人 iPSC 肾类器官单细胞图谱：27 天分化全程 53 类细胞身份与"非目标"群体溯源

Human iPSC Kidney Organoid Single-Cell Atlas: 53 Cellular Identities and the Origin of Off-Target Populations Across 27 Days

Wilson SB, Vanslambrouck JM, Murphy A, Neavin DR, Powell JE, Howden SE, Little MH. Classification of indeterminate and off-target cell types within human kidney organoid differentiation. iScience. 2026 Jun 19;29(6):115752.

DOI: 10.1016/j.isci.2026.115752 | PMID: 42164856 | PMC: PMC13186046

标签: #organoid #kidney #single-cell #scRNA-seq #iPSC #off-target #Takasato #DevKidCC #developmental-biology

📣 摘要

人 iPSC 定向分化形成的肾类器官中，长期存在无法归类或错误归类的细胞群体。要判断这些"非目标（off-target）细胞"究竟是培养失误、随机污染还是发育过程的必然产物，前提是把每一个细胞都归到明确身份上——而这恰恰是当前领域最薄弱的一环：早期人胚胎参考数据稀缺、体外细胞态在体内找不到对应物、不同实验室命名体系互不兼容。

本研究以最常用的 Takasato 肾类器官协议为骨架，设计了一套时间分辨 × 多因子扰动的单细胞转录组图谱：4 个分化阶段、3/4/5 天 CHIR 暴露（3c/4c/5c）、21 种培养条件变体、13 次独立的 10x 单细胞捕获、HTO 样本多重标记，最终保留 150,957 个细胞，采用 5 套分类算法 + 肾谱系专用分类器 DevKidCC + Azimuth 标签转移交叉验证，定义了 53 个独立细胞身份。

核心技术：(1) 27 天四阶段时间序列 + 21 条件因子的实验设计；(2) Hash-Tag Oligo 样本多重标记 + 同批次测序以抑制批次效应；(3) 五种参考分类工具（SCINA / scAnnotatR / scClassify / SciBet / scPred）与 DevKidCC、Azimuth 交叉验证；(4) k-means 无监督聚类后逐群二次分类，用于攻克参考图谱缺失的过渡期细胞。

核心结论：即使是最成熟、最常用的协议，Stage 3 有 47.9% 的细胞无法被肾谱系专用分类工具 DevKidCC 归入任何体内身份；Stage 4（第 27 天）成熟类器官中仍稳定存在神经元、胶质细胞、肌细胞与卫星细胞等 off-target 群体。这些群体是协议固有属性（跨细胞系、跨实验室、跨批次一致出现），但可通过延长 CHIR 暴露、抑制 BDNF 信号、改良培养基等手段显著削减——而每一种优化都伴随代价（例如消除神经与肌肉 off-target 的同时引入了软骨群体）。此外，本研究纠正了两个既往的身份判定错误：表达 MLANA/PMEL 的"色素细胞"实为施旺细胞；并首次在肾类器官中报道了 ATF3 阳性室管膜细胞。

🔬 研究背景

核心问题：

• 肾类器官协议已被反复证明能形成含分段肾单位的组织结构，但未分配细胞身份在多个独立协议中被持续报告——这些"不可分配"的细胞能否被系统性归类，而不是被当作噪声丢弃？
• 体外培养体系与体内参考图谱之间存在命名体系、转录状态、批次效应的多重鸿沟——依赖单一参考数据集或单一分类工具，能否给出可信的细胞身份判定？
• 肾类器官中的神经元、肌细胞、神经嵴细胞等非肾群体，究竟是操作污染、细胞系特性，还是定向分化路径本身的分叉产物？
• 若 off-target 是协议固有属性，那么通过调整少数几个早期培养变量（CHIR 时长、生长因子组合），能否在不牺牲肾单位质量的前提下削减它们？

围绕这四个问题，本研究选择了一条"笨办法"——把整个分化过程的每一个细胞都摆到台面上分类，而不是只关注最终产物里"看起来对"的那些。

🧪 实验方法

设备与平台

• 10x Genomics Chromium Controller（单细胞捕获）+ Chromium Single Cell Chip B
• Illumina NextSeq 500/550（HTO 文库测序）+ NovaSeq 6000（mRNA 测序）
• 细胞培养：Matrigel 包被板 + 气液界面 Transwell 培养
• 免疫荧光成像：EPCAM（肾单位）、GATA3（远端小管）、HNF4A（近端小管）、MAFB（足细胞）四标

模型与试剂

• iPSC 系：CRL2429-MAFBmTagBFP2/GATA3mCherry（带 MAFB 与 GATA3 双荧光报告）
• 维持培养：Essential 8 培养基 + Matrigel 包被，37℃、5% CO₂，每 3–4 天 EDTA 传代
• 分化培养基：TeSR-E6（低因子基础培养基）
• 关键小分子/因子：CHIR99021（GSK3β 抑制剂，模拟经典 WNT 信号，7 μM）、人重组 FGF9、肝素钠、GDF11；抑制剂包括 LDN193189（SMAD 抑制）与 AGN193109（泛 RAR 抑制）
• 抗体试剂：Totalseq-A HashTag Oligo（样本标记）、抗 EPCAM-488 / GATA3 / HNF4A / MAFB / GFAP / S100β 及对应二抗

处理：四阶段 × 21 条件的时间分辨设计

分化按 Takasato 协议分为四个阶段，并在前三阶段施加单因子扰动，共形成 21 种条件变体：

形态学操作：细胞以 7×10⁴ 密度接种于 6 孔板起始分化；Stage 2 结束后消化为单细胞，重悬成 2×10⁵/μL 的致密细胞糊，取 1 μL 滴加于 Transwell 膜朝气一侧，每张膜 6 个类器官——该沉积方式明确对标挤出式生物打印的细胞糊挤出过程。随后以 5 μM CHIR 脉冲 1 小时，再进入 5 天生长因子培养，之后仅换 TeSR-E6 至第 27 天。

分析

• 捕获规模：13 次独立单细胞捕获（前 14 天 7 次同批测序 + 第 27 天 6 次第二批测序）；每样本 3 个技术重复在捕获前合并；每通道最多标记 8 种条件
• 质控：Cell Ranger v1.3.1 比对；HTOdemux 判定 singlet/doublet，保留 >2000 基因的单细胞
• 整合与降维：Seurat v4.2.0 + SCTransform；以 simspec 的 CSS 算法做 13 次捕获的跨样本整合；k-means 聚类 + UMAP/tSNE 可视化
• 分类工具：SCINA、scAnnotatR、scClassify、SciBet、scPred 五套算法分别配合不同参考图谱；DevKidCC v0.3.0（人胎儿肾专用三级分类器）用于 Stage 3–4；Azimuth 标签转移（人胎儿 15 器官图谱）用于 Stage 4 交叉验证
• 数据公开：GEO GSE269904（scRNA-seq 与 bulk RNA-seq）、Zenodo 18732338（anndata 注释对象）、代码仓库 KidneyRegeneration/Wilson2026

📊 核心结果与配图

一、Stage 1：原始条分化不完全，iPSC 样细胞在 5 天 CHIR 后仍残留（图 1）

做了什么：对 Stage 1（CHIR 处理后第 3、4、5 天）的全部细胞做无监督聚类，并分别用 4 套体内/体外参考数据集（人胚胎 Tyser、小鼠 Tanigawa、人源体外 Minn 与 Diaz-Cuadros）配合 5 种分类工具做参考分类；同时用 Harmony、CSS、fastMNN 三种方法做批次校正，并以 pseudobulk Pearson 相关复验。

发现什么：参考分类结果高度依赖所选数据集与算法，批次校正改善了但未能消除人源单细胞参考带来的批次效应——即参考分类在早期阶段不可靠，最终改用"标准降维聚类 + 差异表达"手动注释。Stage 1 得到 5 个群体：iPSC-like、NMP（神经中胚层祖细胞）、early_pPS、late_pPS_1、late_pPS_2。其中 iPSC-like 残留比例为 3 天 CHIR 组 0.22%、5 天 CHIR 组 0.18%；early_pPS 中 >95% 来自 3 天组，late_pPS_2 中 >50% 来自 5 天组且几乎不含 3 天细胞。拟时序显示 POU5F1 与 T 随分化下调，MIXL1、MSX2、TBX6 上调。

说明什么：CHIR 时长在 Stage 1 就决定细胞沿原始条轴推进的深度——短 CHIR 停留在早期状态，长 CHIR 推进到晚期状态。更重要的是，无论 3 天还是 5 天，始终残留一小撮"未能响应 CHIR"的未分化细胞，其存在形式是异步分化（落后细胞持续不响应），而非简单的双态开关。这条线索为下游 Stage 3 大量的"未分配"细胞提供了第一个解释入口。

图 1. 实验流程、执行与数据分析总览。 (A) 实验设计示意：以 Takasato 肾分化协议为基础协议，叠加 6 组单因子改动，合计 7 种分化条件；所有条件在 Stage 1 均含 3、4、5 天 CHIR99021 处理（3c、4c、5c）；每条件设 3 个技术重复，分化早期重复独立培养、后期合并于同一小室共培养；采用 Hash-Tag Oligo 标记后混样测序，每通道最多并行 8 种条件。(B) 第 27 天类器官的明场（左）与免疫荧光（右）成像，分别取自 3c / 4c / 5c 条件；染色标记为肾单位（EPCAM，蓝）、远端小管（GATA3，绿）、近端小管（HNF4A，白）、足细胞（MAFB，红），标尺 100 μm。(C) 全部细胞按分化阶段着色的 tSNE 降维图。(D) Stage 1 细胞按培养天数着色的 UMAP 图。(E) Stage 1 拟时序投影 UMAP 图。(F) 多能性、神经中胚层祖细胞、原始条与早期前体节中胚层标记基因的表达点图，点大小代表表达细胞比例、颜色深浅代表相对表达水平。(G) Stage 1 细胞按注释结果（iPSC-like、NMP、early_pPS、late_pPS_1、late_pPS_2）着色的 UMAP 图。(H) 各细胞类型中来自不同培养天数的细胞占比。(I) Stage 1 关键分化标记基因沿拟时序的表达变化曲线。

二、Stage 2：中胚层与神经谱系并存的异质混合体，CHIR 时长决定分叉方向（图 2）

做了什么：对 Stage 2（CHIR 后 4 天处理，培养第 7/8/9 天）的 44,282 个细胞做聚类与差异表达分析，重点追踪 PAX8、PAX2、GATA3（肾系中胚层）、SIX2（肾祖细胞）、SOX2 与 PAX3（神经）、MYL9 与 ANXA1（肌肉）、TCF15 与 MEOX2（副轴中胚层）、FGF8 与 SP5（后部前体节中胚层）的表达分布，并比较 3c / 4c / 5c 三种 CHIR 时长下的群体构成。

发现什么：识别出 PAX8+CITED1+ 的中间中胚层（IM-1、IM-2）、TCF15+MEOX2+ 的副轴中胚层（PM）、FGF8+SP5+ 的后部前体节中胚层（pPSM）、SOX2+PAX3+ 的神经祖细胞（Neural-Prog），以及缺乏特异谱系标记的中胚层 1/2/3。除 Neural-Prog 外，所有群体均富集 FOXC1/FOXC2，指示中胚层承诺。在所有三种 CHIR 条件下，未指定中胚层占比均超过 25%。CHIR 时长的影响呈现清晰的剂量依赖：Neural-Prog 比例随 CHIR 延长而下降，而 pPSM 几乎只出现在 5 天 CHIR 条件中；三种条件下均以 on-target 的 IM-1 为主，PM 极少，未见侧板中胚层证据。

说明什么：分叉点出现在 Stage 2——同一批细胞中，短 CHIR 让一部分细胞滑向神经祖细胞命运，长 CHIR 则把细胞更久地留在中胚层承诺轨道上。这解释了为什么"延长 CHIR"成为后续削减神经 off-target 的抓手，也说明未指定中胚层的高占比（>25%）本身就是后续 Stage 3 分类困难的伏笔。

图 2. CHIR 介导的细胞过渡伴随异步分化与异质性细胞群体。 (A) Stage 2 样本的 UMAP 图，按群体标记基因表达着色。(B) 点图展示 PSM、IM、中胚层、神经嵴/神经祖细胞及各 off-target 群体在每一注释群体中的关键标记基因表达；点大小关联该簇中表达该基因的细胞比例，颜色深浅表示相对表达水平。(C) Stage 2 样本的 UMAP 图，标注最终细胞身份注释结果。(D) 本研究内 Takasato 协议条件子集在 Stage 2 的 UMAP 图，按 CHIR 处理时长着色。(E) 同一子集的热图（按各样本中各细胞类型占比着色）与堆叠柱状图（各条件细胞绝对数量）。(F) 拟时序轨迹分析，展示从 pPS 经 PSM 向 IM 的连续分化过程，可见 off-target 群体（神经祖细胞、肌节）在分化早期即发生分支。

三、Stage 3：47.9% 细胞无法被肾专用工具归类，k-means 二次分类揭示三大 off-target（图 3）

做了什么：Stage 3 共 34,386 个细胞。首先直接套用基于人胎儿肾训练的 DevKidCC 三级分类器；针对大量未分配细胞，改用 k-means 无监督聚类，再对每个聚类逐群重新执行 DevKidCC 分类，并结合差异表达基因与标记基因点图做人工核验。

发现什么：DevKidCC 初始分类结果为 52.1% 归入肾谱系、47.9% 未分配；肾系中 31.5% 为肾单位谱系、20.6% 为间充质谱系，内皮细胞为 0 个，输尿管上皮仅 5 个。名为 NPC-like 的类别在基质与未分配区域广泛散布，作者据此判断该类别是体外培养产生的伪类别（artifact）。k-means 重新聚类后逐群二次分类（图注标注 13 个聚类，编号 0–12；正文表述为 12 个群体）得到清晰的三分格局：on-target 群体（NPC-1、Early_Nephron、UrEp 及增殖型肾祖细胞 pNPC）、模糊中胚层群体（IM-3、AdvMes-1/2/3、Early_Stroma）、以及 off-target 群体（Neural_Crest、Early_Neuron、myotome，后者由 MYL1 强表达搭配 TCF15/PAX3/SCX 界定）。在原始 Takasato 条件内部，Early_Nephron 与 NPC-1 占比最高；Early_Stroma 及其近邻 AdvMeso-2 在 5 天 CHIR 条件中显著富集，而 Early_Neuron 与 IM-3 则在 3 天 CHIR 条件中富集。

说明什么：两个关键判断——其一，肾谱系专用分类工具在"中间中胚层向肾单位过渡"的窗口期不可靠，47.9% 未分配并非细胞"没有身份"，而是工具在过渡态失配；其二，谱系分叉（肾 vs 非肾）发生在 Stage 3，这意味着 off-target 的"出生时刻"可以精确定位到分化中段，而不是末期污染。

图 3. Stage 3 分化中肾系与"非目标"细胞类型并存。 (A) Stage 3 细胞的 UMAP 图，按 DevKidCC 分类的谱系身份拆分着色，未纳入分类的细胞以灰色显示。(B) Stage 3 细胞的 UMAP 图，按 PAX8、SIX2、CITED1、PAX2、COL3A1、PDGFRA、PRRX1、ZIC1、PAX3、SOX2 十一个标记基因的表达着色，展示各样本中的相对表达域。(C) Stage 3 细胞按 k-means 聚类身份着色的 UMAP 图。(D) 柱状图，展示 13 个 k-means 聚类中 DevKidCC 分类谱系身份的占比，用于判断各聚类是富集于已分类细胞类型还是含有未知身份。(E) 点图展示 Stage 3 各聚类的关键标记基因表达，点大小代表表达细胞比例、颜色代表相对平均表达水平。(F) Stage 3 细胞按注释身份着色的 UMAP 图。(G) Takasato 协议条件子集在 Stage 3 的 UMAP 图，按 CHIR 处理时长着色。(H) 同一子集的热图（按细胞类型占比）与堆叠柱状图（细胞绝对数量）。

四、Stage 4：成熟类器官中 off-target 稳定存在，并纠正两个身份误判（图 4）

做了什么：Stage 4（第 27 天）共 59,631 个细胞。重复 k-means 聚类 + 逐群 DevKidCC 二次分类流程，并对未分配聚类做差异表达分析；同时用 Azimuth 标签转移把全部细胞投影到覆盖 15 个器官的人胎儿图谱上交叉验证。

发现什么：聚类得到肾单位类（聚类 3、5、6、7、13）、基质类（0、9、12、14）与未分配类（1、2、4、8、10、11）三组，共 15 个聚类。未分配聚类的 top 差异基因指向神经标记（SOX2、STMN2、SOX10）与肌肉标记（PAX3、PAX7、MYOG）。三项具体发现：其一，鉴定出表达 ATF3 的室管膜细胞群体，此前未在肾类器官研究中被识别；其二，表达 MLANA/PMEL 的所谓"色素细胞"，因同时表达神经嵴与胶质标记 S100B、SOX10，实为施旺细胞，此前在多篇研究中被误标为黑色素细胞；其三，成熟类器官中仅见 1 个内皮细胞，与既往研究一致地指向血管化缺失。Azimuth 投影显示 on-target 聚类与肾后肾、肾输尿管芽注释相关性最高，但多数细胞的最大相似性得分低于 0.5，足细胞甚至与肾脏身份无相关性——提示体外细胞态与体内参考之间存在真实且系统性的差距。此外，仅取 Takasato 原始三条件（3c/4c/5c）的子集时，几乎所有神经与胶质－室管膜细胞被剔除，说明这些群体来源于其他扰动条件；5 天 CHIR 条件则神经细胞耗竭、on-target 基质群体富集。

说明什么：成熟类器官的"身份账本"需要重新校对——一方面，被当作污染丢弃的群体里混有从未被识别的真实类型（室管膜细胞）；另一方面，被沿用了多年的错误标签（黑色素细胞）需要更正为施旺细胞。这对下游质检的意义是：只验 on-target 标记不足以判断纯度，必须同时核验 off-target 群体的真实身份，否则既会漏报也会误报。

图 4. 终末期（Stage 4）肾类器官中存在的多种"非目标"细胞类型。 (A) Stage 4 细胞的 UMAP 图，按 DevKidCC 分类谱系身份拆分着色，未纳入分类的细胞为灰色。(B) Stage 4 细胞按 k-means 聚类身份着色的 UMAP 图。(C) 柱状图展示 15 个 k-means 聚类中 DevKidCC 分类谱系身份的占比，用于识别富含已分类细胞类型或含未知身份的群体。(D) Stage 4 细胞按 EPCAM、NPHS1、PDGFRA、SOX2、STMN2、SOX10、PAX3、PAX7、MYOG、ATF3、MSX1、OGN 十二个基因表达着色的 UMAP 图。(E) 点图展示 Stage 4 各聚类关键标记基因的表达强度与表达细胞比例。(F) Stage 4 细胞按注释身份着色的 UMAP 图。(G) Takasato 协议条件子集在 Stage 4 的 UMAP 图，按 CHIR 处理时长着色。(H) 同一子集的热图（按细胞类型占比）与堆叠柱状图（细胞绝对数量）；缩略语包括 NPC 肾祖细胞、UrEp 输尿管上皮、Endo 内皮、PT 近端小管、Pod 足细胞、PEC 壁层上皮细胞、LOH 髓袢、EN 早期肾单位、EDT 早期远端小管、CS 皮质基质、MS 髓质基质、MesS 系膜基质。

五、跨研究比对：off-target 是协议固有属性，优化必有代价（图 5）

做了什么：把本研究图谱作为共同参照，用 Seurat anchor 标签转移把三项既往研究（Subramanian、Wu、Vanslambrouck）的公开数据投影到本研究 Stage 4 与 Stage 3 数据上，比较各研究中 off-target 亚群的分布、比例与最大相似性得分。其中 Wu 数据集额外包含 BDNF 抑制处理组（Wu_TB）。

发现什么：四项研究（含本研究）的 on-target 肾系群体高度重叠，差异全部集中在 off-target 侧。Subramanian 类器官含更多远端化肾单位、神经亚群更少；Wu 数据集中包含本研究描述的全部细胞类型；Vanslambrouck 改良路线（Van_D27）几乎不含神经与肌肉 off-target，但此前已被证明含有软骨群体。跨全部研究，off-target 细胞的最大相似性得分多高于 0.5，说明其身份判定是真实的转录一致性而非被迫映射。Stage 3 层面的比对则显示：Vanslambrouck 第 13 天样本维持于肾祖细胞扩增培养基，因此 IM-3 与 NPC-1 得分更高；其余研究已启动肾发生，AdvMeso-1/2 等模糊中胚层比例更高。

说明什么：off-target 跨细胞系、跨实验室、跨批次稳定复现，因此不是操作失误而是定向分化路径的内禀属性。同时，三条优化路径的代价被清晰量化：BDNF 抑制削减神经谱系，改良培养基几乎清除神经与肌肉 off-target，但引入软骨——不存在"全赢"的单一协议，选择取决于目标组织与可容忍的非目标谱系。

图 5. 既往研究的类器官细胞比例投影到本研究图谱后呈现一致的 off-target 群体。 (A) 三项既往研究（Subramanian、Wu、Vanslambrouck）使用 Takasato 协议变体生成并测序的类器官 UMAP 投影：投射到本研究完整 Stage 4 数据集后，每项投影均显示"on-target"肾系群体的重叠，同时呈现不同"off-target"亚群的分布与富集程度差异。(B) 各样本中全部 off-target 细胞最大投影相似性得分的小提琴图（同一研究内的批次与重复已合并）。(C) 各研究中对应 Stage 3 时间点的样本投影到本研究 Stage 3 数据后的最大相似性得分小提琴图。(D) 协议优化决策依据示意：基于目标组织优先级在神经/肌肉 off-target 与软骨群体之间做取舍。缩略语包括 Sub 为 Subramanian、Van 为 Vanslambrouck、TB 为含 BDNF 抑制的 Takasato 样本、PTE 为近端小管增强样本。

六、53 类细胞身份的完整量化底表

论文表 1 给出 53 个分类身份在四个阶段与 3c/4c/5c 条件下的细胞数量完整分布，构成本研究可复用的基础数据。该表也是判断"某一身份来自哪个条件"的直接依据，例如 early_pPS 的 3 天组占比超过 95%、pPSM 几乎全部来自 5 天 CHIR 条件等结论，均可由该表逐项复核。

对类器官生产与质检的四条可迁移启示

1. 早期一个变量即可改变终产物纯度构成：CHIR 暴露时长（3 天 vs 5 天）在 Stage 2 即决定神经祖细胞与后部前体节中胚层的比例走向，并在 Stage 4 复现为"神经耗竭、基质富集"。这一变量对任何以 WNT 激动启动中胚层承诺的分化流程都适用，属于协议级、不绑定设备的可操作项。

2. 过渡期必须用多工具 + 多参考交叉验证：单一肾谱系专用分类器在中间中胚层向肾单位过渡的窗口期有 47.9% 无法归类，且会产生伪类别。任何基于单细胞组学做产物放行判定的流程，都应采用"无监督聚类 + 逐群二次分类 + 差异表达核验 + 独立参考图谱标签转移"的组合策略。

3. 身份判定需要双向核验：本研究把沿用多年的"黑色素细胞"更正为施旺细胞，并首次识别出 ATF3 阳性室管膜细胞。因此纯度评估不能只测 on-target 阳性率，还应主动确认 off-target 群体的真实身份——只看目标标记会同时造成漏报与误报。

4. 优化是有代价的，需按目标组织做取舍：BDNF 抑制与改良培养基可分别削减神经或神经＋肌肉 off-target，但后者引入软骨群体。任何宣称"全面提高纯度"的协议改良，都应以跨谱系全谱盘点（而非单一标记）作为验证标准。

数据可复用性：单细胞数据（GEO GSE269904）、注释对象（Zenodo 18732338）与代码仓库均公开，可作为二次分析与方法学基准，用于评估其他协议变体的产物构成。

🏷️ 结论

1. "非目标"细胞是协议固有属性：跨细胞系、跨实验室、跨批次，四项独立研究一致复现同一批 off-target 谱系，因此不能简单归因于操作污染或细胞系差异。
2. 分叉发生在分化中段：Stage 2 出现神经与中胚层命运分离，Stage 3 完成肾系与非肾系的分道，这一定位把 off-target 的干预窗口从"终产物筛选"前移到"早期变量调整"。
3. 延长 CHIR 暴露可有效削减神经谱系：3 天 CHIR 富集 Early_Neuron 与 IM-3，5 天 CHIR 富集 on-target 基质并耗竭神经细胞，且该效应从 Stage 2 延续到 Stage 4。
4. 肾谱系专用分类工具在过渡期不可靠：Stage 3 有 47.9% 细胞无法归入体内身份，NPC-like 被判定为体外伪类别，必须辅以多工具与多参考交叉验证。
5. 身份账本需双向校对，且优化必带代价：MLANA/PMEL 阳性细胞实为施旺细胞、ATF3 阳性室管膜细胞为首次报道；同时改良路线在清除神经与肌肉 off-target 时引入软骨群体，提示纯度优化需按目标组织权衡。

📖 文献信息

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📚 参考文献

1. Takasato, M., Er, P.X., Chiu, H.S., et al. (2015). Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature 526, 564–568. https://doi.org/10.1038/nature15695
2. Wu, H., Uchimura, K., Donnelly, E.L., et al. (2018). Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell 23, 869–881.e8. https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.10.010
3. Subramanian, A., Sidhom, E.-H., Emani, M., et al. (2019). Single cell census of human kidney organoids shows reproducibility and diminished off-target cells after transplantation. Nature Communications 10, 5462. https://doi.org/10.1038/s41467-019-13382-0
4. Wilson, S.B., Howden, S.E., Vanslambrouck, J.M., et al. (2022). DevKidCC allows for robust classification and direct comparisons of kidney organoid datasets. Genome Medicine 14, 19. https://doi.org/10.1186/s13073-022-01023-z
5. Lawlor, K.T., Vanslambrouck, J.M., Higgins, J.W., et al. (2021). Cellular extrusion bioprinting improves kidney organoid reproducibility and conformation. Nature Materials 20, 260–271. https://doi.org/10.1038/s41563-020-00853-9

转发语: 这篇 iScience 做了一件"笨但有用"的事——把肾类器官 27 天分化里 150,957 个细胞逐个归类成 53 种身份，结论很硬：所谓"杂细胞"不是操作失误，而是分化路径本身的内禀产物，跨实验室跨细胞系都复现。三个可以直接拿去用的点：① 延长 CHIR 暴露（3 天→5 天）能显著削掉神经类杂细胞，效应从中段延续到终产物；② 中间过渡期千万别只用单一分类工具，专用工具在这里有近一半细胞归不了类；③ 有个沿用了多年的身份标签被更正了——"黑色素细胞"其实是施旺细胞。另外提醒一句：所有"提高纯度"的改良都带代价，消除神经和肌肉杂细胞的路线会引入软骨，选协议要按目标组织权衡。🧠⚡

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