人诱导多能干细胞生成光响应视网膜类器官具有可变且依赖营养的效率

期刊: Stem Cells, 2018, 36: 1535-1551
IF: ~6.0
DOI: 10.1002/stem.2883
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作者: Dean Hallam, Gerrit Hilgen, Birthe Dorgau, Lili Zhu, Min Yu, Sanja Bojic, Philip Hewitt, Michael Schmitt, Marianne Uteng, Stefan Kustermann, David Steel, Mike Nicholds, Robert Thomas, Achim Treumann, Andrew Porter, Evelyne Sernagor, Lyle Armstrong, Majlinda Lako

机构: 英国纽卡斯尔大学遗传医学研究所, 神经科学研究所, Merck KGaA, Novartis, Roche

核心科学问题

人 iPSC 衍生视网膜类器官的效率是否因细胞系而异？营养条件如何影响视网膜类器官的分化和功能成熟？

研究背景：

视网膜类器官作为药物筛选和毒理学测试的体外模型需求迫切
现有方案缺乏标准化，不同细胞系效率差异大
需要可规模化生产的光响应视网膜类器官

技术方案

细胞系

WT1: 女性，31 岁（高效）
WT2: 男性，68 岁（高效）
WT3: 女性，84 岁（中效，倾向 RPE）
RP: 视网膜色素变性患者（PRPF31 突变）
AMD: 年龄相关黄斑变性患者（CFH 风险等位基因）

分化方案

EB 形成：Accutase 解离 → 96 孔 U 底板 3000-12000 细胞/孔 + Y27632（48h）
诱导期（day 0-6）：mTeSR1 + ROCK 抑制剂
** BMP4 添加**（day 6）：1.5 nM
维持期（day 18-24）：DMEM/F12 + 10% FBS + N2 + CHIR99021（3 μM）+ SU5402（5 μM）
成熟期（day 24+）：不含 CHIR99021 和 SU5402

实验设计（DoE）

因子设计 1：细胞密度（6000/12000）、1-硫代甘油（300/600 μM）、BMP4（0.75/2.25 nM）、KSR（5%/15%）、脂质（0.5%/1.5%）
因子设计 2：细胞密度（3000/8000）、CHIR99021（1.5/6 μM）、SU5402（2.5/10 μM）、BMP4（2/5 nM）

表征方法

免疫荧光：VSX2、CRX、RCVRN、HuC/D、RLBP1、MITF、Rho、OPN1LW/MW、OPN1SW、MATH5、PROX1
qRT-PCR：视网膜标记基因表达
透射电镜（TEM）：光感受器超微结构
3Brain BioCam 4096 MEA：光响应、cGMP/GABA 药理学
LDH 细胞毒性测试：莫西沙星毒性评估

实验数据

1. iPSC 系衍生视网膜类器官效率差异

Figure fig6
图 1：5 个 iPSC 系衍生视网膜类器官效率差异显著 | WT1 和 WT2 高效形成神经视网膜（NR） | WT3 和 AMD 倾向形成 RPE 球 | RP 效率居中 | 基因表达分析显示 VSX2、CRX、RCVRN、MATH5 在高效系中更高

第 35 天：所有系均未检测到 RPE
WT1 和 WT2：最高效形成 NR（~60-70%）
WT3 和 AMD：倾向形成 RPE 球（~40-50%）
RP：中间效率

2. 晚期分化（第 90 天）

Figure 2: 第 90 天类器官表征
图 2：第 90 天视网膜类器官包含 NR（有/无 RPE） | WT1 和 WT2 仍显示最高 NR 形成效率 | WT3 和 AMD 显示最高 RPE 形成 | 基因表达：VSX2、CRX、RCVRN、PROX1 在高效系中更高，MITF 和 RLBP1 在 RPE 倾向系中更高

3. 营养条件优化（DoE）

Figure 3: 实验设计分析
图 3：因子设计揭示细胞密度和营养可用性是关键决定因素 | 高细胞密度（12000）+ 高 KSR（15%）促进视网膜分化 | BMP4 浓度影响 RPE 形成

4. 透射电镜分析

Figure 4: 超微结构分析
图 4：光感受器含内段（IS）、连接纤毛（cc）、基底体（bb）和外段样结构（OS） | 所有 iPSC 系均观察到成熟光感受器超微结构

5. 光响应性（3Brain BioCam 4096 MEA）

平台：BioCam 4096 MEA（3Brain GmbH, Lanquart, Switzerland）
记录时间：第 150 天分化
光刺激：
- 白光脉冲（200 ms，217 μW/cm²，1 Hz）：检测到 ON 和 OFF RGC 响应
- 所有 5 个 iPSC 系均产生光响应，尽管不成熟
- 响应类似于眼睁开前新生小鼠视网膜
药理学：
- cGMP（100 μM）：模拟暗电流，激活 OFF RGC，抑制 ON RGC
- GABA（125 μM）：调节网络活动

6. 莫西沙星毒性测试

Figure 5: 毒性测试
图 5：莫西沙星处理导致光感受器特异性毒性 | LDH 释放增加 | 光感受器标记物表达下降

莫西沙星（50-1000 μg/mL，24h）处理
主要靶细胞：光感受器（与体内成年小鼠视网膜一致）
LDH 释放显著增加
光感受器标记物（RCVRN、CRX）表达下降

7. 96 孔板格式优化

Figure 6: 96 孔板格式
图 6：96 孔板格式增强 RPE 形成和神经节细胞发育 | 提高光响应性和药物筛选适用性

96 孔板格式提高 RPE 形成效率
神经节细胞发育改善
光响应性增强
适合大规模药物筛选

核心发现

发现	数据支持
iPSC 系间效率差异显著	WT1/WT2 高效，WT3/AMD 倾向 RPE
细胞密度和营养是关键	DoE 分析证实
所有系均产生光响应	3Brain 4096 MEA 记录
光响应不成熟但可检测	类似于新生小鼠视网膜
莫西沙星靶向光感受器	与体内一致
96 孔格式提高效率和可扩展性	适合药物筛选

创新点

首次系统比较 5 个 iPSC 系的视网膜分化效率 — 揭示细胞系特异性差异
DoE 方法优化培养条件 — 细胞密度和营养是关键决定因素
3Brain HD-MEA 验证所有 iPSC 系的光响应性 — 证明功能成熟度
莫西沙星毒性验证 — 视网膜类器官作为毒理学模型的可行性
96 孔板格式 — 实现大规模自动化和药物筛选

局限性

光响应仍不成熟，无法与成年视网膜相比
仅测试 5 个 iPSC 系
未进行长期培养（>150 天）

学术启示

本研究首次系统比较了不同 iPSC 系衍生视网膜类器官的效率，并使用 3Brain HD-MEA 验证了所有系的光响应性，为视网膜类器官作为药物筛选和毒理学模型提供了重要证据。

与产品的关联：

3Brain BioCam 4096 MEA 是本研究的核心工具，用于验证 5 个 iPSC 系衍生视网膜类器官的光响应性
该研究证明了 HD-MEA 在视网膜类器官功能验证中的不可替代价值
96 孔板格式为高通量药物筛选提供了可行方案

📢 一句话转发语：Stem Cells 2018：首次系统比较 5 个 iPSC 系视网膜分化效率——揭示细胞系特异性差异和营养依赖性，3Brain 4096 MEA 验证所有系均产生光响应，96 孔板格式实现大规模药物筛选。

联系人｜李东伟
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