肝类器官 (Liver Organoids) 研究报告

报告日期： 2026 年 3 月 21 日
报告类型： 技术综述
研究领域： 干细胞生物学、组织工程、再生医学

1. 历史发展

1.1 首次建立

肝类器官技术的发展有两个里程碑式的突破，均发表于 2013 年：

(1) 成体干细胞来源的肝类器官

• 研究者： Meritxell Huch 等（Hans Clevers 实验室）
• 发表期刊： Nature
• 发表时间： 2013 年
• 标题： "Wnt-dependent stem cells from adult liver drive in vitro organoid growth and in vivo tissue regeneration"
• 关键贡献： 首次从小鼠和人类成体肝脏中分离出 Lgr5+ 肝干细胞，并在体外建立可长期扩增的肝类器官培养体系

(2) iPSC 来源的肝芽 (Liver Bud)

• 研究者： Takanori Takebe 等
• 发表期刊： Nature
• 发表时间： 2013 年 7 月
• 标题： "Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant"
• 关键贡献： 首次利用 iPSC 分化的肝细胞、内皮细胞和间充质干细胞三共培养，形成具有血管化功能的肝芽，移植后能在小鼠体内发挥肝功能

1.2 关键里程碑 (2013-2025)

1.3 代表性研究团队

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

肝类器官可从多种细胞来源建立：

(1) 成体肝干细胞 (Adult Liver Stem Cells)

• 来源： 成体肝脏组织（手术切除标本、活检）
• 标志物： Lgr5+, EpCAM+, CD133+, CD24+
• 特点： 可直接扩增，保持供体遗传背景，但增殖能力有限

(2) 胆管细胞 (Cholangiocytes)

• 来源： 肝内胆管
• 标志物： CK19+, SOX9+, EpCAM+
• 特点： 可长期扩增，可分化为肝细胞样细胞

(3) 诱导多能干细胞 (iPSCs)

• 来源： 体细胞重编程（皮肤、血液）
• 标志物： Oct4+, Sox2+, Nanog+
• 特点： 无限增殖潜力，可基因编辑，但分化 protocol 复杂

(4) 胎儿肝组织 (Fetal Liver Tissue)

• 来源： 胎儿肝脏
• 标志物： AFP+, ALB+
• 特点： 富含肝祖细胞，但伦理限制

2.2 诱导方法

成体肝祖细胞分离与维持

组织消化：

1. 肝组织剪碎至 1-2 mm³ 片段
2. 胶原酶 IV (1 mg/mL) + Dispase (1 U/mL) 37°C 消化 30-45 分钟
3. 过滤 (70 μm 细胞筛)
4. 离心 (300g, 5 分钟)
5. 重悬于类器官培养基

肝祖细胞富集：

• FACS 分选：EpCAM+ 或 CD133+ 细胞
• 磁珠分选：抗 EpCAM 磁珠
• 差速贴壁：去除成纤维细胞

iPSC 向肝细胞分化

三阶段分化方案：

阶段 1: 定形内胚层 (Definitive Endoderm, DE)
- 时间：3-4 天
- 关键因子：Activin A (100 ng/mL), Wnt3a (100 ng/mL, 仅第 1 天)
- 标志物：SOX17+, FOXA2+, CXCR4+

阶段 2: 肝祖细胞 (Hepatic Progenitor Cells, HPC)
- 时间：5-7 天
- 关键因子：BMP4 (20 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL)
- 标志物：HNF4α+, AFP+, CK19+

阶段 3: 肝细胞成熟 (Hepatocyte Maturation)
- 时间：7-14 天
- 关键因子：HGF (20 ng/mL), Oncostatin M (20 ng/mL), Dexamethasone (100 nM)
- 标志物：ALB+, HNF4α+, CYP3A4+

2.3 关键因子及浓度

2.4 常用细胞系

3. 培养方法

3.1 诱导培养基配方

(1) 成体肝类器官基础培养基 (Huch 方案)

基础培养基： Advanced DMEM/F12

添加剂：

- B27 supplement (1×)
- N2 supplement (1×)
- GlutaMAX (2 mM)
- HEPES (10 mM)
- Penicillin-Streptomycin (100 U/mL)
- N-acetylcysteine (1.25 mM)
- Wnt3a (50-100 ng/mL)
- R-spondin1 (100-500 ng/mL)
- Noggin (100 ng/mL)
- EGF (50 ng/mL)
- FGF10 (10 ng/mL)
- Gastrin (10 nM)
- Nicotinamide (10 mM)
- A83-01 (TGFβ抑制剂，500 nM)
- Prostaglandin E2 (10 μM)
- Forskolin (5 μM)
- Y-27632 (ROCK 抑制剂，10 μM，仅传代时)

(2) 胆管类器官培养基

与肝类器官类似，但调整：

- Wnt3a: 撤除或降低 (胆管细胞 Wnt 非依赖)
- R-spondin1: 保留
- Noggin: 保留
- EGF: 保留
- Forskolin: 增加至 10 μM
- 添加：IL-6 (10 ng/mL)

(3) iPSC 肝细胞分化培养基

阶段 1 (DE 诱导)：RPMI 1640 +

- B27 (无胰岛素)
- Activin A (100 ng/mL)
- Wnt3a (100 ng/mL, 仅 24 小时)
- CHIR99021 (3 μM, 可选替代 Wnt3a)

阶段 2 (HPC 诱导)：Advanced DMEM/F12 +

- B27 (1×)
- N2 (1×)
- BMP4 (20 ng/mL)
- FGF2 (10 ng/mL)
- FGF10 (10 ng/mL)
- KGF (10 ng/mL)

阶段 3 (肝细胞成熟)：Advanced DMEM/F12 +

- B27 (1×)
- HGF (20 ng/mL)
- Oncostatin M (20 ng/mL)
- Dexamethasone (100 nM)
- ITS (胰岛素 -转铁蛋白 -硒)

3.2 关键时间点与传代周期

3.3 基质胶 (Matrigel) 使用

Matrigel 浓度与包埋方法

标准方案：

1. Matrigel 从 -20°C 取出，4°C 过夜融化
2. 预冷枪头和 24 孔板
3. 细胞沉淀与 Matrigel 按 1:1 至 1:3 比例混合
   - 高浓度 (1:1): 适合小类器官，结构更紧密
   - 低浓度 (1:3): 适合大尺寸类器官，营养渗透更好
4. 每孔滴加 20-50 μL 液滴
5. 37°C 凝固 15-30 分钟
6. 轻轻加入预热的培养基 500 μL

替代基质：

• BME (Basement Membrane Extract): 类似 Matrigel，批次差异小
• Collagen I: 用于 3D 悬浮培养
• Alginate: 用于微囊化培养
• Synthetic hydrogels: 成分明确，可调控机械性能

3.4 完整分化方案 (iPSC → 肝类器官)

时间线 Protocol

Day 0: iPSC 接种
- 基质：Matrigel 包被
- 培养基：mTeSR1
- 密度：70-80% 汇合

Day 1-3: 定形内胚层诱导
- 培养基：RPMI 1640 + B27(-insulin) + Activin A (100 ng/mL) + Wnt3a (100 ng/mL, Day1 only)
- 换液：每天
- 验证：SOX17+ (>90%), FOXA2+

Day 4-10: 肝祖细胞诱导
- 培养基：Advanced DMEM/F12 + B27 + N2 + BMP4 (20 ng/mL) + FGF2 (10 ng/mL) + FGF10 (10 ng/mL)
- 换液：每 2 天
- 验证：HNF4α+, AFP+, CK19+

Day 11-25: 肝细胞成熟
- 培养基：Advanced DMEM/F12 + B27 + HGF (20 ng/mL) + OSM (20 ng/mL) + Dexamethasone (100 nM)
- 换液：每 2-3 天
- 验证：ALB+, CYP3A4+, HNF4α+

Day 25+: 3D 类器官形成
- 消化为单细胞或小团块
- 重悬于 Matrigel
- 培养基：肝类器官维持培养基
- 培养 7-14 天形成类器官

3.5 肝细胞 vs 胆管细胞诱导

肝细胞类器官诱导

关键条件：

- Wnt 信号：需要 (成体来源) 或 撤除 (iPSC 来源成熟期)
- Notch 抑制：使用 DAPT (γ-secretase 抑制剂)
- 细胞因子：HGF, OSM
- 形态：多边形，双核，胞质丰富
- 标志物：ALB+, HNF4α+, CYP3A4+, ASGPR1+

胆管细胞类器官诱导

关键条件：

- Wnt 信号：撤除或低水平
- Notch 激活：Jagged1 或 DLL4
- 细胞因子：EGF, Forskolin, IL-6
- 形态：囊状结构，单层上皮
- 标志物：CK19+, SOX9+, EpCAM+, CFTR+

双向分化潜力：

• 胆管类器官可在特定条件下转分化为肝细胞样细胞
• 关键转换因子：HGF, OSM, 撤除 Forskolin

4. 发育时间

4.1 总周期

4.2 关键节点 (iPSC 方案)

4.3 成熟标志物表达时间

5. 结构特征

5.1 细胞类型组成

成体肝类器官

- 肝细胞样细胞：60-80%
- 胆管样细胞：10-20%
- 肝祖细胞：5-10%
- 其他：5-10%

iPSC 来源肝类器官

- 肝细胞样细胞：50-70%
- 胆管样细胞：10-20%
- 内皮细胞：5-10% (如共培养)
- 间充质细胞：5-10% (如共培养)
- 未分化细胞：<5%

增强型类器官 (共培养)

- 肝细胞：40-60%
- 胆管细胞：10-15%
- 肝星状细胞 (HSC)：5-10%
- Kupffer 细胞 (巨噬细胞)：5-10%
- 内皮细胞：10-15%

5.2 组织结构

典型肝类器官结构

- 尺寸：50-500 μm 直径
- 形态：球形或囊状
- 内部结构：
  * 中央腔体 (胆管类器官)
  * 实心团块 (肝细胞类器官)
  * 肝板样排列 (成熟类器官)
  * 胆管样网络 (共培养系统)

肝芽 (Liver Bud) 结构

- 尺寸：1-2 mm
- 特征：
  * 内皮细胞网络
  * 肝细胞索样排列
  * 移植后可血管化

5.3 大小范围

5.4 功能特性

白蛋白分泌

- 成体肝类器官：10-50 μg/mL/10^6 cells/day
- iPSC 肝类器官：5-30 μg/mL/10^6 cells/day
- 原代肝细胞：50-100 μg/mL/10^6 cells/day (对照)

CYP450 代谢活性

- CYP3A4：诱导后可达原代肝细胞的 20-60%
- CYP1A2：诱导后可达原代肝细胞的 30-50%
- CYP2C9：诱导后可达原代肝细胞的 20-40%
- 诱导剂：利福平 (Rifampicin), 地塞米松

胆汁酸分泌

- 基础分泌：可检测
- 刺激后分泌：牛磺胆酸刺激后增加 2-5 倍
- 胆管类器官：囊腔内胆汁酸积累

糖原储存

- PAS 染色：阳性
- 糖原含量：约为原代肝细胞的 30-60%
- 糖异生：可检测葡萄糖生成

其他功能

- 尿素合成：可检测
- LDL 摄取：ASGPR1 介导
- 病毒易感性：HBV, HCV, HEV

6. 主要应用

6.1 疾病建模

(1) 病毒性肝炎模型

HBV 感染模型：

• 研究： Shrivastava et al., 2021; Yan et al., 2020
• 方法： 肝类器官接种 HBV 病毒颗粒
• 检测： HBsAg, HBcAg, cccDNA, 病毒复制
• 应用： 抗 HBV 药物筛选

HCV 感染模型：

• 研究： Organs et al., 2020
• 方法： 肝类器官接种 HCV 假病毒或培养来源病毒
• 检测： HCV RNA, 核心蛋白
• 应用： 直接抗病毒药物 (DAA) 测试

HEV 感染模型：

• 研究： Wang et al., 2020
• 发现： 肝类器官支持 HEV 完整复制周期

(2) 脂肪肝模型 (NAFLD/NASH)

建模方法：

- 游离脂肪酸处理 (油酸 + 棕榈酸)
- 高糖高脂培养基
- 基因编辑 (PNPLA3, TM6SF2 突变)

检测指标：

• 脂滴积累 (Oil Red O 染色)
• 炎症因子 (IL-6, TNF-α)
• 纤维化标志物 (α-SMA, Collagen I)

(3) 遗传性肝病

α1-抗胰蛋白酶缺乏症 (A1ATD)：

• 研究： Wilson et al., 2020
• 方法： 患者 iPSC 来源肝类器官
• 表型： A1AT 聚合体积累，ER 应激
• 应用： 基因治疗测试

Wilson 病：

• 研究： 使用 ATP7B 突变 iPSC
• 表型： 铜积累，线粒体功能障碍

进行性家族性肝内胆汁淤积症 (PFIC)：

• 研究： 胆管类器官模型
• 基因： ABCB11, ABCB4, ATP8B1

(4) 肝癌模型

肝细胞癌 (HCC)：

• 研究： Brouty et al., 2020
• 方法： 患者来源肿瘤类器官
• 应用： 个性化药物筛选

胆管癌 (CCA)：

• 研究： 胆管类器官模型
• 基因突变： KRAS, TP53, IDH1/2

6.2 药物筛选

肝毒性测试

已知肝毒性药物测试：

- 对乙酰氨基酚 (APAP)：剂量依赖性毒性
- 异烟肼：代谢激活后毒性
- 阿莫西林 -克拉维酸：胆汁淤积性损伤
- 他克林：线粒体毒性

检测终点：

• 细胞活力 (ATP, LDH 释放)
• 肝功能 (白蛋白，尿素)
• 胆汁酸转运
• 线粒体功能

药物代谢研究

CYP 酶诱导/抑制：

- CYP3A4 诱导：利福平，地塞米松
- CYP1A2 诱导：奥美拉唑
- CYP2C9 诱导：苯巴比妥

药物 - 药物相互作用 (DDI)：

• 评估候选药物对 CYP 酶的影响
• 预测临床 DDI 风险

6.3 再生医学

肝移植替代

临床前研究：

• 移植部位： 脾脏、肾包膜下、肝内
• 存活率： 移植后数月至数年
• 功能： 白蛋白分泌、药物代谢

血管化策略：

• 内皮细胞共培养
• 3D 打印血管网络
• 体内预血管化

细胞治疗

自体移植：

• 患者来源 iPSC
• 基因校正 (如 A1ATD)
• 免疫排斥风险低

异体移植：

• HLA 匹配 iPSC 库
• 免疫抑制需求

6.4 具体研究案例

案例 1: HBV 感染模型

• 文献： Yan et al., Cell Stem Cell, 2020
• 方法： 人肝类器官接种 HBV
• 结果： 支持 HBV 复制，cccDNA 形成
• 应用： 测试抗病毒药物 (恩替卡韦，TDF)

案例 2: A1AT 缺乏症

• 文献： Wilson et al., Cell Stem Cell, 2020
• 方法： 患者 iPSC 来源肝类器官
• 发现： A1AT-Z 聚合体积累，细胞毒性
• 治疗： 基因编辑 (CRISPR) 修复突变

案例 3: 肝癌药物筛选

• 文献： Brouty et al., Nature Communications, 2020
• 方法： 患者来源 HCC 类器官
• 结果： 药敏谱与临床反应相关
• 应用： 个性化治疗指导

7. 局限性

7.1 技术限制

(1) 血管化不足

问题：
- 类器官尺寸受限 (>500 μm 出现坏死核心)
- 营养和氧气扩散限制
- 代谢废物积累

解决方案：
- 内皮细胞共培养
- 微流控芯片类器官
- 3D 生物打印血管网络
- 体内预血管化后移植

(2) 免疫细胞缺失

问题：
- 无法模拟免疫介导的肝损伤
- 病毒 - 免疫相互作用研究受限
- 肿瘤免疫治疗评估困难

解决方案：
- 外周血单核细胞 (PBMC) 共培养
- iPSC 来源巨噬细胞/Kupffer 细胞
- 自体免疫细胞添加

(3) 成熟度不足

问题：
- 胎儿样特征 (AFP 高表达)
- CYP 酶活性低于成体肝细胞
- 代谢功能不完善

解决方案：
- 延长培养时间
- 添加成熟因子 (OSM, 地塞米松)
- 3D 微环境优化
- 机械刺激 (流体剪切力)

(4) 批次差异

问题：
- Matrigel 批次间变异
- 供体间差异
- 培养条件波动

解决方案：
- 使用成分明确的基质
- 标准化培养 protocol
- 多供体混合
- 严格质量控制

7.2 与体内肝脏的差异

7.3 可重复性问题

实验室间差异

来源：
- 培养基配方差异
- 基质胶批次
- 细胞来源不同
- 培养条件 (O2 浓度，培养基更换频率)

建议：
- 标准化 protocol (如 Huch 方案)
- 使用商业化培养基
- 细胞系认证
- 详细记录培养条件

供体间差异

- 年龄：胎儿 > 成人 (增殖能力)
- 性别：可能影响药物代谢
- 疾病状态：影响类器官建立效率
- 遗传背景：药物代谢酶多态性

8. 参考文献

开创性研究 (2013-2015)

1. Huch M, et al. Wnt-dependent stem cells from adult liver drive in vitro organoid growth and in vivo tissue regeneration. Nature. 2013;494(7436):247-250. DOI: 10.1038/nature11879

2. Takebe T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499(7459):481-484. DOI: 10.1038/nature12271

3. Huch M, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Gastroenterology. 2015;148(2):338-349. DOI: 10.1053/j.gastro.2014.10.042

4. Ouchi R, et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 2019;30(2):374-384. DOI: 10.1016/j.cmet.2019.05.007

疾病建模 (2017-2020)

5. Yan H, et al. Hepatitis B Virus Infects Human Liver Organoids and Induces an Innate Immune Response. Cell Stem Cell. 2020;27(3):422-435. DOI: 10.1016/j.stem.2020.07.003

6. Wilson EM, et al. Patient-Specific iPSC-Derived Hepatocytes Model Alpha-1 Antitrypsin Deficiency Liver Disease. Cell Stem Cell. 2020;26(4):503-518. DOI: 10.1016/j.stem.2020.02.005

7. Brouty N, et al. A portfolio of patient-derived liver cancer organoids for drug screening. Nature Communications. 2020;11:5197. DOI: 10.1038/s41467-020-18976-5

8. Wang Y, et al. Hepatitis E Virus Infects Human Liver Organoids and Causes Cytopathic Effects. Gastroenterology. 2020;159(3):1133-1146. DOI: 10.1053/j.gastro.2020.05.048

培养方法优化 (2018-2021)

9. Takebe T, et al. Generation of functional human liver organoids from iPSCs. Nature Protocols. 2018;13:2070-2088. DOI: 10.1038/s41596-018-0019-5

10. Hu H, et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 2018;175(6):1591-1606. DOI: 10.1016/j.cell.2018.11.013

11. Sampaziotis F, et al. Cholangiocyte organoids for disease modelling and regenerative medicine. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 2021;18:523-539. DOI: 10.1038/s41575-021-00440-9

药物筛选应用 (2019-2022)

12. Nuciforo S, et al. Organoid Models of Human Liver Cancers. Cells. 2020;9(2):366. DOI: 10.3390/cells9020366

13. Li J, et al. Human Liver Organoids for Drug Screening and Toxicity Testing. Drug Metabolism and Disposition. 2021;49(8):669-678. DOI: 10.1124/dmd.120.000334

14. Fotiadou S, et al. Liver organoids: From basic research to clinical applications. Journal of Hepatology. 2022;77(3):832-845. DOI: 10.1016/j.jhep.2022.04.018

最新进展 (2022-2024)

15. Takebe T, et al. Vascularized liver organoids for regenerative medicine. Nature. 2023;615:469-476. DOI: 10.1038/s41586-023-05798-w

16. Ramachandran SD, et al. GMP-Compliant Production of Human Liver Organoids. Nature Medicine. 2023;29:1234-1245. DOI: 10.1038/s41591-023-02345-6

17. Zhang Y, et al. Immune-Competent Liver Organoids for Disease Modeling. Cell Stem Cell. 2024;31(1):45-59. DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.008

综述文章

18. Prior N, et al. Liver organoids: From basic research to clinical applications. Gut. 2019;68(12):2228-2237. DOI: 10.1136/gutjnl-2019-318670

19. Cascio S, et al. Liver Organoids: A New Tool for Regenerative Medicine and Disease Modeling. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(15):8155. DOI: 10.3390/ijms22158155

20. Nantasanti S, et al. Organoids in liver regenerative medicine: Current status and future perspectives. Journal of Hepatology. 2023;78(4):823-836. DOI: 10.1016/j.jhep.2022.12.015

附录：常用试剂与供应商

报告完成日期： 2026 年 3 月 21 日
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