脱细胞 ECM 多肽增强人多能干细胞衍生视网膜类器官突触标记物表达和光响应性

期刊: Stem Cell Reports, 2021, 16: 1-15
IF: ~6.0
DOI: 10.1016/j.stemcr.2021.02.015
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作者: Birthe Dorgau, Majed Felemban, Gerrit Hilgen, Martin Kiening, Darin Zerti, Nicola Claire Hunt, Mary Doherty, Phil Whitfield, Dean Hallam, Kathryn White, Yuchun Ding, Natalio Krasnogor, Jumana Al-Aama, Hani Z. Asfour, Evelyne Sernagor, Majlinda Lako

机构: 英国纽卡斯尔大学遗传医学研究所, 神经科学研究所, 沙特阿拉伯阿卜杜勒阿齐兹国王大学

核心科学问题

视网膜脱细胞 ECM 多肽能否增强人多能干细胞衍生视网膜类器官的光感受器分化、突触形成和光响应性？

研究背景：

视网膜类器官分化方案面临挑战：无法生成正确比例的视网膜细胞类型、无法建立正确突触连接、光响应性不成熟
RPE 细胞在体内分泌多种 ECM 分子（层粘连蛋白、胶原蛋白、透明质酸）维持光感受器存活和功能
组织脱细胞技术可保留天然 ECM 成分，用于干细胞分化

技术方案

脱细胞 ECM 制备

牛视网膜（NR）脱细胞：蒸馏水 → 胰蛋白酶/EDTA → Triton X-100 → 蔗糖 → 脱氧胆酸钠 → 过氧乙酸 → PBS 洗涤
牛 RPE 脱细胞：类似流程，但浓度和时间减半（更温和条件）
冻干研磨：液氮速冻 → 玻璃研钵研磨成细粉 → 胃蛋白酶消化（1 mg/mL，0.01 N HCl）
蛋白质组学分析：Thermo LTQ-Orbitrap XL LC-MSn，鉴定 ECM 成分

培养基补充

对照组：基础培养基
CM RPE：RPE 条件培养基（1:3.5 稀释）
decel NR：10 μg/mL 脱细胞视网膜 ECM
decel RPE：10 μg/mL 脱细胞 RPE ECM

表征方法

免疫荧光：视网膜细胞类型标记（VSX2、Crx、Recoverin、Rho、OPN1LW/MW、OPN1SW、PKCα、Prox1、AP2α、CRALBP、HuC/D、RBPMS）
突触标记：Bassoon、CtBP2、vGlut1、Syntaxin
透射电镜（TEM）：光感受器超微结构（内段、外段、连接纤毛、基底体）
qRT-PCR：视网膜标记基因表达
3Brain BioCam 4096 MEA：RGC 电生理记录，光响应

实验数据

1. 视网膜类器官早期分化（第 35 天）

Figure fig6
图 1：hESC 衍生类器官在所有条件下均显示 VSX2+ 祖细胞层、Crx+/Recoverin+ 光感受器、HuC/D+ 无长突/神经节细胞 | 各组间无显著差异

所有条件均形成厚层 VSX2+ 视网膜祖细胞
Recoverin+ 光感受器和 HuC/D+ 无长突/神经节细胞位于类器官中心
早期分化不受 ECM 补充影响

2. 中期分化（第 90 天）

Figure 2: 第 90 天类器官表征
图 2：类器官生长显著增加 | VSX2+ 祖细胞、Crx+/Recoverin+ 光感受器、NRL+ 视杆前体、RXRγ+ 视锥前体 | decel RPE 促进 NR+RPE 类器官形成（p < 0.01）

decel RPE 条件促进含 RPE 的视网膜类器官形成
NRL+ 视杆前体主要位于顶端，RXRγ+ 视锥前体分布更广
中期分化基本不受影响

3. 透射电镜分析（第 150 天）

Figure 3: 超微结构分析
图 3：光感受器含内段（IS）、外段（OS）、连接纤毛（cc）、基底体（bb） | 外界膜（OLM）形成 | 所有条件均观察到突触接触（箭头） | decel RPE 条件显示更多极化黑色素体

光感受器超微结构成熟：IS、OS、cc、bb
OLM 形成于光感受器 IS 基底
突触接触在所有条件下均存在
decel RPE 条件显示更多成熟 RPE 特征（极化黑色素体）

4. 晚期分化（第 150 天）- 光感受器

Figure 4: 第 150 天光感受器表征
图 4：Crx+/Recoverin+ 光感受器外层核样层（ONL）形成 | Rhodopsin+ 视杆均匀分布 | OPN1LW/MW 和 OPN1SW 视锥零星表达 | Gαt1+ 外段、ARL13B+ 连接纤毛 | CM RPE 和 decel RPE 显著增加视杆比例

关键发现：CM RPE 和 decel RPE 显著增加视杆比例（p < 0.05）
RHO 基因表达在 CM RPE 和 decel RPE 条件更高
视锥表达不受影响

5. 突触形成分析

Figure 5: 第 150 天突触标记物表达
图 5：Syntaxin+ 突触前膜位于 ONL 下方 | Bassoon 和 CtBP2 与 vGlut1 和 Recoverin 共定位，提示光感受器与双极/水平细胞形成突触 | 所有 ECM 补充条件均增加 Bassoon 和 CtBP2 中位强度

关键发现：所有 ECM 补充条件显著增加 Bassoon 和 CtBP2 中位强度（p < 0.05）
Bassoon 和 CtBP2 与 vGlut1 和 Recoverin 共定位 → 光感受器与突触后神经元形成连接
CM RPE 条件 Bassoon 斑点数量减少，但强度增加

6. 光响应性（3Brain BioCam 4096 MEA）

平台：BioCam 4096 MEA（3Brain GmbH, Lanquart, Switzerland）
记录时间：第 150 天分化
光刺激：白光脉冲（WLP，200 ms，217 μW/cm²，1 Hz）
结果：
- 所有条件下均检测到 presumed ON RGC 光响应
- decel NR 和 decel RPE 条件光响应显著增强（decel RPE vs Control: p = 0.0148；decel NR vs Control: p = 0.0009）
- CM RPE 条件响应增强但不显著
- 光响应仍较不成熟，类似于眼睁开前新生小鼠视网膜

核心发现

发现	数据支持
早期/中期分化不受影响	第 35、90 天各组无显著差异
decel RPE 促进 RPE 和视杆形成	第 150 天 RPE+ 类器官增加，视杆比例增加
ECM 补充增强突触标记物表达	Bassoon 和 CtBP2 中位强度显著增加
decel NR/RPE 增强光响应性	3Brain MEA 记录证实，p < 0.01
蛋白质组学揭示差异成分	decel NR 富含 versican，decel RPE 胶原链不同

创新点

首次将脱细胞视网膜/RPE ECM 作为培养基补充 — 促进视杆分化和突触形成
揭示 ECM 多肽在视网膜类器官功能成熟中的作用 — 突触标记物表达和光响应性增强
3Brain HD-MEA 验证功能改善 — decel NR 和 decel RPE 显著增强光响应
蛋白质组学分析 — 鉴定关键 ECM 成分（胶原、层粘连蛋白、versican、RIMS1/2）

局限性

光响应仍不成熟，无法与成年视网膜相比
未测试脱细胞 ECM 在动物模型中的免疫原性
仅使用牛源 ECM，未测试人源

学术启示

本研究首次证明脱细胞视网膜/RPE ECM 多肽可增强视网膜类器官的光感受器分化、突触形成和光响应性，为视网膜类器官功能成熟提供了新策略。

与产品的关联：

3Brain BioCam 4096 MEA 是本研究的核心工具，用于验证 ECM 补充对视网膜类器官光响应性的增强作用
该研究证明了 HD-MEA 在视网膜类器官功能验证中的不可替代价值
脱细胞 ECM 可作为视网膜类器官分化优化的新策略

📢 一句话转发语：Stem Cell Reports 2021：首次证明脱细胞视网膜/RPE ECM 多肽可增强视网膜类器官视杆分化、突触标记物表达和光响应性，3Brain 4096 MEA 记录证实 decel NR 和 decel RPE 显著增强光驱动 RGC 响应。

联系人｜李东伟
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