废物处置丢弃溶液并用 dd 水冲洗
2. 加入所选洗涤剂，用棉签清洁有源区域和整个储液器，然后丢弃洗涤剂。重新填充洗涤剂，孵育 20 分钟，然后丢弃
3. 用实验室级水彻底冲洗。然后用 dd 水冲洗 3-4 次
4. 使用气压彻底干燥 HD-MEA 芯片

5. HD-MEA 大规模神经记录的分析

5.1 原始数据预处理和事件检测

1. 在 BrainWave 软件中打开记录的原始数据文件（.brw）。选择 分析 > LFP 检测 或 尖峰检测
   • LFP 检测：采用 IIR 滤波，低通 4 阶巴特沃斯滤波器（1-100 Hz）。硬阈值算法包括高阈值 150 μV，低阈值 -150 μV，能量窗口 70-120 ms，不应期 10 ms，最大事件持续时间 1 s
   • 单/多单元尖峰检测：采用 IIR 滤波，高通 4 阶巴特沃斯滤波器（300-3500 Hz）。应用 PTSD 算法，标准差因子 8，峰寿命期 2 ms，不应期 1 ms
2. 对于 HC 和 OB 回路记录，在检测到的事件文件（.bxr）中添加高级工作区选项以导入从立体显微镜捕获的结构光图像

5.2 自定义 Python 计算流水线的数据处理

去噪：

1. 使用自定义编写的 Python 脚本和 h5py 3.6.0 Python 包读取 .bxr 文件
2. 提取与 iPSC 网络记录相关的尖峰序列和与 HC 和 OB 脑切片回路记录相关的 LFP 事件序列
3. 表征事件：总激活电极数小于平均事件平均激活电极数的 0.1% 或 10%，或检测到的事件落在统计合理的放电率范围之外，视为随机事件并移除。此外，应用振幅和事件持续时间阈值
4. 将结果事件序列数据及伴随的时空信息以 .npy 文件格式保存

栅格图：

1. 读取过滤后的事件 .npy 和 .bxr 文件，使用 Matplotlib pyplot 函数生成栅格图
2. 对于具有层特异性的脑切片记录，根据步骤中产生的层对电极 ID 进行排序和分组

平均放电活动：

1. 处理 .bxr 文件中的时间序列数据，计算每个电极的平均放电率（事件数/记录时间）
2. 构建数据矩阵，行和列表示 HD-MEA 64 × 64 阵列中电极的坐标，每个矩阵值表示平均放电率
3. 使用 Matplotlib 的 imshow 或 Seaborn 的 heatmap 函数绘制热图

代表性波形迹线：

1. 从 .brw 文件读取时间序列数据，使用 Matplotlib pyplot 函数生成波形迹线
2. 输入所需电极 ID、时间仓和频率带
3. 定义的频率带包括：低频 LFP 振荡（1-100 Hz），带通滤波的 δ（1-4 Hz）、θ（5-12 Hz）、β（13-35 Hz）和 γ（35-100 Hz）频带；尖波纹（SWR）（140-220 Hz）；高频单单元和多单元活动（300-3500 Hz）

功率谱密度：

1. 从 .brw 文件读取时间序列数据并计算周期图以辨别每个时间序列中振荡活动的主导频率
2. 构建频率 - 时间动态的伪彩色频谱图（使用 Welch 方法）

功能连接：

1. 对于脑切片回路记录：从 .brw 文件读取时间序列数据，使用皮尔逊相关系数（PCC）计算 64 × 64 阵列中活动电极对之间的交叉协方差
2. 使用多元格兰杰因果关系将向量自回归模型拟合到时间序列，以量化一个时间序列对另一个时间序列的影响
3. 应用定向传递函数（DTF）评估相关链路内的方向信息流
4. 对于 iPSC 记录：从 .bxr 文件读取尖峰序列数据，使用 spike_train_correlation 函数计算所有分箱尖峰序列组合之间的 64×64 PCC 相关系数矩阵
5. 对连接矩阵实施时空滤波器（STF）和距离依赖性延迟阈值（DdLT）滤波程序，以消除超过最大传播速度（设为 400 mm/s）的潜在配对连接
6. 从结果交叉相关矩阵中提取负峰值，使用滤波和归一化交叉相关直方图（FNCCH）算法识别抑制性连接

网络连接图：

1. 在 Gephi 程序 9.2 版本中打开数据实验室以绘制特定时间仓的动态图
2. 在布局窗口中应用 Geo Layout 进行空间映射
3. 对度范围和边权重放置参数约束以进行比较
4. 分配节点颜色、边大小和度大小以更好地可视化

代表性结果

多模态时空映射和振荡放电特征提取

为量化从动态神经元集合中出现的网络范围 LFP 和尖峰事件，我们研究了 HC 和 OB 回路以及人 iPSC 网络中的同步大规模放电模式。

首先，对所有记录的数据集进行事件检测和去噪，并根据回路规范进行区域分辨。接下来，绘制了平均大规模 LFP 和尖峰放电模式的顶部伪彩色空间映射、检测到的事件的栅格图以及滤波波形的代表性 5 秒迹线。

多模态网络范围功能连接组

为从同时放电的神经元集合的同步放电模式中推断多层神经网络的大规模连接，根据协议步骤计算检测到的事件中活动电极对之间的交叉协方差。

HC 和 OB 回路的功能连接组通过应用多元格兰杰因果关系和定向传递函数（DTF）生成，以量化一个时间序列对另一个时间序列的影响，并评估不同网络中相关链路内的方向信息流。

人 iPSC 网络的功能连接组通过应用时空滤波器（STF）和距离依赖性延迟阈值（DdLT）生成，以增强重要链路的选择并通过滤波和归一化交叉相关直方图（FNCCH）分析精炼有意义连接的识别。

讨论

时空神经元活动的复杂动力学，从相互连接的神经元集合中出现，长期以来一直是神经科学中令人感兴趣的主题。传统方法（如膜片钳、标准 MEA 和钙成像）为脑复杂性提供了有价值的见解，但它们通常无法捕获全面的网络范围计算动力学。

本 JoVE 研究中详述的 HD-MEA 平台技术协议代表了重大飞跃，提供了从细胞集合到广泛网络的跨不同模态的神经动力学全景视图。

关键优化要点

1. 切片均匀性：使用振动切片机优于组织切碎机，因其精度更高且组织损伤更小
2. 持续通气：从提取到记录整个过程持续通碳氧混合气，以维持组织活力
3. 温度调节：调节温度并在记录前留出足够的恢复时间
4. 琼脂糖块/模具：用于稳定脑，防止撕裂并最小化胶水接触
5. 最佳流速：维持 HD-MEA 储液器内通气 aCSF 的最佳流速，确保切片健康
6. PDLO 涂覆：聚-dl-鸟氨酸促进电极 - 组织界面耦合，提高信噪比
7. 定制铂金锚：进一步增强电极 - 切片界面耦合

局限性和未来方向

• 虽然 HD-MEA 提供了前所未有的空间分辨率，但片上记录仍然受到 CMOS 传感器物理尺寸的限制
• 未来工作应专注于增加电极密度、改善组织 - 芯片界面和开发更高级的分析工具
• 该平台在脑启发建模、神经形态计算和神经学习算法方面具有巨大潜力
• 了解大型神经计算受损的潜在机制及其相互连接的微电路动力学，可能导致识别特定生物标志物，为神经系统疾病开辟更准确的诊断工具和靶向治疗之路

参考文献

1. Emery, B.A., Khanzada, S., Hu, X., Klütsch, D., Amin, H. Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array. J. Vis. Exp. (205), e66473, doi:10.3791/66473 (2024)
2. Amin, H. et al. HD-MEA recordings of large-scale neuronal networks. Nature Protocols (相关研究)
3. 更多参考文献见原文

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