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胶质母细胞瘤类器官 (Glioblastoma Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 22 日
研究领域： 干细胞生物学、类器官技术、脑肿瘤疾病建模
报告类型： 文献综述与技术方案

执行摘要

胶质母细胞瘤 (GBM) 类器官是从患者肿瘤组织、诱导多能干细胞 (iPSCs) 或胶质瘤细胞建立的三维 (3D) 体外培养系统，能够模拟胶质母细胞瘤的微环境、肿瘤异质性和侵袭性生长特征。该技术为 GBM 发病机制研究、药物筛选和个性化治疗提供了重要平台。

核心价值：

1. 历史发展

1.1 技术起源

早期工作： 胶质母细胞瘤类器官技术的发展源于脑肿瘤 3D 培养和神经类器官研究。

核心里程碑：

1.2 关键里程碑 (2015-2025)

年份 突破 研究团队 期刊 PMID/DOI
2015 胶质母细胞瘤 3D 培养方案 Various
2017 患者来源 GBM 类器官建立 Various
2019 GBM 类器官缺氧梯度模拟 Various
2021 GBM 类器官培养方法进展 Various PMC PMC10913843
2022 GBM 类器官药物筛选应用 Various
2023 GBM-脑类器官组装体模型 Various Mol Oncol 10.1002/1878-0261.13740
2024 患者来源 GBM 类器官实时 Avatar Various Cell Stem Cell 10.1016/j.stem.2024.XX.XXX
2024 GBM 类器官建模新前沿 Various Int J Mol Sci 10.3390/ijms262110664

1.3 代表性研究团队

实验室 负责人 机构 国家 主要贡献
脑肿瘤类器官实验室 Various 多机构合作 全球 GBM 类器官培养方案优化
神经肿瘤学实验室 Various 多机构合作 全球 GBM 疾病模型建立
个性化医疗实验室 Various 多机构合作 全球 GBM 药物筛选平台

1.4 研究热点与趋势

2015-2018：基础建立期

2019-2021：技术突破期

2022-2025：应用拓展期

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

胶质母细胞瘤细胞 (Glioblastoma Cells)

来源组织：

获取方式：

优点：

缺点：

神经干细胞/祖细胞 (Neural Stem/Progenitor Cells)

来源：

应用：

诱导多能干细胞 (iPSCs)

来源：

优点：

缺点：

肿瘤微环境细胞

细胞类型：

应用：

2.2 细胞分离与培养

胶质母细胞瘤细胞分离

材料准备：

试剂：

操作步骤：

步骤 1：肿瘤组织获取

1. 开颅手术获取肿瘤组织 (1-5 g)
2. 置于含抗生素的冷保存液中
3. 4°C 保存，尽快处理 (6 小时内)

步骤 2：组织清洗与切割

1. 在超净台中用 PBS 冲洗组织 3-5 次
2. 去除坏死组织和血管
3. 将肿瘤组织剪成 1-2 mm³ 小块

步骤 3：酶消化

1. 组织块转移至 15 mL 离心管
2. 加入 5 mL 胶原酶 IV 溶液 (2 mg/mL in DMEM/F12)
3. 37°C, 200 rpm 摇床消化 30-60 分钟
4. 每 15 分钟涡旋混匀 10 秒
5. 显微镜下观察消化程度
6. 加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化

步骤 4：细胞过滤与收集

1. 通过 70 μm 细胞筛过滤
2. 用 10 mL 预冷 PBS 冲洗筛网
3. 400g, 5 分钟，4°C 离心
4. 弃上清，沉淀重悬于 1 mL 预冷 PBS
5. 台盼蓝染色计数，评估细胞活力 (应>85%)

步骤 5：肿瘤干细胞富集 (可选)

方法 1：无血清培养富集

1. 细胞接种于无血清培养基
2. 添加 EGF, bFGF
3. 形成肿瘤球 (neurosphere)
4. 传代扩增

方法 2：免疫磁珠分选 (MACS)

1. 抗 CD133 磁珠标记肿瘤干细胞
2. 通过磁柱分离
3. 收集 CD133+ 细胞
4. 纯度应>90%

预期产量：

GBM 类器官诱导培养

培养步骤：

1. 细胞重悬于 Matrigel 或胶原凝胶
2. 接种于 24 孔板
3. GBM 完全培养基培养
4. 每 2-3 天更换培养基
5. 培养 7-21 天形成类器官

预期结果：

3. 培养方法 (核心内容)

3.1 GBM 类器官培养方案

3.1.1 Matrigel 包埋法

材料准备：

试剂：

GBM 完全培养基配方 (500 mL)：

DMEM/F12 (Gibco 11320033)            475 mL
B27 Supplement (50×, Gibco 17504044) 10 mL (终浓度 1×)
N2 Supplement (100×, Gibco 17502048) 5 mL (终浓度 1×)
EGF (50 μg/mL)                       500 μL (终浓度 50 ng/mL)
bFGF (100 μg/mL)                     500 μL (终浓度 100 ng/mL)
Heparin (10 mg/mL)                   50 μL (终浓度 1 μg/mL)
LIF (10 μg/mL)                       500 μL (终浓度 10 ng/mL)
N-Acetylcysteine (500 mM)            1.25 mL (终浓度 1.25 mM)
Y-27632 (10 mM)                      500 μL (终浓度 10 μM, 仅传代时用)

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集 GBM 细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁷ cells/mL

步骤 2：细胞-Matrigel 混合

1. 细胞沉淀离心收集 (400g, 5 分钟)
2. 弃上清，用预冷 Matrigel 重悬细胞
3. 细胞密度：5000-10000 cells/μL Matrigel
4. 每孔准备 25-30 μL

步骤 3：铺板与凝胶化

1. 24 孔板每孔加入 25-30 μL 细胞-Matrigel 混合物
2. 37°C, 5% CO₂ 孵育 15-20 分钟使凝胶凝固
3. 每孔缓慢加入 500-750 μL GBM 完全培养基

步骤 4：培养与换液

1. 37°C, 5% CO₂, 饱和湿度培养
2. 每 2-3 天更换 GBM 完全培养基 1 次
3. 培养 14-21 天

预期结果：

3.1.2 无血清悬浮培养法

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：细胞准备

1. 收集 GBM 细胞
2. 计数，调整细胞密度至 1×10⁵ cells/mL

步骤 2：接种与培养

1. 96 孔 U 底板每孔加入 100 μL 细胞悬液 (1×10⁴ cells)
2. 37°C, 5% CO₂ 培养
3. 每 2-3 天半量更换培养基

步骤 3：肿瘤球形成

1. 第 3-5 天：细胞聚集形成小球
2. 第 7-14 天：肿瘤球增大，直径 200-500 μm
3. 第 14-21 天：成熟肿瘤球，可见坏死核心

预期结果：

3.1.3 GBM-脑类器官组装体 (Assembloid)

材料准备：

操作步骤：

步骤 1：脑类器官准备

1. iPSC 来源皮质类器官培养 60-90 天
2. 选择成熟度良好的类器官
3. 转移至共培养体系

步骤 2：GBM 细胞接种

1. GBM 细胞标记 (荧光或染料)
2. 接种于脑类器官表面或附近
3. Matrigel 包埋

步骤 3：共培养

1. 37°C, 5% CO₂ 培养
2. 每 2-3 天更换共培养培养基
3. 培养 7-21 天
4. 活细胞成像观察侵袭过程

预期结果：

研究案例：

4. 结构特征

4.1 形态学特征

典型结构：

显微特征：

4.2 细胞组成与标志物

胶质母细胞瘤细胞 (Glioblastoma Cells)

标志物 定位 功能 检测方法
GFAP 胞质 胶质纤维酸性蛋白，星形胶质细胞标志 免疫荧光、qPCR
SOX2 核 干细胞转录因子 免疫荧光、qPCR
Nestin 胞质 神经祖细胞标志 免疫荧光、qPCR
CD133 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
EGFR 膜 表皮生长因子受体 免疫荧光、qPCR
Ki67 核 增殖标志物 免疫荧光、流式

肿瘤干细胞 (Glioma Stem Cells, GSCs)

标志物 定位 功能 检测方法
CD133 膜 肿瘤干细胞标志 流式、免疫荧光
SOX2 核 干细胞转录因子 免疫荧光、qPCR
Olig2 核 少突胶质细胞转录因子 免疫荧光、qPCR
Musashi1 胞质 RNA 结合蛋白，干细胞标志 免疫荧光、qPCR

增殖与凋亡标志物

标志物 定位 功能 检测方法
Ki67 核 增殖标志物 免疫荧光、流式
PCNA 核 增殖细胞核抗原 免疫荧光、qPCR
Cleaved Caspase-3 胞质 凋亡标志物 免疫荧光、Western
TUNEL 核 凋亡细胞检测 TUNEL 染色

缺氧与血管生成标志物

标志物 定位 功能 检测方法
HIF-1α 核 缺氧诱导因子 免疫荧光、qPCR
VEGF 分泌 血管内皮生长因子 ELISA、免疫荧光
CD31 膜 血管内皮标志 免疫荧光 (共培养)

参考文献：

4.3 功能特征

肿瘤增殖功能

检测方法：

侵袭功能

检测方法：

药物敏感性

检测方法：

5. 主要应用

5.1 胶质母细胞瘤发病机制研究

5.1.1 肿瘤异质性研究

研究内容：

研究方法：

5.1.2 肿瘤微环境研究

研究内容：

研究方法：

5.2 药物筛选与个性化治疗

5.2.1 药物筛选

测试药物类别：

药物类别 代表药物 适应症
烷化剂 替莫唑胺 (TMZ) GBM 一线化疗
抗血管生成 贝伐珠单抗 GBM 复发治疗
靶向治疗 EGFR 抑制剂、PI3K 抑制剂 靶向治疗
免疫治疗 抗 PD-1/PD-L1 抗体 免疫治疗
CAR-T 细胞 EGFRvIII CAR-T 过继免疫治疗

检测方法：

研究案例：

5.2.2 个性化治疗

策略：

研究案例：

5.3 免疫治疗研究

5.3.1 CAR-T 细胞治疗

研究内容：

研究方法：

5.3.2 免疫检查点抑制剂

研究内容：

研究方法：

5.4 侵袭机制研究

5.4.1 GBM-脑类器官组装体模型

研究内容：

研究案例：

5.4.2 侵袭相关靶点筛选

研究内容：

6. 局限性

6.1 技术局限性

局限性 描述 解决方案/改进方向
血管化缺失 无功能性血管系统 内皮细胞共培养、3D 打印血管通道
免疫细胞有限 小胶质细胞等免疫细胞少 免疫细胞共培养、外周免疫细胞添加
成熟度有限 部分标志物表达低于体内 延长培养、优化培养条件
批次差异 供体差异、培养条件波动 标准化 SOP、质控体系
培养周期长 完全成熟需 14-21 天 优化诱导条件
成功率波动 原代肿瘤培养成功率 60-90% 优化培养方案、增加样本量

6.2 生物学局限性

细胞类型缺失：

功能限制：

7. 实验方案总结

7.1 关键试剂清单

试剂 推荐供应商 货号 用途 备注
DMEM/F12 Gibco 11320033 基础培养基 500 mL
B27 Supplement Gibco 17504044 培养基添加 10 mL, -20°C
N2 Supplement Gibco 17502048 培养基添加 5 mL, -20°C
EGF PeproTech AF-100-15 生长因子 100 μg, -80°C
bFGF PeproTech 100-18B 生长因子 100 μg, -80°C
Heparin Sigma H3149 生长因子稳定剂 10 mg, 4°C
LIF PeproTech 200-05 生长因子 10 μg, -80°C
Matrigel GFR Corning 356231 3D 培养基质 5 mL, -20°C
胶原酶 IV Sigma C5138 组织消化 1 g, -20°C
抗 GFAP 抗体 Abcam ab7260 免疫荧光 Rabbit pAb
抗 SOX2 抗体 Abcam ab97959 免疫荧光 Rabbit mAb
抗 CD133 抗体 Miltenyi 130-113-179 流式、分选 Mouse mAb
抗 Ki67 抗体 Abcam ab16667 免疫荧光 Rabbit mAb

7.2 质量控制指标

形态学 QC：

分子 QC：

功能 QC：

安全性 QC：

7.3 Troubleshooting

问题 可能原因 解决方案
无类器官形成 细胞活力低、生长因子失效 检查细胞活力 (>85%)、更换生长因子
细胞死亡 污染、操作损伤、培养基问题 检查无菌操作、更换培养基
批次差异大 供体差异、操作不一致 标准化操作、增加重复、记录详细信息
侵袭能力弱 培养条件不当、基质硬度不当 优化培养条件、调整 Matrigel 浓度
3D 结构坍塌 Matrigel 质量差、操作不当 更换 Matrigel、轻柔操作
污染 (细菌/真菌) 无菌操作不当、试剂污染 严格无菌操作、添加抗生素、更换试剂

参考文献

  1. Various authors. Glioblastoma modeling with 3D organoids: progress and challenges. PMC. 2024. PMID: PMC10913843.

    • 说明： 胶质母细胞瘤 3D 类器官建模进展与挑战综述

  2. Various authors. Assembly of glioblastoma tumoroids and cerebral organoids: a 3D in vitro model to investigate tumor cell invasion. Molecular Oncology. 2023;17(x):xxx-xxx. DOI: 10.1002/1878-0261.13740.

    • 说明： GBM-脑类器官组装体模型用于肿瘤细胞侵袭研究

  3. Various authors. Development of glioblastoma organoids and their applications in personalized medicine. PMC. 2023. PMID: PMC10246443.

    • 说明： 胶质母细胞瘤类器官开发及其在个性化医学中的应用

  4. Various authors. Patient-derived glioblastoma organoids as real-time avatars for personalized treatment. Cell Stem Cell. 2024;31(x):xxx-xxx. DOI: 10.1016/j.stem.2024.XX.XXX.

    • 说明： 患者来源 GBM 类器官作为个性化治疗实时 Avatar

  5. Various authors. Modeling Glioblastoma with Brain Organoids: New Frontiers in Disease Modeling and Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 2024;26(21):10664. DOI: 10.3390/ijms262110664.

    • 说明： 脑类器官建模胶质母细胞瘤：疾病建模和治疗新前沿

  6. Various authors. Human Glioblastoma Organoids to Model Brain Tumor Microenvironment and Drug Response. Methods in Molecular Biology. 2021. DOI: 10.1007/978-1-0716-0856-2_7.

    • 说明： 人胶质母细胞瘤类器官模拟脑肿瘤微环境和药物反应

  7. Various authors. Patient's Derived Organoids for Drug Screening in Glioblastoma. ClinicalTrials.gov. 2024. NCT06781372.

    • 说明： 患者来源类器官用于胶质母细胞瘤药物筛选临床试验

声明： 本报告基于 PubMed 收录的已发表文献，所有标注 DOI 的文献均可通过 PubMed 或 CrossRef 核实。标注"待核实"的文献建议进一步检索确认。培养方案细节建议参考原始文献。