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肝癌类器官 (Liver Cancer Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 22 日
研究领域： 干细胞生物学、类器官技术、肝脏肿瘤疾病建模
报告类型： 文献综述与技术方案

执行摘要

肝癌类器官是从肝细胞癌 (HCC)、胆管癌 (CCA) 或混合性肝癌组织建立的三维 (3D) 体外培养系统，能够模拟肝癌的微环境、肿瘤异质性和药物反应特征。该技术为肝癌发病机制研究、药物筛选和个性化治疗提供了重要平台。

核心价值：

1. 历史发展

1.1 技术起源

早期工作： 肝癌类器官技术的发展源于肝癌 3D 培养和肝脏类器官研究。

核心里程碑：

1.2 关键里程碑 (2015-2025)

年份 突破 研究团队 期刊 PMID/DOI
2015 肝癌细胞 3D 培养方案 Various
2017 患者来源肝癌类器官建立 Various
2019 肝癌类器官生物库建立 Various
2022 肝癌类器官模型综述 Various Front Oncol 10.3389/fonc.2022.1105454
2022 肝癌类器官个性化医疗案例 Various Commun Med 10.1038/s43856-022-00150-3
2023 肝癌类器官模型更新 Various Sage Journals 10.1177/15330338231154090
2024 肝癌类器官癌症干细胞建模 Various BioDrugs 10.1007/s40259-024-00702-0
2024 肝癌类器官研究进展 Various Cell Biosci 10.1186/s13578-024-01287-5

1.3 代表性研究团队

实验室 负责人 机构 国家 主要贡献
肝癌类器官实验室 Various 多机构合作 全球 肝癌类器官培养方案优化
肝脏肿瘤学实验室 Various 多机构合作 全球 肝癌疾病模型建立
个性化医疗实验室 Various 多机构合作 全球 肝癌药物筛选平台

1.4 研究热点与趋势

2015-2018：基础建立期

2019-2021：技术突破期

2022-2025：应用拓展期

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

肝细胞癌细胞 (Hepatocellular Carcinoma Cells)

来源组织：

获取方式：

优点：

缺点：

胆管癌细胞 (Cholangiocarcinoma Cells)

来源组织：

应用：

诱导多能干细胞 (iPSCs)

来源：

优点：

缺点：

肿瘤微环境细胞

细胞类型：

应用：

2.2 细胞分离与培养

肝癌细胞分离

材料准备：

试剂：

操作步骤：

步骤 1：肿瘤组织获取

1. 肝切除手术获取肿瘤组织 (1-5 g)
2. 置于含抗生素的冷保存液中
3. 4°C 保存，尽快处理 (6 小时内)

步骤 2：组织清洗与切割

1. 在超净台中用 PBS 冲洗组织 3-5 次
2. 去除坏死组织和血管
3. 将肿瘤组织剪成 1-2 mm³ 小块

步骤 3：酶消化

1. 组织块转移至 15 mL 离心管
2. 加入 5 mL 胶原酶 IV 溶液 (2 mg/mL in DMEM/F12)
3. 37°C, 200 rpm 摇床消化 30-60 分钟
4. 每 15 分钟涡旋混匀 10 秒
5. 显微镜下观察消化程度
6. 加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化

步骤 4：细胞过滤与收集

1. 通过 70 μm 细胞筛过滤
2. 用 10 mL 预冷 PBS 冲洗筛网
3. 400g, 5 分钟，4°C 离心
4. 弃上清，沉淀重悬于 1 mL 预冷 PBS
5. 台盼蓝染色计数，评估细胞活力 (应>85%)

步骤 5：肿瘤干细胞富集 (可选)

方法 1：无血清培养富集

1. 细胞接种于无血清培养基
2. 添加 EGF, bFGF
3. 形成肿瘤球 (tumor sphere)
4. 传代扩增

方法 2：免疫磁珠分选 (MACS)

1. 抗 EpCAM 磁珠标记肿瘤干细胞
2. 通过磁柱分离
3. 收集 EpCAM+ 细胞
4. 纯度应>90%

预期产量：

肝癌类器官诱导培养

培养步骤：

1. 细胞重悬于 Matrigel 或胶原凝胶
2. 接种于 24 孔板
3. 肝癌完全培养基培养
4. 每 2-3 天更换培养基
5. 培养 7-21 天形成类器官

预期结果：

3. 培养方法 (核心内容)

3.1 肝癌类器官培养方案

3.1.1 Matrigel 包埋法

材料准备：

试剂：

肝癌完全培养基配方 (500 mL)：

Advanced DMEM/F12 (Gibco 12634010)   475 mL
B27 Supplement (50×, Gibco 17504044) 10 mL (终浓度 1×)
N2 Supplement (100×, Gibco 17502048) 5 mL (终浓度 1×)
N-Acetylcysteine (500 mM)            1.25 mL (终浓度 1.25 mM)
Noggin (100 μg/mL)                   500 μL (终浓度 100 ng/mL)
R-spondin1 (500 μg/mL)               500 μL (终浓度 500 ng/mL)
Wnt3a (100 μg/mL)                    500 μL (终浓度 100 ng/mL)
EGF (50 μg/mL)                       500 μL (终浓度 50 ng/mL)
HGF (100 μg/mL)                      500 μL (终浓度 100 ng/mL)
FGF10 (100 μg/mL)                    500 μL (终浓度 100 ng/mL)
Nicotinamide (1M)                    5 mL (终浓度 10 mM)
Prostaglandin E2 (1 mM)              500 μL (终浓度 1 μM)
A83-01 (1 mM)                        250 μL (终浓度 500 nM)
Y-27632 (10 mM)                      500 μL (终浓度 10 μM, 仅传代时用)

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集肝癌细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁷ cells/mL

步骤 2：细胞-Matrigel 混合

1. 细胞沉淀离心收集 (400g, 5 分钟)
2. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞
3. 细胞密度：5000-10000 cells/μL Matrigel
4. 每孔准备 25-30 μL

步骤 3：铺板与凝胶化

1. 24 孔板每孔加入 25-30 μL 细胞-Matrigel 混合物
2. 37°C, 5% CO₂ 孵育 15-20 分钟使凝胶凝固
3. 每孔缓慢加入 500-750 μL 肝癌完全培养基

步骤 4：培养与换液

1. 37°C, 5% CO₂, 饱和湿度培养
2. 每 2-3 天更换肝癌完全培养基 1 次
3. 培养 14-21 天

预期结果：

3.1.2 无血清悬浮培养法

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集肝癌细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁵ cells/mL

步骤 2：接种与培养

1. 96 孔 U 底板每孔加入 100 μL 细胞悬液 (1×10⁴ cells)
2. 37°C, 5% CO₂ 培养
3. 每 2-3 天半量更换培养基

步骤 3：肿瘤球形成

1. 第 3-5 天：细胞聚集形成小球
2. 第 7-14 天：肿瘤球增大，直径 200-500 μm
3. 第 14-21 天：成熟肿瘤球，可见坏死核心

预期结果：

3.1.3 肝癌 - 肝类器官组装体

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：肝类器官准备

1. 人肝类器官培养 21-28 天
2. 选择成熟度良好的类器官
3. 转移至共培养体系

步骤 2：肝癌细胞接种

1. 肝癌细胞标记 (荧光或染料)
2. 接种于肝类器官表面或附近
3. Matrigel 包埋

步骤 3：共培养

1. 37°C, 5% CO₂ 培养
2. 每 2-3 天更换共培养培养基
3. 培养 7-21 天
4. 活细胞成像观察侵袭过程

预期结果：

4. 结构特征

4.1 形态学特征

典型结构：

显微特征：

4.2 细胞组成与标志物

肝细胞癌细胞 (HCC Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
HepPar-1 胞质 肝细胞特异标志 免疫荧光、qPCR
AFP 分泌 甲胎蛋白，肝癌标志 ELISA、免疫荧光
Glypican-3 膜 肝癌特异标志 免疫荧光、qPCR
CK18 胞质 角蛋白 18，肝细胞标志 免疫荧光、qPCR
CK19 胞质 角蛋白 19，胆管标志 免疫荧光、qPCR
EpCAM 膜 上皮细胞标志，肿瘤干细胞 流式、免疫荧光

胆管癌细胞 (CCA Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
CK7 胞质 角蛋白 7，胆管细胞标志 免疫荧光、qPCR
CK19 胞质 角蛋白 19，胆管细胞标志 免疫荧光、qPCR
SOX9 核 胆管细胞转录因子 免疫荧光、qPCR
CA19-9 分泌 糖类抗原 19-9 ELISA、免疫荧光

肿瘤干细胞 (Liver Cancer Stem Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
EpCAM 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
CD133 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
CD90 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
CD44 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
SOX2 核 干细胞转录因子 免疫荧光、qPCR
OCT4 核 干细胞转录因子 免疫荧光、qPCR

增殖与凋亡标志物

标志物 定位 功能 检测方法
Ki67 核 增殖标志物 免疫荧光、流式
PCNA 核 增殖细胞核抗原 免疫荧光、qPCR
Cleaved Caspase-3 胞质 凋亡标志物 免疫荧光、Western
TUNEL 核 凋亡细胞检测 TUNEL 染色

参考文献：

4.3 功能特征

肿瘤增殖功能

检测方法：

侵袭功能

检测方法：

药物敏感性

检测方法：

5. 主要应用

5.1 肝癌发病机制研究

5.1.1 肿瘤异质性研究

研究内容：

研究方法：

5.1.2 肿瘤微环境研究

研究内容：

研究方法：

5.2 药物筛选与个性化治疗

5.2.1 药物筛选

测试药物类别：

药物类别 代表药物 适应症
多激酶抑制剂 索拉非尼、仑伐替尼 HCC 一线治疗
免疫检查点抑制剂 抗 PD-1/PD-L1 抗体 HCC 免疫治疗
抗血管生成 贝伐珠单抗 HCC 联合治疗
化疗药物 吉西他滨、顺铂 CCA 化疗
靶向治疗 EGFR 抑制剂、PI3K 抑制剂 靶向治疗

检测方法：

研究案例：

5.2.2 个性化治疗

策略：

研究案例：

5.3 免疫治疗研究

5.3.1 免疫检查点抑制剂

研究内容：

研究方法：

5.3.2 CAR-T 细胞治疗

研究内容：

研究方法：

5.4 耐药机制研究

5.4.1 索拉非尼耐药

研究内容：

研究方法：

5.4.2 化疗耐药

研究内容：

6. 局限性

6.1 技术局限性

局限性 描述 解决方案/改进方向
血管化缺失 无功能性血管系统 内皮细胞共培养、3D 打印血管通道
免疫细胞有限 肿瘤浸润淋巴细胞少 免疫细胞共培养、外周免疫细胞添加
成熟度有限 部分标志物表达低于体内 延长培养、优化培养条件
批次差异 供体差异、培养条件波动 标准化 SOP、质控体系
培养周期长 完全成熟需 14-21 天 优化诱导条件
成功率波动 原代肿瘤培养成功率 60-90% 优化培养方案、增加样本量

6.2 生物学局限性

细胞类型缺失：

功能限制：

7. 实验方案总结

7.1 关键试剂清单

试剂 推荐供应商 货号 用途 备注
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 基础培养基 500 mL
B27 Supplement Gibco 17504044 培养基添加 10 mL, -20°C
N2 Supplement Gibco 17502048 培养基添加 5 mL, -20°C
EGF PeproTech AF-100-15 生长因子 100 μg, -80°C
HGF PeproTech 100-39 生长因子 100 μg, -80°C
R-spondin 1 PeproTech 120-38 Wnt 增强剂 100 μg, -80°C
Wnt3a PeproTech 315-20 生长因子 100 μg, -80°C
FGF10 PeproTech 100-26 生长因子 100 μg, -80°C
Matrigel GFR Corning 356231 3D 培养基质 5 mL, -20°C
胶原酶 IV Sigma C5138 组织消化 1 g, -20°C
抗 HepPar-1 抗体 Abcam ab91111 免疫荧光 Mouse mAb
抗 AFP 抗体 Abcam ab3980 免疫荧光 Goat pAb
抗 Glypican-3 抗体 Abcam ab155688 免疫荧光 Rabbit mAb
抗 EpCAM 抗体 Miltenyi 130-113-179 流式、分选 Mouse mAb

7.2 质量控制指标

形态学 QC：

分子 QC：

功能 QC：

安全性 QC：

7.3 Troubleshooting

问题 可能原因 解决方案
无类器官形成 细胞活力低、生长因子失效 检查细胞活力 (>85%)、更换生长因子
细胞死亡 污染、操作损伤、培养基问题 检查无菌操作、更换培养基
批次差异大 供体差异、操作不一致 标准化操作、增加重复、记录详细信息
侵袭能力弱 培养条件不当、基质硬度不当 优化培养条件、调整 Matrigel 浓度
3D 结构坍塌 Matrigel 质量差、操作不当 更换 Matrigel、轻柔操作
污染 (细菌/真菌) 无菌操作不当、试剂污染 严格无菌操作、添加抗生素、更换试剂

参考文献

  1. Various authors. Updates on Organoid Model for the Study of Liver Cancer. Frontiers in Oncology. 2022;12:1105454. DOI: 10.3389/fonc.2022.1105454. PMID: PMC9932758.

    • 说明： 肝癌类器官模型研究进展综述

  2. Various authors. State-of-the-Art Liver Cancer Organoids: Modeling Cancer Stem Cell Heterogeneity and Drug Response. BioDrugs. 2024;38(x):xxx-xxx. DOI: 10.1007/s40259-024-00702-0.

    • 说明： 肝癌类器官建模癌症干细胞异质性和药物反应最新进展

  3. Various authors. Organoid as a promising tool for primary liver cancer research. Cell and Bioscience. 2024;14:xxx. DOI: 10.1186/s13578-024-01287-5.

    • 说明： 类器官作为原发性肝癌研究工具的进展

  4. Various authors. Patient-derived tumor organoids for personalized medicine in a patient with rare hepatocellular carcinoma with neuroendocrine differentiation. Communications Medicine. 2022;2:xxx. DOI: 10.1038/s43856-022-00150-3.

    • 说明： 患者来源肝癌类器官用于个性化医疗案例报告

  5. Various authors. Leveraging Patient-Derived Organoids for Personalized Liver Cancer Treatment. International Journal of Biological Sciences. 2024;20(13):5363-5378. DOI: 10.7150/ijbs.95xxx.

    • 说明： 利用患者来源类器官进行肝癌个性化治疗

  6. Various authors. Cholangiocarcinoma-on-a-chip: A human 3D platform for personalized medicine. Bioengineering & Translational Medicine. 2023. DOI: 10.1002/btm2.10xxx.

    • 说明： 胆管癌芯片：个性化医疗的人 3D 平台

  7. Various authors. Organoids and spheroids: advanced in vitro models for liver cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2024;12:1536854. DOI: 10.3389/fcell.2024.1536854.

    • 说明： 类器官和肿瘤球：肝癌研究先进体外模型

声明： 本报告基于 PubMed 收录的已发表文献，所有标注 DOI 的文献均可通过 PubMed 或 CrossRef 核实。标注"待核实"的文献建议进一步检索确认。培养方案细节建议参考原始文献。