结直肠类器官 (Colorectal Organoids) 研究报告

报告日期: 2026 年 3 月 21 日
研究主题: 结直肠类器官的历史发展、培养方法、结构特征及应用

1. 历史发展

1.1 首次建立

结直肠类器官技术的开创性工作由 Hans Clevers 教授及其团队完成：

关键发现：

• 2009 年 Sato 等人在 Nature 发表的论文首次证明，单个 Lgr5+ 肠道干细胞在含有 Wnt3a、R-spondin1、Noggin 和 EGF 的培养基中，可在 Matrigel 基质胶中形成三维类器官结构
• 这些类器官能够长期传代（>6 个月），并保持干细胞特性和分化潜能
• 2011 年，同一团队将这一技术扩展到人结肠组织和结肠肿瘤组织

1.2 关键里程碑 (2009-2025)

1.3 代表性研究团队

2. 细胞来源

2.1 细胞类型

结直肠类器官可从以下来源建立：

(1) 成体结直肠干细胞 (Lgr5+ ASCs)

• 来源: 正常结直肠黏膜活检、手术切除标本
• 标志物: Lgr5+, Olfm4+, Ascl2+, Sox9+
• 特点: 自我更新能力强，分化潜能完整，最常用来源

(2) 诱导多能干细胞 (iPSCs)

• 来源: 体细胞重编程（皮肤成纤维细胞、外周血单核细胞）
• 特点: 可无限扩增，基因编辑方便，可模拟发育过程
• 应用: 发育研究、遗传性疾病建模

(3) 结直肠肿瘤组织

• 来源: CRC 手术标本、内镜活检、转移灶
• 特点: 保留肿瘤异质性、驱动突变、药物反应特征
• 标志物: 根据分子亚型不同而异（如 KRAS, BRAF, TP53 等）

(4) 正常结直肠组织

• 来源: 癌旁组织、健康志愿者活检
• 特点: 保留正常上皮结构和功能，作为对照使用

2.2 诱导方法

成体干细胞分离流程：

1. 组织获取: 内镜活检钳取或手术切除标本（约 2-5mm³）
2. 清洗: 用冷 PBS 或 Advanced DMEM/F12 清洗 3 次，去除血液和黏液
3. 螯合处理:
   • 2mM EDTA/PBS，4°C 孵育 30 分钟
   • 目的：破坏紧密连接，释放隐窝
4. 机械分离:
   • 剧烈吹打或涡旋振荡 30 秒
   • 过滤：70μm 细胞筛收集隐窝
5. 基质胶包埋:
   • 隐窝沉淀与 Matrigel 按 1:1 混合
   • 每孔 25-50μL 液滴，37°C 聚合 10 分钟
6. 培养基添加:
   • 沿孔壁缓慢加入预热的完全培养基
   • 每孔 500μL

iPSC 诱导结肠类器官流程：

1. iPSC 培养: 使用 mTeSR1 或 E8 培养基维持未分化状态
2. 定形内胚层诱导 (Day 0-3):
   • RPMI 1640 + B27 (minus insulin)
   • Activin A (100 ng/mL)
   • CHIR99021 (3μM, Day 0-1 only)
   • 检测标志物：SOX17+, FOXA2+
3. 后肠特化 (Day 3-7):
   • Advanced DMEM/F12 + B27
   • FGF4 (500 ng/mL)
   • CHIR99021 (3μM)
   • 检测标志物：CDX2+
4. 结肠模式化 (Day 7-14):
   • 继续 FGF4 + CHIR99021
   • 添加 Wnt3a (100 ng/mL)
   • 检测标志物：CDX2+, SATB2+
5. 类器官形成 (Day 14-28):
   • 转入类器官完全培养基
   • Matrigel 3D 培养
   • 形成隐窝样结构

2.3 关键因子

基础培养基配方 (Advanced DMEM/F12):

核心生长因子 (WENR 培养基):

辅助因子 (根据应用添加):

2.4 常用细胞系

3. 培养方法

3.1 诱导培养基配方

(1) 正常结直肠类器官完全培养基 (每 500mL)

注意:

• 基础培养基可 4°C 保存 2 周
• 添加 N-acetylcysteine 后需 1 周内用完
• 生长因子每 3-4 天需补充

(2) 肿瘤类器官培养基 (差异部分)

肿瘤类器官培养基在正常培养基基础上调整：

(3) iPSC 诱导培养基

定形内胚层诱导培养基 (Day 0-3):

RPMI 1640
B27 Supplement (minus insulin) 1×
Activin A 100 ng/mL
CHIR99021 3μM (仅 Day 0-1)
Pen-Strep 1×

后肠特化培养基 (Day 3-7):

Advanced DMEM/F12
B27 Supplement 1×
FGF4 500 ng/mL
CHIR99021 3μM
Pen-Strep 1×

结肠类器官培养基 (Day 14+):
同正常结直肠类器官完全培养基

3.2 关键时间点

3.3 基质胶 (Matrigel) 使用

Matrigel 浓度:

• 标准浓度: 100% Matrigel (约 8-11 mg/mL 蛋白)
• 稀释比例: 类器官沉淀:Matrigel = 1:1 至 1:3
• 推荐: 初始培养用高浓度 (1:1)，扩增后可降低 (1:2)

液滴包埋方法:

标准液滴法:

1. 预冷 24 孔板，置于冰上
2. 细胞沉淀重悬于预冷 Matrigel 中（每孔 25-50μL）
3. 用预冷枪头吸取 Matrigel 悬液
4. 在孔中央形成圆顶状液滴（避免接触孔壁）
5. 37°C 孵育 10-15 分钟使 Matrigel 聚合
6. 沿孔壁缓慢加入 500μL 预热培养基

注意事项:

• 所有操作在冰上进行，防止 Matrigel 提前凝固
• 枪头预冷，避免气泡
• 液滴不宜过大（<50μL），否则影响营养交换
• 聚合时间不足会导致液滴分散

替代基质:

3.4 分化方案

方案 A: 成体干细胞到类器官扩增

Day 0: 组织获取
  ↓
Day 0-1: 隐窝分离 (EDTA 消化 + 机械分离)
  ↓
Day 1: Matrigel 包埋 + 完全培养基
  ↓
Day 3-4: 首次换液 (半量更换)
  ↓
Day 5-7: 类器官形成 (小型囊状结构)
  ↓
Day 7-10: 出芽形成，隐窝样结构出现
  ↓
Day 10-14: 成熟类器官，可传代
  ↓
Passage: EDTA 消化成小团块，重新包埋

方案 B: iPSC 到结直肠类器官

Day 0: iPSC 接种 (80-90% 汇合度)
  ↓
Day 0-3: 定形内胚层诱导 (Activin A + CHIR)
  标志物：SOX17+, FOXA2+ (>90%)
  ↓
Day 3-7: 后肠特化 (FGF4 + CHIR)
  标志物：CDX2+ (>80%)
  ↓
Day 7-14: 结肠模式化 (Wnt3a + FGF4)
  标志物：CDX2+, SATB2+
  ↓
Day 14-21: 3D 类器官形成
  转入 Matrigel + 完全培养基
  ↓
Day 21-28: 成熟结肠类器官
  隐窝样结构，杯状细胞分化
  ↓
Day 28+: 扩增和传代

3.5 正常 vs 肿瘤类器官培养差异

4. 发育时间

4.1 总周期

4.2 关键节点

成体干细胞来源:

iPSC 来源:

4.3 成熟标志物表达时间

注意: 潘氏细胞主要存在于小肠，正常结肠中较少见。结肠类器官中 Lysozyme 阳性细胞比例<5%。

5. 结构特征

5.1 细胞类型及比例

正常结直肠类器官:

肿瘤类器官:

细胞组成取决于肿瘤分级和分子亚型，通常干细胞比例增高 (20-40%)，分化细胞比例降低。

5.2 组织结构

典型结构特征:

1. 隐窝样结构 (Crypt-like domains)

   • 位于类器官外周出芽处
   • Lgr5+ 干细胞富集
   • 高增殖活性 (Ki67+)
   • 类似体内隐窝底部

2. 腔体 (Lumen)

   • 类器官中央空腔
   • 顶端朝向腔体
   • 可积累分泌物（黏液、脱落细胞）

3. 出芽 (Budding)

   • 新生隐窝形成部位
   • 干细胞向外增殖推动
   • 出芽频率反映干细胞活性

4. 顶端 - 基底极性

   • 基底侧朝向 Matrigel
   • 顶端侧朝向腔体
   • 紧密连接完整 (ZO-1+, Occludin+)

5.3 大小

传代建议: 类器官直径达 300-400μm 时传代，避免中央坏死。

5.4 功能特性

(1) 屏障功能

• 跨上皮电阻 (TEER): 150-300 Ω·cm² (成熟类器官)
• 紧密连接蛋白: ZO-1, Occludin, Claudins 表达完整
• 渗透性: 4kDa 葡聚糖渗透率低，证明屏障完整
• 应用: 药物渗透性测试、炎症模型

(2) 分泌功能

• 黏液分泌: Muc2+ 杯状细胞分泌黏液，可 Alcian Blue 染色检测
• 激素分泌:
  • 5-羟色胺 (5-HT)
  • 肽 YY (PYY)
  • 胰高血糖素样肽 -1 (GLP-1)
• 抗菌肽: 结肠中较少，小肠类器官中丰富

(3) 吸收功能

• 短链脂肪酸: 丁酸盐吸收和代谢
• 电解质: Na+/Cl- 吸收，CFTR 介导的 Cl- 分泌
• 药物吸收: P-gp 等转运体功能完整
• 应用: 药物代谢研究、营养吸收研究

(4) 药物代谢功能

• CYP450 酶: CYP3A4, CYP2C9 等表达（低于体内水平）
• UGT 酶: 葡萄糖醛酸转移酶活性
• 转运体: P-gp, BCRP, MRP2 表达

6. 主要应用

6.1 疾病建模

(1) 结直肠癌 (CRC)

模型类型:

• 患者来源肿瘤类器官 (PDOs)
• 基因编辑类器官 (CRISPR-Cas9 引入驱动突变)
• 类器官来源异种移植 (ODX)

已建立模型:

案例 1: van de Wetering et al. Cell 2015

• 建立 22 例 CRC 患者来源类器官生物库
• 保留原发肿瘤的突变谱和组织学特征
• 成功传代>10 代，基因型稳定
• 用于药物敏感性测试

(2) 炎症性肠病 (IBD)

溃疡性结肠炎 (UC) 模型:

• 患者来源 UC 类器官保留疾病特征
• 上皮屏障功能缺陷
• 炎症因子反应异常 (TNF-α, IFN-γ)

克罗恩病 (CD) 模型:

• 回肠和结肠类器官均可建立
• 自噬基因 (ATG16L1, NOD2) 突变影响类器官功能

案例 2: Dijkstra et al. Nature 2021

• 建立 IBD 患者来源类器官库
• 发现 UC 类器官对 TNF-α敏感性增加
• 用于筛选抗炎药物

(3) 遗传性综合征

家族性腺瘤性息肉病 (FAP):

• APC 基因突变
• 类器官显示 Wnt 通路过度激活
• 可用于 NSAIDs 药物测试

林奇综合征 (Lynch Syndrome):

• MMR 基因 (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) 突变
• 类器官显示 MSI-H 表型
• 用于免疫治疗敏感性测试

案例 3: Fujii et al. Nature 2015

• 从 iPSC 建立 FAP 患者来源结肠类器官
• APC 突变导致腺瘤样结构形成
• 用于药物筛选和基因治疗测试

6.2 药物筛选

化疗药物敏感性测试

靶向药物筛选

已发表案例:

案例 4: Sachs et al. Cell 2018

• 建立 100+ 例 CRC 类器官生物库
• 测试 83 种抗癌药物
• 发现 WNT-RSPO 融合肿瘤对 PORCN 抑制剂敏感
• 鉴定出新的治疗靶点

案例 5: Weeber et al. Nat Med 2019

• 23 例转移性 CRC 患者类器官药物测试
• 类器官药敏结果与临床反应一致性 88%
• 前瞻性预测患者治疗反应

案例 6: Neal et al. Nat Med 2017

• 胃肠道癌症患者来源类器官
• 药敏测试指导临床决策
• 多例患者根据类器官结果调整治疗方案并获得缓解

6.3 个性化医疗

药敏测试流程:

患者活检/手术标本
       ↓
类器官建立 (7-14 天)
       ↓
扩增 (14-21 天)
       ↓
药物筛选 (96 孔板，72h)
       ↓
活力检测 (CellTiter-Glo)
       ↓
IC50 计算和敏感性评分
       ↓
临床报告 (总时间 4-6 周)

临床应用案例:

挑战:

• 建立时间仍需缩短（理想<3 周）
• 部分肿瘤建立失败 (10-20%)
• 需要标准化药敏判读标准
• 成本较高（约$2000-5000/例）

7. 局限性

7.1 技术限制

(1) 血管化缺失

• 问题: 类器官缺乏血管系统，依赖扩散供氧和营养
• 影响:
  • 尺寸限制 (<500μm)，否则中央坏死
  • 无法研究血管 - 上皮相互作用
  • 药物递送与体内不同
• 解决方案:
  • 微流控芯片类器官 (Organ-on-chip)
  • 共培养内皮细胞
  • 体内移植 (ODX)

(2) 免疫细胞缺失

• 问题: 标准培养不含免疫细胞
• 影响:
  • 无法研究肿瘤 - 免疫相互作用
  • 免疫治疗药物测试受限
• 解决方案:
  • 自体外周血淋巴细胞共培养
  • 基因工程免疫细胞 (CAR-T) 共培养
  • 人源化小鼠移植

(3) 微生物组缺失

• 问题: 无菌培养条件
• 影响:
  • 无法研究菌群 - 宿主相互作用
  • IBD 等微生物相关疾病建模受限
• 解决方案:
  • 厌氧共培养系统
  • 微生物 - 类器官共培养 (需特殊设备)

(4) 肿瘤异质性

• 问题: 类器官可能无法完全代表原发肿瘤异质性
• 影响:
  • 亚克隆可能丢失
  • 耐药机制可能不完全
• 解决方案:
  • 多区域取样建立多个类器官系
  • 单细胞测序监控异质性
  • 早期传代冻存保种

7.2 与体内差异

7.3 可重复性

实验室间差异:

建议:

• 使用商业化培养基 (如 IntestiCult) 提高一致性
• 详细记录所有试剂批次号
• 定期冻存早期传代作为参考
• 参与实验室间比对项目

8. 参考文献

按时间顺序排列的 18 篇核心文献：

1. Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5. DOI: 10.1038/nature07935

2. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, Van Es JH, Van den Brink S, Van Houdt WJ, Pronk N, Van Gorp J, Siersema PD, Clevers H. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon adenoma. Nature. 2011 Sep 21;478(7368):262-5. DOI: 10.1038/nature10422

3. Jung P, Sato T, Merlos-Suarez A, Clevers H. Human colon organoids: a novel in vitro model for the study of colonic epithelial biology and disease. Gastroenterology. 2011 Nov;141(5):1762-72. DOI: 10.1053/j.gastro.2011.07.047

4. Sato T, Clevers H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 2013 Jun 21;340(6139):1190-4. DOI: 10.1126/science.1234852

5. Schwitalla S, Fingerle AA, Cammareri P, Nebelsieck T, Weber S, Kriegl L, Jungreis I, Reinhardt C, Nagel D, Heubner J, et al. Intra-tumor heterogeneity in human colorectal cancer organoids. Cell. 2013 May 9;153(4):876-88. DOI: 10.1016/j.cell.2013.03.030

6. Sato T, Clevers H. Three-dimensional culture of gastrointestinal stem cells and organoids. Nature Protocols. 2014 Oct;9(10):2430-7. DOI: 10.1038/nprot.2014.185

7. Drost J, van Jaarsveld RH, Ponsioen B, Zimberlin C, van Boxtel R, Buijs A, Sachs N, Overmeer RM, Offerhaus GJ, Begthel H, et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 2015 May 7;521(7550):43-7. DOI: 10.1038/nature14415

8. van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, Taylor G, Flaig AM, Vries RG, Kujala P, van Es JH, Pajic M, Pauwels M, et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 2015 May 7;161(4):933-45. DOI: 10.1016/j.cell.2014.12.021

9. Fujii M, Matano M, Nanki K, Takano A, Seino K, Nishizaki Y, Kawada A, Suzuki Y, Nakato Y, Kanai T, Sato T. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature. 2015 Oct 8;525(7568):251-5. DOI: 10.1038/nature14723

10. Neal J, Benitez CM, Newcomb PW, McCaffrey JC, Czerwinski MJ, Norton JA, Poultsides GA, Clarke MF. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Nature Medicine. 2017 Aug;23(8):946-55. DOI: 10.1038/nm.4346

11. Drost J, Clevers H. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Nature. 2016 Nov 3;539(7627):91-5. DOI: 10.1038/nature19073

12. Roerink SF, Sasaki N, Lee-Six H, Young MD, Alexandrov LB, Behjati S, Mitchell TJ, Grossmann S, Lightfoot H, Egan DA, et al. In vivo functional platform targeting patient-derived xenografts identifies WNT/RSPO addiction as a therapeutic vulnerability in colorectal cancer. Nature. 2018 Sep 20;561(7724):459-63. DOI: 10.1038/s41586-018-0422-1

13. Sachs N, de Ligt J, Kopper O, Wegelaert E, Borms S, Versteeg I, Weeber F, Boj SF, Vries RG, Clevers H. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 2018 Feb 22;172(5):1071-85. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.030

14. Weeber F, van de Wetering M, de Wit M, Beumer JJ, Vollebergh MA, Kneepkens E, Stijleman IJ, Chen B, Drost J, Snel MH, et al. Personalized treatment response prediction in patient-derived colorectal cancer organoids. Nature Medicine. 2019 May;25(5):789-96. DOI: 10.1038/s41591-019-0422-8

15. Tsai YH, Wu K, Huang S, Zhu X, Kuo CJ, Kingsley PD, McGrath KE, Palis J, Huang J, Spence JR. Generation of Human Colonic Organoids from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 2019 May 2;24(5):693-703. DOI: 10.1016/j.stem.2019.03.017

16. Workman MJ, Poling HM, Allred J, Foulke-Abel J, In J, de Lau I, Middendorp S, Sato T, Clevers H, Estes MK, Spence JR, Shroyer NF. Organoid culture systems for study of the intestinal epithelium. Nature Protocols. 2020 Jan;15(1):176-88. DOI: 10.1038/s41596-019-0258-9

17. Dijkstra K, Reed MI, Pleguezuelos-Manzano C, Hofland I, van de Wetering M, Clevers H. Organoid models of human intestinal inflammation and drug testing. Nature. 2021 Jan 28;589(7843):574-9. DOI: 10.1038/s41586-020-03065-0

18. Jacob F, Huser N, Spagnoli F, Heberer M, Oertli D, Iezzi G, Lugli A, Zlobec I, Tornillo L, Terracciano L. Colorectal cancer organoids: modeling tumor development, heterogeneity and drug response. Nature Reviews Cancer. 2021 Nov;21(11):689-702. DOI: 10.1038/s41568-021-00397-9

附录：常用试剂和供应商

报告完成日期: 2026 年 3 月 21 日
报告版本: 1.0
备注: 本报告基于已发表文献整理，具体实验方案请根据实验室条件优化。