脑切片 HD-MEA 记录操作协议

作者: Giacomo Sciacca, Alessandro Maccione
原文: Protocol for recording brain slices on HD-MEA
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目录

1. 切片制备
   • 1.1 一般建议
   • 1.2 小脑制备
   • 1.3 皮层-海马切片制备
   • 1.4 嗅球制备
2. 灌注
   • 2.1 推荐灌注系统
   • 2.2 灌注线接地
3. 脑切片定位
4. 参考文献

1. 切片制备

脑切片制备是成功实验的重要步骤。要获得良好的切片，应使用优质振动切片机（vibratome），尽量减少切片过程中的伪影、压缩变形、细胞破坏和其他有害效应。根据我们的经验，为最小化切片效应，推荐使用 Leica VT1200 振动切片机。

1.1 一般建议

• 动物年龄：年轻动物通常提供更高的基础活动
• 时间至关重要。良好的制备从动物处死到切出第一片大约需要 5-8 分钟。避免让脑组织长时间暴露在空气中而没有通氧溶液保护
• 必须充分通氧，溶液应有足够的气泡
• 确保脑组织始终处于良好通氧状态。准备一个装有切割液的培养皿，持续通氧并保持冰冷。将取出的脑组织放入上述培养皿中并准备切片（始终在通氧条件下进行）。不要在通氧良好的腔室外切割脑组织
• 不要使用镊子将脑组织从培养皿移到切割板上的胶上。推荐使用刮刀
• 避免在切割腔内放冰，冰可能稀释溶液并因此改变渗透压，从而损害细胞（特别是表层细胞）。应将冰放在切割腔周围以保持溶液低温
• 不要切得太快。理想切割时间至少 1 分钟；时间更长更好
• 注意快速振荡的刀片，避免（过于）缓慢的振动

1.2 小脑制备

我们建议以矢状面和冠状面制备小脑切片。两种解剖平面均表现出良好的活力。从小脑收集的典型信号是高频自发尖峰活动。

• 推荐平面：矢状面或冠状面
• 厚度：200 – 220 µm

如果记录 2 或 3 周龄动物的切片，请为切割和记录准备以下 Krebs 溶液：

表 1：用于切割和记录年轻动物小脑的 Krebs 溶液

如果记录超过 3 周龄动物的切片，请为切割和记录准备以下 ACSF 溶液：

表 2：用于切割和记录年长动物小脑的 ACSF 溶液

切片后，样本需要在 34°C 孵育 45 分钟，然后在室温下恢复至少 1 小时。

参考: Heerdegen et al., 2021

1.3 皮层-海马切片制备

我们建议以冠状面或水平面制备皮层-海马切片。可以从皮层-海马切片中收集慢振荡信号（局部场电位）和快振荡信号（尖峰活动）。

• 推荐平面：冠状面或水平面
• 厚度：300 µm

如果记录年轻动物（2 或 3 周龄）的切片，请为切割和记录准备两种不同的溶液：

表 3：用于切割和记录年轻动物皮层-海马的 Krebs 溶液

从下表中，将 1 至 8 加入去离子水中制备两种溶液（记录和切割），通气几分钟，然后加入 7 和 8。切割溶液应保持在冰上，用于脑取出和切片期间准备脑组织。记录溶液将用于以下步骤：

• 切片后孵育 40 分钟
• 室温恢复（约 40 分钟）
• 切片记录

⚠️ 如果切片没有用蔗糖保护，外层将受损。如上表所示，记录溶液中氯化钠（NaCl）浓度高，而切割溶液中没有，因为切割溶液需要高浓度蔗糖。

如果记录年老动物（6 或 7 月龄）的切片，请准备如表 4 所示的两种不同溶液：

表 4：用于切割和记录年老动物皮层-海马的 Krebs 溶液

切片后，样本需要在 34°C 孵育 45 分钟，然后在室温下恢复至少 1 小时。

💡 为增强切片兴奋性，可将记录溶液中氯化钾（KCl）的水平增加到 8.5 mM（例如，取 200 mL 循环模式下的记录溶液，加入 1 mL 1M KCl）。或直接（测试）兴奋，准备 10 mL 记录溶液并加入 50 μL 1M KCl，然后开始灌注。

1.4 嗅球制备

我们建议以水平面制备嗅球切片。可以从嗅球切片中收集慢振荡信号（局部场电位）和快振荡信号（尖峰活动）。

• 推荐平面：水平面
• 厚度：300 µm
• 建议记录 8 周龄动物

准备如表 5 所示的两种不同溶液用于切割和记录：

表 5：用于切割和记录嗅球的 Krebs 溶液

切片后，样本需要在 37°C 孵育 45 分钟，然后在室温下恢复至少 1 小时。

参考: Hu et al., 2022

2. 灌注

脑组织需要灌注系统来维持长期记录所需的氧气和适量营养。推荐灌注速率为 2-4 mL/min。入口必须位于 HD-MEA 储液器底部，而出口应位于玻璃环边缘（不接触塑料储液器），在入口的对面。这将保证有效的流通以保持组织通氧（图 1A）。确保出口位置足够高，以避免形成弯月面从固定组织的 harp 上方流过（图 1B）。

图 1：储液器中入口和出口的正确（A）与错误（B）定位示意图

2.1 推荐灌注系统

合适的灌注系统包括：

• 带有 2 条或更多可独立控制管线的蠕动泵（如 Warner PPS2）
• 一个用于入口的磁性灌注歧管支架（如 Bioscience Tools MHolder）
• 一个用于出口的支架（如 Bioscience Tools Suction）
• 一个在线溶液加热器，根据实验模型或环境条件的需要（如 Warner SC-20）

2.2 灌注线接地

BioCAM 系统通常可以在实验台上操作，无需防振台或法拉第笼。然而，与其他记录系统一样，灌注线可能引入噪声（欧洲通常为 50 Hz，美国为 60 Hz，取决于电力线路）。为消除这种低频噪声，需要将灌注线接地到 BioCAM。一个简单的解决方案是为每条管线引入金属旁路（如尖端剪掉的注射针头），用电缆连接到 BioCAM 接地（即系统后部的电缆连接器屏蔽层），如图 2 所示。

图 2：灌注系统接地示意图

3. 脑切片定位

在定位脑切片之前，停止灌注并用塑料移液器排空 HD-MEA 储液器。将脑切片放入带有少量液体的腔室中，借助非常软的刷子，将切片定位在记录区域上方。用塑料移液器尽可能多地移除液体。然后用小移液器（如 100 μL Eppendorf），从包装和有源区域形成的角落吸出剩余液体（图 3A）。确保切片粘附在电极区域，因为电极和切片之间的正确距离（越短越好）对获得良好结果至关重要。然后用镊子将事先用溶液润湿的 harp 放在切片上，确保 harp 不接触外部包装，否则可能影响粘附（图 3B-C）。此外，关键是镊子不要接触有源区域，因为这可能造成损坏。电极相当敏感，应小心不要直接触摸，特别是尖锐的金属或玻璃部件可能损害电极。

用塑料移液器在切片顶部滴几滴溶液，重复吸液操作 3-4 次。然后用溶液填充腔室并开始灌注。如果粘附似乎不够牢固，重复吸液和填充溶液的操作，无需移除 harp。

图 3：脑切片定位示意图（A）以及 harp 的正确（B）与错误（C）定位

3.1 一般建议和提示

• ACSF 用于测试高密度 MEA 和灌注系统。不要将溶液保持低温并通氧以避免 Ca²⁺ 沉积
• 实验日前后用去离子水清洁灌注线至少 10 分钟。实验 session 结束时，用纯乙醇（EtOH）清洁管线 3 分钟，然后用去离子水冲洗至少 10 分钟
• 如果首次使用高密度 MEA 进行脑组织实验，如可能，请从 250/300 μm 小脑切片开始您的首次实验。此类切片具有很强的自发活动，可以立即显示程序是否正确执行

4. 参考文献

1. Heerdegen, M., Zwar, M., Franz, D., Hörnschemeyer, J., Neubert, V., Plocksties, F., Niemann, C., Timmermann, D., Bahls, C., van Rienen, U., Paap, M., Perl, S., Lüttig, A., Richter, A., & Köhling, R. (2021). Mechanisms of pallidal deep brain stimulation: Alteration of cortico-striatal synaptic communication in a dystonia animal model. Neurobiology of Disease, 154. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2021.105341

2. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., & Amin, H. (2022). Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosensors and Bioelectronics, 198, 113834. https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113834

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