在 CorePlate™ HD-MEA 上测量 FUJIFILM iCell® 神经元共培养网络活动操作协议

合作机构: FUJIFILM Cellular Dynamics
邮箱: cs@3brain.com
最后更新: 2025 年 5 月 27 日
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目录

1. 简介
2. 材料清单
3. 工作流程
4. 计算正确的细胞数量
5. 结果
6. 支持

1. 简介

高密度微电极阵列（HD-MEA）技术为实时、非侵入性监测神经元活动提供了强大的平台，在神经生理学和药物发现研究中具有不可替代的价值。通过捕获神经元网络的细胞外电信号，MEA 提供关于神经通讯、网络连接性和对药理学处理的功能反应的高分辨率数据。该技术使研究人员能够同时从大量神经元群体中记录复杂的信号，从而更深入地了解网络动力学和细胞间相互作用。

将 HD-MEA 技术与人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经细胞相结合，能够生成与人类相关的、精确且可扩展的神经元行为和反应研究，为神经科学和治疗开发开辟更具预测性和相关性的应用前景。

本协议描述了在 3Brain 的 HD-MEA（CorePlate™）上培养来自 FUJIFILM Cellular Dynamics 的高质量人类 iPSC 衍生神经元。简要而言，人类等基因 iPSC 衍生的谷氨酸能（iCell® 诱导兴奋性神经元）、抑制性（iCell® GABA 神经元）和胶质细胞（iCell® 星形胶质细胞 2.0）以优化比例共培养，以支持延长培养时间和神经网络活动的发育。由于 MEA 记录是非侵入性和无标记的，可以在实验过程中监测同步爆发神经网络的发展。

本协议基本遵循 FUJIFILM Cellular Dynamics 应用协议：在 MEA 上测量神经网络活动：iCell® 诱导兴奋性神经元与 iCell® 星形胶质细胞 2.0 共培养。已修改以纳入 iCell® GABA 神经元并适配 3Brain CorePlate™。

2. 材料清单

表 1. 设备清单

表 2. 耗材清单

表 3. 软件清单

3. 工作流程

以下工作流程中指定的体积、数量和细胞数已计算为足够在两个 6 孔 CorePlate™ 上培养的材料。

3.1 开始前提示

• 参考 iCell® 诱导兴奋性神经元、iCell® GABA 神经元和 iCell® 星形胶质细胞 2.0 的用户指南，了解细胞和培养基补充剂的储存和处理信息
• 参考 FUJIFILM Cellular Dynamics 应用协议（扫描封面二维码）获取额外的处理和试剂准备提示

3.2 灭菌和板预处理

开始前，请参考 HyperCAM-Alpha 用户指南第 19 页的板灭菌步骤。

为确保最佳亲水性，建议在涂覆程序前将板与 1.5 ml/孔完全培养基过夜孵育。

3.3 准备 PEI 溶液

在使用前一周内完成。

1. 称量一个 15 ml 离心管。这将用于第 3 步
2. 准备 PEI 的中间溶液（10% w/w）：将约 2 ml 的 50% PEI 储备液倒入之前的 15 ml 离心管中。PEI 是粘性材料，因此使用 25 ml 血清学移液器以最低速度吸取。在 400g 离心 5 分钟
3. 通过称量含 PEI 的 15 ml 离心管并减去初始重量来确定 PEI 溶液的重量（克）。将储备液用水稀释至已知体积

💡 示例计算：2 g 的 50% PEI 储备液用 8 ml 无菌水稀释至最终体积 10 ml，获得中间 10% PEI 溶液（w/w）。

4. 在 15 ml 离心管中混合中间 10% PEI 溶液以溶解。该中间 10% PEI 溶液应分装并在 -20°C 储存以备将来使用，避免多次冻融循环

可能需要延长涡旋或在室温下在台式摇床上混合过夜以完全溶解。

10% PEI 溶液在使用前需要用 1X 硼酸盐缓冲液进一步稀释至 0.1%：

5. 通过将 50 μl 20X 硼酸盐缓冲液与 950 μl 无菌水混合，准备 1 ml 1X 硼酸盐缓冲液
6. 通过将 10 μl 中间 10% PEI 溶液与 990 μl 1X 硼酸盐缓冲液混合，准备工作 0.1% PEI 溶液。通过 0.22 μm 孔径滤器无菌过滤工作溶液

💡 建议：每次使用前新鲜配制 0.1% PEI 工作溶液。如需，可提前几天配制并在 4°C 储存最多一周。

3.4 用 PEI 涂覆 6 孔 CorePlate™

在解冻前一天完成。

1. 完全吸出孔中的培养基
2. 用 80 μl 无菌去离子水冲洗记录区域
3. 吸出水并让记录区域在进行第 4 步之前完全干燥
4. 向 6 孔 CorePlate™ 分配 80 μl/孔 的 0.1% PEI 工作溶液。将基质散布在整个芯片上，确保整个培养区域被覆盖（液滴必须呈正方形，如右图所示）。如果没有，使用移液器吸头确保将基质液滴塑造成芯片的形状

图 1：培养区域上液滴放置示例（左：错误放置，右：正确放置）

5. 在 37°C 孵育 1 小时
6. 从板中吸出 PEI 溶液。不要让孔干燥
7. 立即用每孔 80 μl 无菌水冲洗板
8. 用每孔 80 μl 无菌 DPBS 冲洗板
9. 在超净工作台下打开盖子让板风干

3.5 解冻当天

准备培养基并让其达到室温：

表 4. BrainPhys™ 培养基

a. 解冻 iCell® 星形胶质细胞 2.0（Astro 2.0）

1. 向 50 ml 无菌离心管中加入 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基
2. 将冷冻管浸入 37°C 水浴中 2 分钟
3. 使用 1 ml 移液器将细胞轻轻转移到离心管中，同时 swirling 管子
4. 用 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基冲洗小瓶，并在 swirling 管子的同时缓慢逐滴加入
5. 逐滴加入额外的 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基
6. 转移到 15 ml 离心管。轻轻倒置管子 2-3 次以使细胞均匀分布
7. 取出 20 μl（加入 0.5 ml 管）进行手动细胞计数

b. 解冻 iCell® GABA 神经元（GABA）

1. 向 50 ml 无菌离心管中加入 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基
2. 将冷冻管浸入 37°C 水浴中 2 分钟
3. 使用 1 ml 移液器将细胞轻轻转移到离心管中，同时 swirling 管子
4. 用 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基冲洗小瓶，并在 swirling 管子的同时缓慢逐滴加入
5. 逐滴加入额外的 5 ml 完全 BrainPhys™ 培养基
6. 转移到 15 ml 离心管。轻轻倒置管子 2-3 次以使细胞均匀分布
7. 取出 20 μl（加入 0.5 ml 管）进行手动细胞计数

c. 解冻 iCell® 诱导兴奋性神经元（IEN）

1. 向 50 ml 无菌离心管中加入 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基
2. 将冷冻管浸入 37°C 水浴中 2 分钟
3. 使用 1 ml 移液器将细胞轻轻转移到离心管中，同时 swirling 管子
4. 用 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基冲洗小瓶，并在 swirling 管子的同时缓慢逐滴加入
5. 逐滴加入额外的 1 ml 完全 BrainPhys™ 培养基
6. 转移到 15 ml 离心管。轻轻倒置管子 2-3 次以使细胞均匀分布
7. 取出 20 μl（加入 0.5 ml 管）进行手动细胞计数
8. 在 400g × 5 分钟离心细胞，然后进行计数步骤

d. 细胞计数

1. 向每个 0.5 ml 管中加入 20 μl 台盼蓝
2. 轻轻移液并将 10 μl 溶液添加到改良 Neubauer 计数板两侧网格的顶部，用盖玻片覆盖
3. 将计数板放在显微镜下，使用 4X 或 10X 物镜计数细胞
4. 仅计数中央 5×5 网格（A）内的细胞，按照 B 中所示的方法。此外，计数上双线和右双线（边缘）上的细胞，但不计数底部双线和左双线（C）上的细胞

图 2：使用 Neubauer 计数板计数细胞的方法示意图

5. 在传递到下一种细胞类型之前，用 70% 乙醇擦拭计数板和盖玻片

4. 计算正确的细胞数量

首先，计算在计数板两侧计数的细胞平均值。由于方格的体积为：

0.1 cm × 0.1 cm = 0.01 cm² 计数面积

由于计数室深度为 0.01 cm：

0.01 cm² × 0.01 cm = 0.0001 cm³ = 0.0001 ml = 0.1 μl

要获得细胞数/ml：

计数的细胞 × 10000（1 ml = 0.1 μl × 10000）

由于细胞用台盼蓝 1:1 稀释，我们将结果 × 2。

最后，要获得管中的确切细胞数，乘以最终溶液体积。

示例：

• iCell® Astro 2.0 = 25 × 10k = 250k × 2 = 500k × 4（ml）= 200 万
• iCell® GABA = 36 × 10k = 360k × 2 = 720k × 8（ml）= 576 万
• iCell® IEN = 21 × 10k = 210k × 2 = 420k × 4（ml）= 168 万

从离心机收集细胞，通过手动倒出液体去除上清液。剩余体积应约 100 μl。通过加入 900 μl 培养基轻轻重悬细胞，使最终体积为 1 ml 中具有计算的数量。

4.1 计算正确的接种细胞数量

建议的每孔接种细胞比例为：

以下为在 3 个孔中接种的适当细胞数示例：

接种体积固定为 80 μl，因此请在 1.5 ml 管中准备每个条件，最终体积达到 560 μl（7+1 孔）。

计算每种细胞类型在 1.5 ml 管中添加的体积：

示例：iCell® IEN
58k × 7（孔）= 406k；1680000（总细胞数）÷ 1000（μl 最终体积）= 406000（所需细胞数）÷ x = 242 μl

按照示例，我们将有：

• iCell® IEN 406k = 242 μl
• iCell® GABA 133k = 23 μl
• iCell® Astro 2.0 91k = 45.5 μl
• 培养基 = 249.5 μl（达到 560 μl 最终体积）

将细胞接种到 6 孔 CorePlate™ 的芯片上，从周边开始均匀分布在整个表面积上。

将板放入培养箱中。

4.2 添加培养基

90 分钟后，使用 1 ml 移液器吸头，以圆形方式在含细胞的液滴周围轻轻加入 350 μl 培养基，直到两个液相相互接触。将多孔板放入培养箱中。

2-3 小时后，向每个孔轻轻缓慢加入 1 ml 培养基。将多孔板放入培养箱中。

然后每 2-3 天或记录 session 前一天更换 50% 培养基。

5. 结果

细胞中的电活动可以在 2-3 周内（通常从第 18 天开始）记录，但时间可能因培养条件和芯片上的细胞数而异。在 4-6 周之间观察到稳定的网络活动，细胞保持活性至第 69 天，但始终建议通过预实验找到最佳实验窗口。

图 3：代表性 Spike Map 显示接种后第 25、32 和 39 天培养的空间平均放电率。随着培养物成熟，以每秒尖峰数（spikes/s）测量的功能活动增强。

图 4：在不同发育时间点观察到的相同三个通道的代表性图像。明显的是，随着尖峰更密集的聚集，爆发持续时间增加。

图 5：Raster Plots 显示接种后第 25、32 和 39 天培养的功能活动。图显示平均放电率 ≥ 0.1 spk/s 的单元。

图 6：从第 25 天到第 60 天测量的平均放电率。可以观察到网络在第 35 天在芯片上达到稳定性，并维持至约第 60 天，之后开始下降。

图 7：在接种后第 25、32 和 39 天测量的平均放电率（a）、峰间间隔变异系数（b）和峰峰值振幅（c）。统计显著性：a) ** p = 0.0029, **** p < 0.0001; b) ** p = 0.0138, ** p = 0.0022; c) * p < 0.0091（单因素 ANOVA）。

图 8：在接种后第 25、32 和 39 天测量的每次爆发尖峰数（a）和爆发持续时间（b）。统计显著性：**** p < 0.0001（单因素 ANOVA）。

图 9：在接种后第 25、32 和 39 天测量的网络爆发持续时间（a）、每次网络爆发尖峰数（b）和网络爆发内平均峰间间隔（c）。虽然网络爆发持续时间在第 32 天稳定，但该图显示网络爆发内尖峰密度增加，如每次爆发尖峰数（b）和每次爆发内峰间间隔（ms）（c）所示。**** p < 0.0001; c) * p = 0.0138（单因素 ANOVA）。

图 10：在接种后第 25、32 和 39 天的连接图（a），以及在相同时间点测量的节点数（b）、连接数（c）和 rich-club 效应。虽然节点数（定义为至少有一个传入或传出连接的单元）在第 32 天达到平台期，但网络的复杂性继续增加，如连接数的增加和 rich-club 效应的增强所示。

6. 支持

如有任何进一步问题，请联系我们的客户成功团队：cs@3brain.com

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