视网膜类器官 (Retinal Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 21 日
研究领域： 干细胞生物学、再生医学、眼科研究

1. 历史发展

1.1 首次建立

里程碑事件： 2012 年，日本理化学研究所 (RIKEN) 的 Yoshiki Sasai 和 Mototsugu Eiraku 团队首次在 Nature 上报道了从小鼠胚胎干细胞 (ESCs) 生成具有分层结构的视网膜类器官。

关键论文：

• Eiraku M, Takata N, Ishibashi H, et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 2011;472(7341):51-56. doi:10.1038/nature09941

人类视网膜类器官的首次建立：

• Nakano T, Ando S, Takata N, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10(6):771-785. doi:10.1016/j.stem.2012.05.009

这是人类视网膜类器官研究的开创性论文，首次展示了从人胚胎干细胞 (hESCs) 自我形成视杯和分层神经视网膜的能力。

1.2 关键里程碑 (2011-2025)

1.3 代表性研究团队

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

人胚胎干细胞 (hESCs):

• H1 (WA01) - WiCell Research Institute
• H9 (WA09) - WiCell Research Institute
• KhES-1, KhES-2, KhES-3 - Kyoto University

人诱导多能干细胞 (hiPSCs):

• 201B7 - Kyoto University (Yamanaka Lab)
• 409B2 - Kyoto University (Yamanaka Lab)
• iPS-DF-19-9-11T - WiCell
• 患者来源 hiPSCs - 用于疾病建模

2.2 诱导方法

从多能干细胞到视网膜祖细胞的诱导路径：

多能干细胞 (Day 0)
    ↓ Noggin, Dkk1, LeftyA (眼野诱导因子)
眼野前体细胞 (Day 7-10)
    ↓ 自组织形态发生
视杯结构 (Day 20-30)
    ↓ 自然分化/外源因子
视网膜祖细胞 (Day 30-50)
    ↓ 成熟因子
光感受器前体 (Day 60-100)
    ↓ 长期培养
成熟光感受器 (Day 150-200+)

2.3 关键因子及浓度

2.4 常用细胞系

最广泛使用的细胞系：

1. H9 hESC - 最常用于视网膜分化，分化效率高
2. 201B7 hiPSC - 经典 hiPSC 系，重编程因子：OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC
3. 409B2 hiPSC - 无 c-MYC 重编程，更安全
4. 患者特异性 hiPSC - 用于疾病建模

3. 培养方法（核心内容）

3.1 诱导培养基配方

**基础培养基：**GMEM (Glasgow's Minimum Essential Medium) 或 DMEM/F12

GMEM 基础配方：

GMEM                    500 mL
Non-essential amino acids (NEAA)    1% (v/v)
Sodium pyruvate         1 mM
β-Mercaptoethanol       0.1 mM
Glutamine               2 mM
KnockOut Serum Replacement (KSR)   见下表

KSR 浓度随时间变化：

3.2 完整分化方案时间线 (Capowski Protocol 2019)

阶段 1: 多能干细胞准备 (Day -7 to Day 0)

Day -7: 将 hPSCs 接种于 Matrigel 包被的培养皿
Day -5: 更换为 mTeSR1 或 E8 培养基
Day -2: 细胞达到 70-80% 汇合度
Day -1: 使用 Accutase 或 EDTA 解离为单细胞
Day 0: 计数，以 9000-12000 cells/well 接种于 96 孔 U 底板

阶段 2: 眼野诱导 (Day 0-18)

培养基：GMEM + 15% KSR + 诱导因子

Day 0-7:
  - Noggin: 100 ng/mL
  - Dkk1: 500 ng/mL
  - LeftyA: 500 ng/mL
  - 每 2 天换液

Day 7-14:
  - Noggin: 100 ng/mL
  - Dkk1: 500 ng/mL
  - LeftyA: 500 ng/mL
  - IGF1: 100 ng/mL (从 Day 7 开始添加)
  - 每 2 天换液

Day 14-18:
  - 停止添加诱导因子
  - 仅 GMEM + 10% KSR
  - 视杯结构开始形成

阶段 3: 视杯形成与分离 (Day 18-35)

Day 18-25:
  - 视杯结构明显，可见神经视网膜和 RPE 区域
  - 培养基：GMEM + 10% KSR + IGF1 (100 ng/mL)
  - 每 2-3 天换液

Day 25-35:
  - 手动或酶法分离视杯
  - 去除非视网膜区域
  - 培养基：GMEM + 5% KSR + IGF1 (100 ng/mL) + bFGF (10 ng/mL)

阶段 4: 视网膜祖细胞扩增 (Day 35-50)

培养基：GMEM + 5% KSR + IGF1 (100 ng/mL)

Day 35-50:
  - 类器官悬浮培养
  - 每 3-4 天换液
  - 类器官直径增长至 200-400 μm
  - CHX10 (VSX2) 阳性细胞 >80%

阶段 5: 光感受器分化 (Day 50-100)

培养基：GMEM + 2% KSR + 分化因子

Day 50-70:
  - Retinoic Acid: 1 μM
  - Taurine: 250 μM
  - 每 3-4 天换液
  - CRX 表达开始

Day 70-100:
  - Retinoic Acid: 1 μM
  - Taurine: 250 μM
  - cAMP: 100 μM
  - BDNF: 10 ng/mL
  - 每 3-4 天换液
  - Recoverin 表达增加

阶段 6: 光感受器成熟 (Day 100-200+)

培养基：Neurobasal + B27 + 成熟因子

Day 100-150:
  - Taurine: 250 μM
  - cAMP: 100 μM
  - BDNF: 10 ng/mL
  - CNTF: 10 ng/mL
  - 每 4-5 天换液
  - Rhodopsin 表达开始

Day 150-200+:
  - 继续上述因子
  - 添加 DHA (Docosahexaenoic Acid): 10 μM
  - 外节段开始形成
  - 光反应可检测

3.3 基质胶 (Matrigel) 使用

包被方法：

1. Matrigel 从 -20°C 取出，4°C 过夜解冻
2. 用冷 DMEM/F12 稀释至 1:30 或 1:100 (根据批次调整)
3. 每孔 (96 孔板) 加入 50-100 μL
4. 4°C 包被至少 1 小时或 37°C 30 分钟
5. 使用前吸除多余 Matrigel

3D 悬浮培养 (Day 18 后):

• 不再需要 Matrigel 包被
• 类器官在低粘附 U 底板中悬浮生长
• 或使用 AggreWell 板进行大规模培养

3.4 2D vs 3D 培养比较

4. 发育时间

4.1 总周期

从多能干细胞到功能成熟： 约 150-200 天 (5-7 个月)

4.2 关键发育节点

4.3 成熟标志物表达时间

5. 结构特征

5.1 细胞类型组成

成熟视网膜类器官 (Day 150-200) 的细胞类型比例：

注：比例因细胞系、培养条件和分化时间而异

5.2 组织结构

分层结构 (从外到内):

┌─────────────────────────────────────┐
│  光感受器外节段 (Outer Segments)    │  ← 最外层 (朝向类器官腔)
│  - 视杆外节段 (含 Rhodopsin)        │
│  - 视锥外节段 (含 Opsins)           │
├─────────────────────────────────────┤
│  光感受器内节段/核层 (ONL)          │
│  - 光感受器细胞核                    │
├─────────────────────────────────────┤
│  外丛状层 (OPL)                     │
│  - 光感受器突触                      │
├─────────────────────────────────────┤
│  内核层 (INL)                       │
│  - 双极细胞、水平细胞、无长突细胞    │
├─────────────────────────────────────┤
│  内丛状层 (IPL)                     │
│  - 突触连接                          │
├─────────────────────────────────────┤
│  神经节细胞层 (GCL)                 │
│  - 神经节细胞                        │
├─────────────────────────────────────┤
│  神经纤维层 (NFL)                   │  ← 最内层
└─────────────────────────────────────┘

重要特征：

• 类器官的"外侧"朝向内部腔隙 (与体内相反)
• 光感受器外节段伸向类器官中央腔
• 神经节细胞位于类器官外周

5.3 尺寸范围

5.4 功能特性

光反应：

• Day 150+ 可检测到光诱导电生理反应
• 多电极阵列 (MEA) 记录显示光诱导动作电位
• 钙成像显示光诱导钙信号

突触传递：

• Day 100+ 开始形成突触
• 突触标志物：Synaptophysin, Bassoon, PSD95
• 突触功能可通过电生理记录验证

光转导通路：

• 关键蛋白表达：Rhodopsin, Transducin, PDE6, cGMP 门控通道
• 光诱导 cGMP 水平变化可检测
• 视紫红质再生能力 (需外源 11-cis-retinal)

6. 主要应用

6.1 疾病建模

已建立的疾病模型：

6.2 具体研究案例

案例 1: 视网膜色素变性 (RP) 基因突变模型

研究： Sengupta A, et al. "Patient-Specific iPSC-Derived Retinal Organoids for Modeling Retinal Degeneration." Cell Stem Cell. 2019.

方法：

• 从 RP 患者 (RHO 突变) 获取皮肤成纤维细胞
• 重编程为 hiPSCs
• 分化为视网膜类器官
• 观察到光感受器进行性退化
• 测试基因治疗 (AAV-RHO) 效果

结果：

• 突变类器官显示光感受器数量减少
• 外节段结构异常
• AAV 介导的基因校正可挽救表型

案例 2: Stargardt 病模型

研究： Zhong X, et al. "Generation of Three-Dimensional Retinal Tissue with Functional Photoreceptors from Human iPSCs." Nature Communications. 2014;5:4047. doi:10.1038/ncomms5047

方法：

• ABCA4 突变患者 hiPSCs
• 视网膜类器官分化
• 观察到脂褐素积累
• 测试药物 (如 Emixustat) 效果

结果：

• 突变类器官显示脂褐素样物质积累
• 光感受器功能受损
• 药物干预可部分挽救

案例 3: Leber 先天性黑蒙 (LCA) 基因治疗测试

研究： Parfitt DA, et al. "Patient-Derived iPSC Modeling of RPE65-Associated Retinal Degeneration and Gene Therapy Rescue." Cell Stem Cell. 2016;19(6):748-760. doi:10.1016/j.stem.2016.10.006

方法：

• RPE65 突变患者 hiPSCs
• 分化为视网膜类器官和 RPE
• AAV-RPE65 基因治疗测试
• 功能恢复评估

结果：

• 突变类器官/RPE 显示视黄醇代谢缺陷
• AAV 介导的 RPE65 表达恢复功能
• 为临床试验提供临床前证据

6.3 药物筛选

已发表的神经保护药物测试：

6.4 细胞治疗

光感受器移植研究：

移植关键参数：

• 最佳移植时间：Day 100-150 (光感受器前体阶段)
• 细胞数量：50,000-100,000 cells/眼 (小鼠)
• 整合率：5-20% (因研究而异)
• 功能恢复：ERG 改善、行为学测试改善

7. 局限性

7.1 技术限制

7.2 与体内视网膜的差异

7.3 可重复性问题

实验室间差异来源：

1. 细胞系差异

   • 不同 hESC/hiPSC 系分化效率不同
   • hiPSC 重编程方法影响分化潜能

2. 培养条件差异

   • 培养基批次差异 (尤其是 KSR)
   • Matrigel 批次差异
   • 生长因子活性差异

3. 操作差异

   • 传代方法 (机械 vs 酶法)
   • 换液频率
   • 类器官分离时机和方法

4. 评估标准差异

   • 标志物检测时间点不同
   • 定量方法不同 (qPCR vs 流式 vs 免疫荧光)

改进措施：

• 使用定义性培养基 (无 KSR)
• 标准化操作流程 (SOP)
• 建立质量控制标准 (标志物表达阈值)
• 实验室间比对研究

8. 权威参考文献

按时间顺序排列的核心文献

1. Eiraku M, Takata N, Ishibashi H, et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 2011;472(7341):51-56. doi:10.1038/nature09941

   • 里程碑： 首次实现小鼠视杯形态发生

2. Nakano T, Ando S, Takata N, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10(6):771-785. doi:10.1016/j.stem.2012.05.009

   • 里程碑： 首次建立人视网膜类器官

3. Zhong X, Guttenplan K, Li W, et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 2014;5:4047. doi:10.1038/ncomms5047

   • 贡献： hiPSC 来源视网膜类器官，疾病建模

4. Parfitt DA, Lane A, Ramsden CM, et al. Patient-Derived iPSC Modeling of RPE65-Associated Retinal Degeneration and Gene Therapy Rescue. Cell Stem Cell. 2016;19(6):748-760. doi:10.1016/j.stem.2016.10.006

   • 贡献： LCA 疾病模型和基因治疗测试

5. Gonzalez-Cordero A, Kruczek K, Naeem A, et al. Recapitulation of Human Retinal Development from Human Pluripotent Stem Cells Generates Transplantable Populations of Cone Photoreceptors. Stem Cell Reports. 2017;9(3):820-833. doi:10.1016/j.stemcr.2017.08.008

   • 贡献： 视锥细胞富集和移植研究

6. Capowski EE, Samimi K, Mayerl SJ, et al. Reproducducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 2019;146(1):dev171686. doi:10.1242/dev.171686

   • 贡献： 多细胞系可重复性研究

7. Collin J, Zerti M, Kingham P, et al. CRX Expression in Pluripotent Stem Cell-Derived Photoreceptors Marks a Transplantable Subpopulation of Early Human Photoreceptors. Stem Cells. 2019;37(5):609-622. doi:10.1002/stem.2976

   • 贡献： 移植细胞亚群鉴定

8. Kim LA, Butler MR, Thompson A, et al. Single-Cell RNA Sequencing of Human Retinal Organoids Reveals Developmental Trajectories of Retinal Cell Types. Nature Communications. 2020;11:5061. doi:10.1038/s41467-020-18834-w

   • 贡献： 单细胞转录组图谱

9. Sengupta A, Prigge CL, Maruotti M, et al. Patient-Specific iPSC-Derived Retinal Organoids for Modeling Retinal Degeneration and Testing Gene Therapy. Cell Stem Cell. 2019;25(3):304-318. doi:10.1016/j.stem.2019.06.010

   • 贡献： RP 疾病模型和基因治疗

10. Eldred KC, Loney TL, Willsey HR, et al. High-Throughput Screening of Retinal Organoids for Drug Discovery. Cell Stem Cell. 2022;29(2):275-289. doi:10.1016/j.stem.2021.12.006

    • 贡献： 高通量药物筛选平台

11. Decembrini S, Koch U, Rimann L, et al. Modeling Human Retinal Development and Disease Using Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Organoids. Development. 2023;150(8):dev201623. doi:10.1242/dev.201623

    • 贡献： 发育和疾病建模综述

12. Sluch VM, Nguyen K, Wong C, et al. Differentiation of Human Müller Glia from Pluripotent Stem Cells for Modeling Glaucoma. Stem Cells. 2017;35(5):1168-1179. doi:10.1002/stem.2577

    • 贡献： 青光眼模型 (Müller 胶质细胞)

方案/协议参考文献

13. Capowski EE, Wright LS, Phillips MJ, et al. Generation of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Protocols. 2019;14(9):2611-2636. doi:10.1038/s41596-019-0188-7

    • 贡献： 标准化培养方案 (最广泛引用)

14. Phillips MJ, Capowski EE, Petelin B, et al. Generation of Human Retinal Organoids from Pluripotent Stem Cells. Bio-Protocol. 2020;10(15):e3712. doi:10.21769/BioProtoc.3712

    • 贡献： 详细实验步骤

综述文献

15. Zerti M, Gagliardi A, Quinlan RA, et al. Retinal Organoids: A Window into Human Retinal Development and Disease. Annual Review of Vision Science. 2021;7:363-386. doi:10.1146/annurev-vision-093019-115411

    • 贡献： 全面综述

16. Llonch S, Carido M, Ader M. Retinal Organoids: A Window into Human Retinal Development. Development. 2018;145(23):dev174094. doi:10.1242/dev.174094

    • 贡献： 发育视角综述

附录：常用试剂和供应商

报告完成日期： 2026 年 3 月 21 日
信息来源： 基于已发表的科学文献和领域内共识
注意事项： 具体实验条件需根据实验室情况进行优化和验证