瞬时血管化人视网膜类器官中视网膜神经节细胞的存活与功能成熟

Retinal Ganglion Cell Survival and Functional Maturation in Transiently Vascularized Human Retinal Organoids

Kritika Sharma, Rouhollah Habibey, Mariana M. Ribeiro, Bohao Cui, Rebecca A. Siwicki, Johannes Striebel, Julia S. Pawlick, Jasmin Zorn, Larissa Utz, Magdalena Renner, Simone Picelli, Frank G. Holz, Carmen Ruiz de Almodóvar, Cameron S. Cowan, Volker Busskamp | Cell Stem Cell 2026;33(2):253–271.e13 | DOI: 10.1016/j.stem.2025.12.013
标签: #视网膜类器官 #血管化 #视网膜神经节细胞 #微流控 #MEA电生理 #光响应 #iPSC #ETV2

一、做什么 🔬

研究背景：人视网膜类器官能够模拟视网膜发育，但目前存在两个核心工程缺陷：缺乏血管样网络导致核心缺氧、凋亡增加，使最早出现的投射神经元——视网膜神经节细胞（RGCs）快速丢失；同时 RGC的轴突难以稳定延伸和长期记录，阻碍完整视网膜回路的体外研究。

核心问题：

能否把人 iPSC 来源的 ETV2.2 诱导内皮细胞整合进视网膜类器官，形成具有开放腔结构的瞬时血管样网络？
该网络能否降低类器官核心缺氧、减少凋亡、提高 RGC 长期存活率？
PDMS 微流控双腔装置能否把 RGC 轴突稳定引出，使 60 通道 MEA 可长期记录？
延长培养至第 31 周时，光感受器能否驱动 RGC 产生 ON、OFF 与 ON-OFF 三类光响应？
4% 低氧 + 氯化钴 + VEGF 刺激能否诱导新生血管表型，作为早产儿视网膜病变（ROP）研究平台？

研究模型：B7 人 iPSC 来源视网膜类器官（AMASS 协议）；B7-ETV2.2-EGFP 诱导内皮细胞；ctrl-RO（无内皮细胞）与 vRO（血管化）对照；多批次类器官、微流控-MEA 平台、单细胞/单核 RNA-seq。

技术路线：

内皮细胞前向编程：ETV2.2 + 多西环素诱导 hiPSC → CD31⁺ 内皮细胞。
C3 整合策略：第 7 天胚状体（EB）转移到预分化内皮单层上，保持早期胚状体细胞数与产率。
血管样网络验证：PECAM1/COL4A1/CLDN5/TJP1 免疫染色 + AF-598 葡聚糖被动灌注 + Image-iT Green 低氧探针 + AngioTool 量化。
RGC 存活与成熟定量：POU4F1 全装片计数 + POU4F1/SLC17A6 RT-qPCR + scRNA-seq/snRNA-seq。
轴突导向 + 长期 MEA：PDMS 双腔装置（微通道 5 μm 高 × 30 μm 宽 × 1,200 μm 长） + Multi Channel Systems 60 通道 MEA2100-Lite（32 kHz）。
回路功能验证：POU4F1-f-ChRimson-EYFP 光遗传刺激 + 第 31 周 470/580 nm 光刺激。

二、发现什么 📊

核心发现 1：C3 策略在不破坏早期发育的前提下建立瞬时血管样网络

图1：C3 方案 + PECAM1⁺ 网络形态重塑（原文 Figure 1）

图1：第 7 天把 EB 转移到预分化的 ETV2.2 内皮单层上形成 vRO；PECAM1⁺ 网络在 W4–W22 呈现"船型 → 放射型"动态重塑。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 比较 C1、C2、C3 三种内皮整合方式；选 C3 方案把第 7 天 EB 放在预分化 EC 单层上启动 3D 培养。 |
| 发现什么 | 第 3 周 72.6% EB 整合 PECAM1⁺ 细胞；刮取形成 3D 类器官后，79.21% vRO 含 PECAM1⁺ 结构。网络同时表达 COL4A1、CLDN5、TJP1 和 COL4A1 基质标志，PDGFRB 仅偶尔出现。第 10 周平均结构长度 74.22 ± 5.85 μm，之后缩短并保持相对稳定。 |
| 说明什么 | C3 把血管化步骤放在 EB 形成之后，避免改变起始细胞数与类器官产率；血管样结构在静态培养下会从"船型"转为"放射型"——暗示这是网络改造（remodeling）而非稳定血管。 |

核心发现 2：血管样腔结构降低缺氧、减少凋亡并扩大类器官

图2：血管样腔开放性 + 低氧信号 + 类器官直径 + Annexin V 凋亡（原文 Figure 2）

图2：第 16 周 AF-598 葡聚糖被动灌注进入 41.3% ± 4.19% PECAM1⁺ 腔；第 15 周 vRO 低氧荧光显著低于 ctrl-RO；Annexin V 早期凋亡细胞从 W12 起减少。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第 16 周 AF-598 葡聚糖被动灌注检测 PECAM1⁺ 腔开放性；Image-iT Green 探针比较 W15 缺氧；持续测量直径；Annexin V 流式定量早期凋亡。 |
| 发现什么 | 第 16 周 41.3% ± 4.19% PECAM1⁺ 腔被葡聚糖标记，提示腔与培养液存在开放连接；W15 vRO 低氧荧光显著降低；各测试时间点 vRO 最小直径更大；W12 起 Annexin V⁺ 早期凋亡细胞显著减少（n=30 ctrl-RO，n=32 vRO，N=2 batches）。 |
| 说明什么 | 血管样网络至少提供"培养液可接近的腔样通路"和更好的核心氧环境，但作者没有证明连续流体灌流——这是"血管样"而非真正血管。 |

核心发现 3：RGC 保存率从严重丢失转为可持续检测

图3：POU4F1⁺ RGC 数量与 RGC 标志物随时间变化（原文 Figure 3）

图3：第 18 周 ctrl-RO 中 POU4F1⁺ 细胞仅 1.21% ± 0.20%，vRO 提升到 18.2% ± 4.31%（p<0.001）；POU4F1 与 SLC17A6 RT-qPCR 显示 vRO 持续维持。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | W12 与 W18 全装片定量 POU4F1⁺ 细胞；RT-qPCR 跟踪 POU4F1 与 SLC17A6；额外 RGC 标志物 POU6F2 与 RBPMS 免疫染色。 |
| 发现什么 | 第 18 周 ctrl-RO POU4F1⁺ = 1.21% ± 0.20%，vRO = 18.2% ± 4.31%，p<0.001 vs ctrl；W12 也显著更高；POU6F2 与 RBPMS 阳性细胞在 vRO 中可见，但 OPN4 阳性细胞未检出——与人类 RGC中本征光敏 RGC 极少的现状一致。 |
| 说明什么 | 血管样支持显著延长 RGC 可检测窗口，使后续电生理和光回路研究成为可能；但 POU4F1 并非 RGC 绝对特异，作者明确要求结合转录组、解剖、光遗传和后期光响应共同判断 RGC 身份。 |

核心发现 4：血管化提高 RGC 发育成熟度但未重写整个视网膜细胞谱系

图4：第 18 周单核/单细胞转录组细胞图谱 + RGC 谱系比例（原文 Figure 4）

图4：vRO 与 ctrl-RO 总体细胞类型构成相近；vRO 中 RGC 谱系预测成熟度 52% vs ctrl-RO 36%；vRO-A 细胞比例与 RGC 比例呈 Spearman rs=0.89、p=0.007。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第 18 周 ctrl-RO 与 vRO 单核/单细胞 RNA-seq，构建视网膜细胞类型图谱，进行发育年龄、伪时间与 RGC 谱系分析；每样本合并 5 个类器官；RGC 伪时间分析 n=20 RO/组。 |
| 发现什么 | 总体细胞类型构成相近；vRO 中 RGC 谱系预测成熟度 52%，ctrl-RO 36%；vRO-A 细胞比例与 RGC 比例 Spearman rs=0.89, p=0.007；第 18 周转录组未捕获明确 PECAM1⁺ 内皮细胞簇——PECAM1 蛋白仍可见，组织学与转录组不一致。 |
| 说明什么 | 主要收益不是把视网膜"变成另一种组织"，而是改善 RGC 存活/成熟；同时单细胞捕获偏差提醒后续实验需用单核 + 单细胞双轨取证。 |

核心发现 5：微流控轴突导向 + MEA 把 RGC 功能检测延长到对照组失活之后

图5：PDMS 双腔微通道 + 60 通道 MEA 自发及光遗传诱发 RGC 活动（原文 Figure 5）

图5：第 17–23 周 vRO 自发动作电位频率与配对相关性持续高于 ctrl-RO；W25 后 ctrl-RO 失活而 vRO 仍可记录；微通道成功把 RGC 轴突稳定引到 MEA 电极。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第 15 周 RO 接入 PDMS 双腔微流控装置 + 60 通道 MEA 芯片；ctrl-RO N=5 MEAs，vRO N=4 MEAs；记录自发活动 + POU4F1 启动子驱动的 f-ChRimson-EYFP 光遗传刺激。 |
| 发现什么 | 两组轴突均在 1 周内进入微通道、最终延伸超过 2 mm；W17 vRO 自发动作电位频率已高于 ctrl；W20/W23 差距扩大；vRO 配对相关性更强、网络爆发振幅更高；W25 后 ctrl-RO 不再有自发或光遗传诱发活动，vRO 仍可记录；CBX 缝隙连接阻断剂抑制网络爆发振幅与同步性，提示网络同步部分由缝隙连接介导。 |
| 说明什么 | 关键不是"MEA 记录"本身，而是把血管样支持与轴突物理导向绑定——同时解决 RGC 深埋、轴突难接触、长期记录困难三个瓶颈。 |

核心发现 6：第 31 周出现光感受器驱动的 ON、OFF、ON-OFF 回路响应

图6：第 31 周 470/580 nm 光刺激下 ON、OFF、ON-OFF 三类 RGC 的 PSTH 响应（原文 Figure 6）

图6：W31 仅保留 vRO-MEA；ON-OFF 在 470/580 nm PSTH 振幅分别 >237/>281 Hz；ON/OFF 保真度 >90% / 72–53%；ON-OFF 为响应细胞中最大类群。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第 31 周只保留 vRO-MEA，用 470 nm 与 580 nm 光刺激，依据光开/关期间放电曲线分类 ON、OFF、ON-OFF；每波长 N=3 MEAs。 |
| 发现什么 | ON-OFF 在 470/580 nm PSTH 振幅分别 >237/>281 Hz；ON 69/110 Hz；OFF 38/53 Hz；ON 峰值延迟 36/20 ms，OFF 187/130 ms；ON 与 ON-OFF 保真度 >90%，OFF 470 nm 下 72%、580 nm 下 53%；ON-OFF 是响应细胞中最大类群。 |
| 说明什么 | 体系从"光遗传刺激能激活 RGC"推进到"内源性光感受器能驱动下游 RGC"，证明垂直视网膜信号通路在体外形成；但仍需突触阻断、去除光遗传工具、opsin/外节形态学和更复杂光刺激做正交验证。 |

核心发现 7：低氧刺激诱导类视网膜新生血管表型

图7：第 12 周 4% O₂ + 100 μM 氯化钴 + 100 ng/mL VEGF 处理 5 天的血管样网络（原文 Figure 7）

图7：低氧 vRO 血管样面积与平均结构长度增加、PECAM1/vWF mRNA 上调；锥体 ARR3 与视杆 RHO 在低氧 vRO 中升高；可作为 ROP 类疾病的体外测试平台。

| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第 12 周 ctrl-RO 与 vRO 在 4% O₂ + 100 μM CoCl₂ + 100 ng/mL VEGF 处理 5 天，与约 21% O₂ 对照比较。 |
| 发现什么 | 低氧 vRO 血管样面积与平均结构长度显著增加；PECAM1 与 vWF mRNA 上调；RGC 标志物 SLC17A6 无显著变化，但锥体 ARR3 与视杆 RHO 显著高于低氧 ctrl-RO。 |
| 说明什么 | 体系可作为 ROP 等新生血管疾病的体外测试平台，但仅模拟短期低氧 + 钴 + VEGF 刺激，不等同于完整 ROP 病理。 |

三、说明什么 💡

这篇论文真正推进了什么

这篇论文解决的不是"能不能做视网膜类器官"，而是类器官长期培养中最致命的两个工程问题：RGC 先死亡和轴突无法稳定引出和记录。作者用两个互补工程模块应对：内皮细胞形成的瞬时血管样网络改善核心氧环境，PDMS 微流控通道把轴突限制到可记录路径。两者共同把功能验证推进到第 31 周，最终看到内源性光感受器驱动的三类 RGC 光响应。

重要边界

血管样网络是静态培养下的"腔样通路"，会随时间回缩——作者明确写"防止血管回缩是未来重要挑战"。
第 18 周 scRNA-seq 未捕获明确内皮细胞簇，组织学 PECAM1 蛋白仍可见——单细胞取样偏差提醒结论需谨慎。
POU4F1 不是 RGC 绝对特异标志，作者用多种证据补强，但仍建议更多正交验证（突触阻断、去光遗传工具、opsin/外节形态学）。
低氧新生血管模型只处理 5 天，仅是低氧-促血管生成急性刺激，不等同于完整 ROP 病理。
仅用 60 通道标准 MEA（Multi Channel Systems MEA2100-Lite），不是高密度覆盖。

方法论遗产与可迁移方向

这篇论文给类器官长期培养研究留下的核心方法是 **"瞬时血管样 + 轴突导向 + 长期电生理"**三模块范式——血管化把 RGC 存活窗口从 W18 延到 W25+；微流控让轴突被稳定引到 MEA；MEA 把功能读出推到第 31 周并看到 ON/OFF/ON-OFF 响应。

基于作者自陈局限与论文方法的可迁移性，下一步可探索的方向：

防止血管样网络在静态培养下回缩——是所有需要长期血管化的类器官模型（脑、肝、胰岛等）的共性问题。
在不破坏视网膜分层结构的前提下用更高密度电生理同步记录多区域——本研究 60 通道 MEA 仍属"中密度"覆盖。
在多类器官类型（脑、心肌、胰岛）中验证"血管化 + 轴突导向 + MEA"三模块范式是否可移植——本论文的工程方案为多类器官的长期功能验证提供了统一模板。

与可应用的产品/平台

产品/平台	关联度	论文中可对应的真实证据	应用场景	证据边界
3Brain HD-MEA	⭐⭐⭐⭐	论文核心方法 = PDMS 微流控双腔装置 + 60 通道 MEA（Multi Channel Systems MEA2100-Lite）记录 W17–W31 RGC 活动	在视网膜类器官长期成熟过程中做高密度自发放电、网络同步和光刺激响应追踪；尤其适合比较血管化与对照组的功能轨迹	论文未使用 3Brain HD-MEA，但 MEA2100-Lite 与 3Brain HD-MEA 同属电生理记录技术，技术路线可直接迁移
CelVivo ClinoStar	⭐⭐⭐	论文在静态 3D 培养 + Matrigel 中观察血管样网络会随时间回缩（作者明确列为局限）	用低剪切旋转式三维培养减少静态培养对血管样结构的破坏，延长血管化类器官的稳定时间	论文未使用旋转培养设备；ClinoStar 是否能稳定血管化网络仍需实验验证

参考文献

Sharma K, Habibey R, Ribeiro MM, et al. Retinal ganglion cell survival and functional maturation in transiently vascularized human retinal organoids. Cell Stem Cell. 2026;33:253–271.e13. DOI: 10.1016/j.stem.2025.12.013
Cowan CS, Renner M, De Gennaro M, et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 2020. DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.013.
Cakir B, Xiang Y, Tanaka Y, et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 2019;16:1169–1175. DOI: 10.1038/s41592-019-0586-5.
Homan KA, Gupta N, Kroll KT, et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 2019;16:255–262. DOI: 10.1038/s41592-018-0293-6.
Habibey R. Incubator-independent perfusion system integrated with microfluidic device for continuous electrophysiology and microscopy readouts. Biofabrication. 2023;15:024102. DOI: 10.1088/1758-5090/acb466.

转发语：Cell Stem Cell 重磅！团队用瞬时血管样支持和微流控轴突导向，把人视网膜类器官的 RGC 功能维持推进到第 31 周，并首次在该体系中清晰记录到 ON、OFF、ON-OFF 三类光响应。🧠⚡

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