移植的人类纹状体祖细胞在亨廷顿病动物模型中的功能性整合
Scaramuzza L, Ribodino M, Casarino C, Morrocchi M, Gómez-González GB, Parolisi R, Sozzi E, Turini G, Cellato V, Conforti P, Hoxha E, Toniato R, Galeotti G, Cordiglieri C, Crosti MC, Zucca S, Lorenzati M, Bovetti S, Spaiardi P, De Sperati C, Biella G, Ottoboni L, Palma M, Maestri S, Besusso D, Cattaneo E, Buffo A | Pharmacological Research 2025 | DOI: 10.1016/j.phrs.2025.107905
一、做什么 🔬
核心科学问题
亨廷顿病（HD）的核心病理是纹状体中 GABA 能中型多棘神经元（MSN） 的进行性丢失。这类神经元占人类纹状体神经元的 90% 以上，是基底神经节运动控制回路的"枢纽"。现有的基因靶向疗法（ASO、RNAi、CRISPR）虽然能降低突变 HTT 蛋白水平，但无法修复疾病晚期已死亡的神经元——就像"关掉破坏因子，但没重建被破坏的房子"。
本研究尝试用人类胚胎干细胞分化的纹状体祖细胞（hSPs） 进行细胞替代治疗，回答两个关键问题：
- 移植的细胞能不能在宿主体内变成正确的神经元类型？
- 它们能不能真正"接通"大脑电路，影响行为？
实验设计
| 要素 | 方案 |
|---|---|
| 细胞来源 | H9 人胚胎干细胞，经 SHH + DKK-1 诱导分化为纹状体祖细胞（DIV15 移植） |
| 动物模型 | 无胸腺裸鼠，喹啉酸（QA）单侧纹状体损伤 |
| 移植量 | 4×10⁵ 细胞/只，双侧立体定位注射 |
| 检测技术 | snRNA-seq（17,679 个人类细胞核）、免疫组化、病毒示踪、光纤光度法、化学遗传学（Bi-DREADD）、3Brain MEA |
| 观察时间 | 移植后 2 个月（2MPT）至 10 个月（10MPT） |
二、发现什么 📊
发现 1：移植细胞精准分化为 6 种纹状体神经元亚型
图 1 | snRNA-seq UMAP 聚类显示移植细胞分化为 D1/D2 MSN、MGE/CGE 中间神经元和星形胶质细胞
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 移植后 6 个月（6MPT），从 4 只大鼠的移植物核心分离细胞核，进行单核 RNA 测序（snRNA-seq）。共测序 34,874 个细胞核，其中 17,679 个鉴定为人类来源。使用 Louvain 算法聚类，通过已知标记基因手动注释细胞类型 |
| 发现什么 | 移植细胞分化为 6 种主要类型：① D1-MSN（21.47%，纹状体直接通路）、② D2-MSN 前体（6.38%，间接通路）、③ MGE 中间神经元（33.24%，含 LAMP5+ 亚群）、④ CGE 中间神经元（8.88%）、⑤ 星形胶质细胞（69% 非神经元群体，含 6 个亚群）、⑥ 未成熟祖细胞。标签转移分析证实 D1/D2-MSN 与成年小鼠纹状体空间定位一致 |
| 说明什么 | 这是首次在 HD QA 模型中对移植 hSPs 进行大规模 snRNA-seq（vs 之前研究仅 ~200 个细胞）。证明 LGE 模式化方案产生的祖细胞在体内能重现腹侧端脑发育轨迹，不仅生成经典 MSN，还产生中间神经元和区域特异性星形胶质细胞。细胞异质性可能反映 LGE/MGE 命运特化时间窗口的重叠 |
发现 2：移植神经元在体内持续成熟，GABA 能表型随时间增强
图 2 | 免疫组化显示移植细胞表达 CTIP2/GABA/DARPP32，且从 2MPT 到 6MPT 胶质细胞比例上升
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在 2MPT 和 6MPT 两个时间点对移植核心区进行免疫组化分析，定量 CTIP2（神经元标记）、GABA（抑制性神经递质）、DARPP32（MSN 特异性标记）、SOX9（星形胶质细胞标记）在 HuNu+ 人类细胞中的表达比例 |
| 发现什么 | ① 56.0 ± 3.2% 的移植细胞表达 CTIP2；② 其中 80.1 ± 8.1% 共表达 GABA；③ 15.9 ± 5.4% 为 CTIP2/GABA/DARPP32 三重阳性（成熟 MSN 标志）；④ SubP+（直接通路）和 pENK+（间接通路）细胞均存在；⑤ 从 2MPT 到 6MPT，SOX9+ 胶质细胞从 10.1% 增至 32.9%（3 倍增长），同时 GABA+ 神经元增加 3 倍，CTIP2+ 减少 1/3 |
| 说明什么 | 移植细胞不仅在转录组层面正确分化，在蛋白质水平也验证了纹状体身份。从 2MPT 到 6MPT 的变化揭示了一个关键发育事件——神经源性向胶质源性转换，这与人类妊娠约 15 周时的基底神经节发育时间窗一致，但在体外分化中未被完全捕获。说明宿主环境对移植物成熟至关重要 |
发现 3：移植物与宿主建立双向解剖连接
图 3 | 逆行病毒示踪显示宿主皮层/丘脑输入，hNCAM 染色显示移植物轴突投射至 GP/SN
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用改良狂犬病病毒（ΔG-RV）进行逆行单突触追踪，标记与移植细胞形成突触连接的宿主神经元。同时用 hNCAM 抗体染色标记移植物来源的轴突投射，量化在 2MPT 和 6MPT 时轴突到达的宿主脑区 |
| 发现什么 | 输入：宿主传入神经元主要位于同侧运动皮层（43.2 ± 8.9%，其中 81% 在深层 V-VI 层）和丘脑（56.8 ± 8.87%）。光片显微镜 3D 成像还揭示了黑质（SN）、苍白球（GP）和腹侧被盖区（VTA）的输入。输出：移植物轴突投射至 SN（21.6-26.8%）、GP（22.9-35.3%）、STN（2MPT 24.7% → 6MPT 1.8% 精细化）、VM（8.9-13.2%）。内囊（IC）轴突密度从 5.2% 增至 39.6%，说明轴突沿白质束定向生长 |
| 说明什么 | 移植物不仅"活下来"，还与宿主建立了正确的解剖连接——接收来自皮层和丘脑的输入（与内源性纹状体一致），并向直接通路（SN）和间接通路（GP）的靶区投射。STN 投射减少 + IC 密度增加表明移植物轴突经历了发育精细化过程，修剪了错误连接，加强了正确通路 |
发现 4：光纤光度法首次证明移植物具有功能性钙活动
图 4 | jGCaMP7f 移植体在清醒状态下显示自发钙瞬变，对足底电击（FSK）产生特异性响应
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在移植了表达 jGCaMP7f 钙指示剂的 hSPs 的大鼠脑中植入光极，使用 TCSPC（时间相关单光子计数）系统记录 6-10MPT 期间的钙信号。比较清醒自由活动（AW）和麻醉（AN）状态下的信号差异，并施加足底电击（FSK）测试移植物对感觉刺激的响应 |
| 发现什么 | ① 2/3 只 jGCaMP7f 大鼠显示持续振荡钙活动，最大平均振幅 10.6 ± 0.14 AU，频率 5.92 ± 0.42 次/分钟；② 麻醉后振幅显著降至 1.31 ± 0.03，频率降至 4.83 ± 0.15；③ FSK 刺激后 jGCaMP7f 移植体出现特异性钙响应（刺激锁定 vs 随机对齐，p < 0.001），而 GFP 对照组无响应；④ 活动持续超过 4 个月（6-10MPT） |
| 说明什么 | 这是首次在 HD 模型中用光纤光度法直接证明移植神经元具有自发性功能活动和对生理感觉输入的响应能力。麻醉后信号减弱排除了运动伪影的可能，FSK 响应证明移植物已整合入宿主感觉-运动回路，能接收和处理内源性突触输入 |
发现 5：化学遗传学调控移植物活动可影响运动行为
图 5 | Bi-DREADD 系统在体外和离体 MEA 上实现双向化学遗传调控，CNO 激活/SALB 抑制神经元放电
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 构建稳定表达 Bi-DREADD（hM3Dq 激活受体 + KORD 抑制受体）的 H9 hESC 克隆系，分化为 hSPs 后移植至 QA 损伤大鼠。离体脑切片用 3Brain MEA 记录，依次灌注 DA（20μM）、CNO（10μM）、SALB（20μM），检测放电频率、爆发活动、网络互相关性 |
| 发现什么 | ① DA 灌注显著增加平均放电频率、爆发次数和电流幅度，证明移植神经元具有多巴胺能反应性；② CNO 增强放电参数，SALB 降低放电活动，实现双向调控；③ CNO 和 DA 均使网络互相关性较基线提升，表明成熟网络活动；④ 相同配体在移植物外区域无效应，证明反应源自移植细胞 |
| 说明什么 | 移植神经元不仅存活和连接，还获得了神经递质敏感性（多巴胺反应）和可调控性（化学遗传双向操控）。MEA 数据与光纤光度法互为印证，从离体和在体两个层面证实了移植物功能整合 |
发现 6：移植物活动调控影响自主运动和精细运动协调
图 6 | 化学遗传学调控 Bi-DREADD 移植物影响开放场运动速度和理毛行为精确度
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在 8MPT 时对移植动物进行化学遗传学行为学测试：开放场测试（70×70cm，记录 30 分钟平均速度）和玻璃圆柱理毛测试（20 分钟，手动注释正确/错误理毛序列）。比较基线、CNO（3mg/kg）和 SALB（10mg/kg）给药后的行为差异，以仅 QA 损伤组为对照 |
| 发现什么 | ① CNO 和 SALB 均显著降低移植动物的开放场平均速度（p < 0.001），而 QA-only 对照组对配体无反应；② SALB 显著增加错误理毛序列比例（p < 0.01），表明移植物沉默后精细运动协调受损；③ CNO 增加正确理毛序列数量（未达统计学显著性）；④ 基线状态下移植组与 QA-only 组无显著差异 |
| 说明什么 | 首次在 HD 模型中证明移植物活动调控能影响纹状体依赖性行为。CNO 和 SALB 均降低速度但机制不同——CNO 通过共同激活 D1/D2 通路，SALB 通过沉默移植物。基线无改善说明 hSPs 目前的连接性和成熟度还不足以自发恢复功能，需要优化分化方案或联合其他治疗策略 |
三、说明什么 💡
对领域的意义
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| 大规模 snRNA-seq 揭示移植物细胞多样性 | 突破了之前研究仅分析 ~200 个细胞的分辨率限制，为评估移植物保真度提供了金标准 |
| 神经源性→胶质源性转换 | 证明宿主环境能驱动体外未完成的发育轨迹，提示分化方案需要模拟更完整的发育时间窗 |
| 双向解剖连接 + 光纤光度法功能验证 | 首次在 HD 模型中实现"结构-功能-行为"三位一体的移植物评估 |
| 化学遗传学行为调控 | 证明移植物不是"被动存活"，而是能主动参与宿主回路活动调节 |
局限与未来方向
- QA 模型的局限：不能重现 HD 的渐进性退行、复杂炎症环境和 mHTT 蛋白影响
- 行为改善未达显著：单纯 hSP 移植在测试中未产生统计学显著的功能恢复，提示需要优化细胞产品（如增强 MSN 纯度、减少胶质细胞比例）
- 迁移细胞的未知影响：迁移至皮层等非纹状体区域的神经元可能干扰正常网络动态
- 样本量限制：光纤光度和 MEA 实验动物数量有限（n=3-6），需扩大验证
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain MEA | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文 Figure 5 直接使用 3Brain BioCAM DupleX + CorePlate MEA 记录离体脑切片移植物放电活动，验证化学遗传学调控效果 |
| 光纤光度系统 | ⭐⭐⭐⭐ | 论文 Figure 4 使用 TCSPC 光纤光度法记录在体钙信号，是验证移植物功能整合的核心技术 |
| 共聚焦显微镜 | ⭐⭐⭐ | 免疫组化和病毒示踪成像依赖高端共聚焦（论文使用 Zeiss LSM980 + Axio Observer） |
| 单细胞测序平台 | ⭐⭐⭐ | snRNA-seq 使用 10X Genomics Chromium + Illumina NovaSeq，是移植物细胞身份鉴定的金标准 |
| 立体定位注射系统 | ⭐⭐ | QA 损伤和细胞移植均需精密立体定位仪 |
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参考文献
- Scaramuzza L, Ribodino M, et al. Transplanted human striatal progenitors exhibit functional integration and modulate host circuitry in a Huntington's disease animal model. Pharmacological Research. 2025;219:107905. DOI: 10.1016/j.phrs.2025.107905
- Conforti P, Bocchi VD, et al. In vitro induction of medium spiny neurons recapitulates human striatal development and complexity at single-cell resolution. Cell Rep Methods. 2022;2(12):100367.
- Besusso D, Schellino R, et al. Stem cell-derived human striatal progenitors transplanted to a Huntington's disease rat model innervate striatal targets and ameliorate sensorimotor deficits. Stem Cell Rep. 2020;14(5):876-891.
- Siletti K, Hodge R, et al. Transcriptomic diversity of cell types in the adult human brain. Science. 2023;382(6667):eadd7046.
转发语：亨廷顿病干细胞治疗里程碑！米兰大学团队用 snRNA-seq + 光纤光度法 + 化学遗传学三位一体证明：人胚胎干细胞分化的纹状体祖细胞移植后不仅能活下来、变成正确的神经元类型，还能接通大脑电路、影响运动行为。这是向临床转化迈出的关键一步。
联系人：李东伟
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