原代胚胎背根神经节细胞（E18）CorePlate™ 培养与记录操作协议

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最后更新: 2025 年 8 月 27 日
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1. 简介
2. CorePlate™ DRG 培养前准备
3. 解剖与细胞分离
4. 接种程序
5. 记录

1. 简介

本协议描述了如何使用 CorePlate™ 1W 38/60 和 6W 38/60（以下统称 CorePlate™，单独提及时分别称为 CorePlate™ 1W 或 CorePlate™ 6W）从大鼠胚胎（E18）中分离、培养和记录背根神经节细胞（DRG）。

1.1 CorePlate™ 操作、清洁、灭菌和亲水化

有关 CorePlate™ 操作的详细说明，或如何清洁、灭菌和亲水化 CorePlate™ 以准备本协议，请参考：

• CorePlate™ 1W 38/60 操作、清洁、灭菌和亲水化指南
• CorePlate™ 6W 38/60 操作、清洁、灭菌和亲水化指南

2. CorePlate™ DRG 培养前准备

为了使 CorePlate™ 电极上形成健康的细胞层，芯片的有源区域必须涂覆适当的粘附因子。

⚠️ 注意：不要将 CorePlate™ 6W 直接放置在金属工作台上。在培养箱或超净工作台中使用时，请在 CorePlate™ 6W 下方放置塑料托盘。金属表面的静电荷可能损坏片上电路并导致设备损坏。

2.1 CorePlate™ 涂覆

涂覆应在灭菌后（见第 1.1 节）在层流罩下进行，步骤如下：

1. 用 1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）* 填充储液器

2. 对于 CorePlate™ 1W，放入无菌培养皿中并盖上盖子，在 37°C 过夜孵育。对于 CorePlate™ 6W，确保盖上其自带盖子，在 37°C 过夜孵育

3. 移除 PBS，用无菌 ddH₂O 清洗一次。移除无菌 ddH₂O 并让芯片干燥

4. 干燥后，在有源区域添加一滴（70-80 µL）多聚鸟氨酸（50 μg/ml）或聚-D-赖氨酸（100 μg/ml）

图 1：CorePlate™ 1W 和 6W 孔示意图，有源区域中间的粘附因子溶液滴（黑色圆圈）。参比电极仅存在于 CorePlate™ 1W 上。

💡 提示：为避免小体积液体蒸发，CorePlate™ 1W 可放在培养皿中，旁边放一个装有 2 mL 无菌水的较小敞开培养皿。使用 CorePlate™ 6W 时，在孔间空间添加无菌水。

5. 将 CorePlate™ 按第 2 点描述在培养箱中过夜孵育

6. 用约 100 µL 无菌 ddH₂O 清洗有源区域两次，以去除粘附因子溶液

7. 在有源区域添加一滴（70-80 µL）层粘连蛋白（Laminin，25-50 μg/ml）

8. 将板在培养箱中孵育至少 4-6 小时，最长过夜

9. 移除粘附因子，用约 100 µL 无菌 ddH₂O 清洗有源区域两次

10. 将 CorePlate™ 放在层流罩下直至完全干燥（通常 5 分钟），然后用培养皿盖覆盖 CorePlate™ 1W 或用自带盖覆盖 CorePlate™ 6W

*此步骤可增加芯片亲水性，从而促进细胞粘附。

3. 解剖与细胞分离

使用冰预冷的含葡萄糖 HBSS 溶液进行组织解剖。

将解剖后的组织收集在 15 mL 锥形管中。溶液和分离的组织必须保持在冰上。

3.1 酶解离

移除溶液，将组织重悬于以下解离溶液中：

• 胰蛋白酶 0.25% + DNA 酶 0.05%（10 mg/ml），溶于不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 中

在 37°C 孵育 25 分钟，最好在水浴中。

3.2 终止酶活性

移除酶溶液后，加入以下溶液约 3 分钟，以终止胰蛋白酶的酶活性：

• 预热的 Neurobasal Plus（Thermo Fisher Scientific）+ 10% FBS（热灭活）

让 DRG 在锥形管底部沉降，轻轻移除含血清的培养基并重悬组织。

3.3 机械解离

1. 用火焰抛光的巴斯德移液器轻轻吹打组织，直至溶液均匀（约 10-15 次）。吹打细胞时注意不要产生气泡

2. 使用 40 μm 细胞筛网过滤细胞悬液，并在 1100 rpm 离心 5 分钟

3. 将细胞重悬于完全 Neurobasal-Plus 培养基中：

   • 完全 Neurobasal-Plus 培养基：
     • Neurobasal Plus
     • GlutaMAX 1%
     • B27 Plus 2%
     • NaCl（5 mg/ml）
     • 神经生长因子（NGF）2.5S 100 ng/ml
     • 庆大霉素 25 μg/ml

4. 用血球计数板计数细胞并计算适当浓度（每个大鼠胚胎通过解剖 14-16 个神经节应获得约 2.5×10⁵ 个 DRG 细胞，用于接种一个 CorePlate™ 6W 或 6 个 CorePlate™ 1W）

4. 接种程序

细胞计数后，将细胞重悬于完全 Neurobasal-Plus 中：

1. 稀释细胞悬液，以 35k 细胞的浓度，在 CorePlate™ 有源区域中心接种 70 μL 体积的细胞悬液（图 2a）

⚠️ 注意：接种时移液器吸头不要接触有源区域。

2. 让细胞在 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中粘附预处理过的有源区域至少 1.5 小时

💡 提示：为避免因强烈蒸发导致的渗透压失衡，CorePlate™ 1W 可放在培养皿中，旁边放一个装有 2 mL 无菌水的较小敞开培养皿。使用 CorePlate™ 6W 时，在孔间空间添加无菌水。

3. 细胞粘附后，在原始液滴周围添加约 700 μL 预热的完全 Neurobasal-Plus（避免脱离细胞）（图 2b 绿色区域）。随后，孵育 6-12 小时后再添加 1000 μL 培养基，使最终体积达到 1700-1800 μL

图 2：CorePlate™ 1W 和 6W 孔示意图，有源区域（黑色）上的初始接种液滴（70 μL）（a），以及添加 700 μL 预热完全 Neurobasal-Plus 的区域（绿色）（b）。参比电极仅存在于 CorePlate™ 1W 上。

4. 在 24-36 小时内，通过暴露于抗有丝分裂试剂如阿糖胞苷（ARA-C），浓度 2 μM，持续 48 小时，最小化胶质卫星细胞和施旺细胞部分的过度生长

5. 进行完全换液

4.1 培养维护

将培养有胚胎 DRG 神经元的 CorePlate™ 保存在 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中，直至进行记录。每 3 天进行 50% 换液。

应每 2-3 天目视检查 pH 值。如果培养基颜色指示酸化过程（从粉色变为橙黄色），则应更换培养基。

5. 记录

培养的胚胎 DRG 神经元从 DIV6 开始显示自发放电活动。下图显示了在 CorePlate™ 1W 上接种的 DRG 神经元，DIV5（A）和 DIV11（B）。

图 3：CorePlate™ 1W 上接种的 DRG 神经元，DIV6（A）和 DIV11（B）

建议在记录前 36 小时内避免对培养的神经元施加任何压力（例如，如果需要换液，最好在记录前两天进行）。

在 CorePlate™ 上多个时间点对神经元进行记录时，保持无菌状态至关重要。

5.1 CorePlate™ 1W 记录期间的无菌维持

使用 CorePlate™ 1W 在多个时间点进行记录时，使用层流罩将 CorePlate™ 1W 带膜盖放在 CorePlate™ 1W 上以防止污染。透明氟化乙烯丙烯（FEP）膜允许气体扩散，但限制蒸发，从而减少对湿润大气的需求。盖子可在 120°C 高压灭菌 20 分钟。

放置 CorePlate™ 1W 带膜盖后，即可进行记录。

记录 session 结束后，在层流罩中移除 CorePlate™ 1W 带膜盖，将 CorePlate™ 1W 放入无菌培养皿中。将 CorePlate™ 1W 保存在 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中，直至下次记录。

⚠️ 注意：如果在层流罩外打开运输 CorePlate™ 的培养皿，请在将 CorePlate™ 放入培养箱之前，更换为新的无菌培养皿。

5.2 CorePlate™ 6W 记录期间的无菌维持

使用 CorePlate™ 6W 在多个时间点进行记录时，使用 CorePlate™ 6W 盖子以防止污染。确保在记录期间始终盖上盖子，除非在层流罩中。盖子可通过紫外线和/或乙醇灭菌（请参考 CorePlate™ 6W 操作、清洁、灭菌和亲水化指南）。记录 session 结束后，将 CorePlate™ 6W 放回 37°C、5% CO₂ 湿润培养箱中，直至下次使用。

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