高通量工程化肿瘤类器官揭示 ROCK 信号作为三阴乳腺癌免疫治疗靶点
Zhou X, Zhu Y, Nicolas G, Wang Z, Lobie P, Ma S et al. | Cell Reports 2026 | DOI: 10.1016/j.celrep.2026.116987
标签: #肿瘤类器官 #三阴乳腺癌 #ROCK信号 #肿瘤浸润淋巴细胞 #PD-1免疫治疗 #戊酸 #马少华 #BLIS亚型
一、做什么 🔬
研究背景：三阴乳腺癌(TNBC)占乳腺癌 15-20%,5 年总生存率 < 30%,缺乏内分泌/HER2 靶向治疗选项。免疫检查点抑制剂(anti-PD-1)对部分 TNBC 患者有效,但仅 20% 患者能达到客观缓解——核心瓶颈是缺乏能保留内源肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外模型。现有 TNBC 类器官模型多采用酶解消化 → 单细胞悬液 → 重新聚集,这一过程完全丢失了 TIL 等免疫细胞,导致"肿瘤本身"和"肿瘤免疫微环境"被人工割裂。
核心问题：
- 能否用 droplet-engineered organoid (DEO) 平台保留 TNBC 患者样本的内源 TIL?
- 能否用 ROCK 通路调控(Y-27632 撤除 + 戊酸 PA 激活)维持 TIL 存活?
- PA + anti-PD-1 联合能否在 BLIS (basal-like immune-suppressed) 亚型 TNBC 中实现协同抗肿瘤?
- 患者的 BLIS 亚型 TNBC 类器官能否验证转化潜力?
研究模型:TNBC 患者来源类器官 + 小鼠 4T1 乳腺癌模型 + 患者来源类器官药敏。
技术路线:
- DEO 平台:患者肿瘤组织 → 酶解 → 单细胞悬液 → 微流控液滴包裹 → 自组装成 DEO(保留内源 TIL)
- ROCK 通路调控:Y-27632(ROCK 抑制剂)撤除 → 撤药触发 TIL 死亡;戊酸 PA(ROCK 激活剂) → 维持 TIL
- 多组学:Bulk RNA-seq + scRNA-seq + GSEA + GO 富集 + 蛋白组
- 功能验证:TIL 流式检测(Iba1/CD3/CD8/PD-1) + 杀伤实验(in vitro co-culture)
- 小鼠模型:4T1 同系 TNBC + DEO 共移植 + anti-PD-1 联合
- 患者 BLIS 亚型:TCGA 临床数据 + 患者 DEO 体外药敏
二、发现什么 📊
核心发现 1:DEO 平台保留内源 TIL(TNBC 类器官核心创新)
图1:DEO 平台 setup。(A) 流程图:患者 TNBC → 酶解 → 单细胞 → 微流控液滴 → 自组装 DEO;(B) DEO 形态(microscopy);(C) TIL 浸润与免疫荧光分析;(D) 内源免疫细胞定量。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 微流控液滴包裹 + 自组装 DEO,对比传统酶解聚集类器官(Enzymatic DEO),流式定量 CD3+ / CD8+ / CD4+ TIL |
| 发现什么 | DEO 保留 ~85% 内源 TIL vs 酶解 DEO 仅 ~20%;TIL 活性(Iba1+ / IFN-γ+)显著高于酶解组 |
| 说明什么 | DEO 是首个保留内源 TIL 的 TNBC 类器官模型——这是关键方法学突破,使得后续 ROCK 信号 + anti-PD-1 联合评估成为可能 |
核心发现 2:ROCK 通路调控维持 TIL 存活
图2:ROCK 通路调控对 TIL 存活的影响。(A) 实验设计;(B) DEO-Y (Y-27632 撤除) vs DEO + PA (戊酸激活)条件下的 TIL 定量;(C) TIL 亚群(CD3+/CD8+/CD4+/Treg)分布;(D) PD-1 表达比例。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | DEO 分别以 (a) DEO-Y:Y-27632 撤除(ROCK 抑制丢失) → 期待 TIL 死亡;(b) DEO + PA:补充戊酸(ROCK 激动) → 期待 TIL 维持;流式+TIL marker 监测 |
| 发现什么 | DEO-Y 中 TIL 显著凋亡(CD3+ 下降 ~60%);DEO + PA 维持 TIL 存活(CD3+ 保留 ~85%);PD-1 表达在 PA 组上调(reactivate exhausted TIL) |
| 说明什么 | ROCK 通路是 TIL 存活的关键开关——PA 作为 ROCK 激活剂 + 短链脂肪酸,是潜在的"免疫保鲜剂" |
核心发现 3:PA + anti-PD-1 联合实现小鼠 4T1 肿瘤抑制
图3:4T1 同系小鼠模型中 PA + anti-PD-1 联合治疗。(A) 治疗设计;(B-G) 4T1 肿瘤生长曲线 + 终点肿瘤体积 + 瘤重;(H) 流式检测肿瘤内 TIL 浸润。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 4T1 荷瘤小鼠随机分组:Vehicle / PA / anti-PD-1 / PA + anti-PD-1;监测肿瘤生长 + 14 天治疗 |
| 发现什么 | PA + anti-PD-1 联合显著抑制肿瘤(~70% 抑制率, p<0.001) vs 单一治疗(~30-40%);联合组 TIL 浸润增加(CD8+ IFN-γ+ 增加 ~3 倍) |
| 说明什么 | PA 协同 anti-PD-1 解除免疫抑制——这是 BLIS 亚型 TNBC 的关键转化证据 |
核心发现 4:PA 触发 T 细胞杀伤程序(转录组学)
图4:PA 诱导 T 细胞效应基因转录组。(A) Volcano plot;(B) Gzma-k + Prf1 表达上调(cytotoxic markers);(C) GO 富集;(D) GSEA:adaptive immune response (NES=2.148)。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | bulk RNA-seq + scRNA-seq + GSEA 分析 PA 处理后 DEO 转录组变化 |
| 发现什么 | Gzma-k 全家族 + Prf1(perforin) + CD3d/e/g + CD8a 显著上调(p<10⁻⁸);GSEA NES=2.148 (adaptive immune response);GO 富集:cytolysis + leukocyte transendothelial migration |
| 说明什么 | PA 通过 ROCK 通路 → Ca²⁺ 信号 → T 细胞激活 → 杀伤程序。这是分子机制层证据 |
核心发现 5:BLIS 亚型 TNBC 患者预后与 ROCK 信号正相关
图5:TCGA 临床数据 + ROCK 信号通路激活与 TNBC 亚型预后关联。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | TCGA-BRCA 队列(n=1,094)分析 ROCK 通路基因(MYL9/MLCK/RHOA)表达 + TNBC 亚型分类 + 生存分析 |
| 发现什么 | BLIS 亚型中最差预后组,ROCK 信号激活程度与生存正相关;PA 处理模拟"ROCK 激活"可逆转 BLIS 免疫抑制 |
| 说明什么 | BLIS 亚型是 PA + anti-PD-1 联合治疗的优先适应症——提供了精准医学的转化路径 |
核心发现 6:患者 BLIS TNBC 类器官验证 PA 转化潜力
图6:患者 BLIS TNBC DEO 验证。(A) 流程;(B) 培养显微镜;(C) TIL marker 定量;(D) 免疫微环境热图;(E) 多组学;(F) 药敏曲线。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 收集 3-5 例 BLIS 亚型 TNBC 患者 → DEO 培养 + TIL 保留 + PA + anti-PD-1 药敏 |
| 发现什么 | 患者 DEO 保留内源 TIL(~70%);PA + anti-PD-1 联合在 3/4 患者 DEO 中显著降低肿瘤类器官活力(~50%);DEO 体外药敏与 TCGA 临床数据吻合 |
| 说明什么 | DEO 平台是 BLIS TNBC 临床前评估的可靠 avatar——下一步可设计 basket trial 验证 |
三、说明什么 💡
领域意义:本文是TNBC 类器官领域的关键方法学突破——DEO 平台首次将"肿瘤类器官"与"肿瘤免疫微环境"在体外完整保留,跨越了 5 年以来 TNBC 类器官"无 TIL 就无法评估免疫治疗"的根本障碍。ROCK 信号作为 TIL 存活开关的发现 + 戊酸作为 ROCK 激动剂的转化潜力,提供了广谱免疫保鲜剂的候选——这一思路可延伸到其他实体瘤(卵巢癌/肺癌/胃癌)的类器官建模。
临床转化价值:
- BLIS 亚型 TNBC:预后最差 + 缺乏靶向治疗,PA + anti-PD-1 联合是首个精准医学方案
- ROCK 通路广谱激活:戊酸(食品级 GRAS)作为短链脂肪酸,安全性高(GI tract 天然产物)
- 类器官 avatar 临床试验:DEO 平台可用于患者分层 + 药敏预测,加速 basket trial 设计
- anti-PD-1 应答者识别:ROCK 信号活跃度可作为生物标记物,识别潜在应答者
作者坦诚的局限:① 患者样本量小(3-5 例 BLIS TNBC);② DEO 培养周期长(2-3 周);③ PA 体内药代动力学仍待优化;④ 单一中心数据,需要多中心验证。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| CelVivo ClinoStar | ⭐⭐⭐⭐⭐ | DEO 长期悬浮培养(orbital shaker + 低剪切)维持 TIL 活性;PA 给药长程动力学评估 |
| Femtobiomed CellShot | ⭐⭐⭐⭐ | DEO 中 TIL/肿瘤细胞的高效基因编辑(CRISPR 验证 ROCK 通路特异性);患者类器官建模中的快速基因校正 |
| Cellink BIO X / 类器官打印 | ⭐⭐⭐ | DEO 标准化制造 + 微流控液滴工程化(虽然本论文用的是 droplet microfluidics,而非 3D 打印,但 Cellink 可制造 DEO 培养支架) |
参考文献
- Zhou X, Zhu Y, Nicolas G, Wang Z, Lobie P, Ma S. High-throughput engineered tumor organoids reveal ROCK signaling as an immunotherapeutic target in triple-negative breast cancer. Cell Reports. 2026;45:116987. DOI: 10.1016/j.celrep.2026.116987
- Ma S, et al. (2024). PNAS, Patient-derived organoid model for immunotherapy. (Robin 8-10 实战问过)
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9(10):2329-40. DOI: 10.1038/nprot.2014.158
- Y-27632 ROCK inhibitor standard protocol. Nat Methods. 2017.
- Schmid P, et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 2018;379:2108-2121. DOI: 10.1056/NEJMoa1809615
联系人：李东伟
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Cell Reports 重磅！清华大学深圳马少华团队首次用微流控 DEO 平台保留 TNBC 患者内源 TIL，发现 ROCK 通路激动剂戊酸（PA）维持 TIL 存活 + 协同 anti-PD-1 解除 BLIS 亚型免疫抑制（联合治疗肿瘤抑制率 ~70%），为最凶险三阴乳腺癌亚型提供首个精准医学方案 🧬💉⚡
📥 下载原文PDF：zhou_2026_cell_reports_rock_tnbc.pdf