整合功能性血管化类器官芯片的微流控平台
A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip
Clément Quintard et al. | Nature Communications 2024 | DOI: 10.1038/s41467-024-45710-4
标签: #类器官芯片 #血管化 #微流控 #灌注培养 #类器官成熟 #药物筛选 #3D细胞培养 #器官芯片
一、做什么 🔬
研究背景：
传统类器官培养体系缺乏功能性血管网络，导致氧气和营养物质渗透受限、类器官内部出现坏死核心、成熟度不足，且无法模拟体内药物灌注和循环动力学。当前血管化类器官方案主要存在三个瓶颈：一是内皮网络往往是"空心管道"而非功能性血管；二是缺乏可灌注的流体剪切力刺激；三是难以实现血管网络与实质类器官的功能性吻合（anastomosis）。
核心问题：
- 能否在微流控芯片中同时实现血管网络生成 + 类器官培养 + 可控灌注？
- 血管网络能否与干细胞来源的血管类器官（BVO）形成功能性吻合？
- 灌注和血管化能否显著提升类器官的生长、成熟和功能？
- 该平台能否推广到不同类型类器官（如血管类器官、胰岛类器官）？
研究模型：
- 血管类器官（BVO, Blood Vessel Organoids）：人多能干细胞（hPSC）经中胚层诱导分化生成的三维血管类器官，包含内皮细胞和周细胞
- 间充质球（Mesenchymal Spheroids）：脂肪来源干细胞/间充质干细胞形成的球体，作为血管新生的支架
- 胰岛球（Pancreatic Islet Spheroids）：EndoC-βH1 细胞形成的胰岛样球体，用于验证功能增强
- HUVEC 内皮细胞：人脐静脉内皮细胞，用于构建预成型内皮床
- 微流控芯片：蛇形通道设计（SERPENTIN 芯片），双入口灌注系统
技术路线：
- 微流控芯片设计与制造：软光刻 + PDMS 浇注，蛇形通道实现均匀剪切力分布
- 间充质球血管化：ADSC 球 + HUVEC 共培养，诱导出芽式血管生成
- BVO 分化与芯片接种：hPSC → 中胚层诱导 → BVO 形成 → 芯片内共培养
- 灌注培养系统：注射泵驱动双入口流动，模拟体内剪切应力（0.2-0.5 dyn/cm²）
- 功能性验证：荧光葡聚糖灌注检验血管通透性、钙成像检验内皮细胞功能、胰岛素分泌检验胰岛功能
- 多组学表征：转录组测序（RNA-seq） + 免疫荧光染色 + 共聚焦 3D 重建
二、发现什么 📊
核心发现 1：蛇形微流控芯片实现均匀灌注与多类器官共培养
图 1 | 8 个 panel 展示微流控芯片的计算机辅助设计、实物照片、蛇形通道尺寸参数、3D 通道结构、以及不同细胞/类器官配置的工作模式示意图。芯片采用双入口 Qa/Qb 设计，主通道尺寸 700×500×150×90 μm（宽/高/蛇形弧半径/直段长），流速 0.22 mL/min 时剪切应力约 0.1-0.5 dyn/cm²，匹配体内微血管生理范围。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 设计并制造了一种蛇形（serpentine）微流控芯片（命名 SERPENTIN 300 v2.1），采用 PDMS 软光刻工艺，包含连续弯曲的单通道。验证了通道内流速分布、剪切应力均匀性、以及不同接种配置（细胞悬浮、间充质球、BVO、胰岛球）的可行性。 |
| 发现什么 | 蛇形通道在 0.22 mL/min 流速下产生 0.1–0.5 dyn/cm² 的剪切应力，与体内微血管生理剪切应力范围匹配。芯片支持至少 4 种不同的类器官/细胞配置：间充质球血管化、BVO 单独培养、BVO + HUVEC 共培养、胰岛球共培养。通道内细胞/类器官分布均匀，无堵塞或沉积问题。 |
| 说明什么 | 该芯片设计解决了传统直通道剪切应力不均、类器官易堵塞的问题，为后续所有血管化和功能实验提供了可靠的物理平台。蛇形通道的均匀剪切力分布是实现长期（30 天以上）灌注培养的关键基础。 |
核心发现 2：间充质球在流动条件下通过出芽方式生成吻合内皮网络
*图 2 | 15 个 panel 展示间充质干细胞球（ADSC spheroid）在静态与流动条件下的血管新生/出芽表型差异。含绿色（CD31 内皮细胞）/红色（α-SMA 周细胞）荧光显微图、3D 网络重建、以及血管出芽长度、分叉点、网络总长度等定量统计（**p<0.001，流动组显著高于静态组）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将脂肪来源干细胞（ADSC）形成的间充质球（mesenchymal spheroid）与 HUVEC 内皮细胞共培养，对比静态培养 vs 流动灌注（0.22 mL/min）条件下的血管出芽情况。在第 3、7、14 天用 CD31（内皮标记）和 α-SMA（周细胞标记）免疫荧光染色，结合共聚焦成像和 3D 重建定量分析血管网络形态。 |
| 发现什么 | 流动条件下，间充质球周围的 HUVEC 出芽长度增加约 3.2 倍（p<0.001），分叉点数量增加 2.8 倍，血管网络总长度增加 3.5 倍。流动组的内皮网络形成了相互连接的吻合（anastomosis）结构，而静态组只有稀疏的短管。流动组中 α-SMA+ 周细胞覆盖率也显著升高，提示血管成熟度更好。 |
| 说明什么 | 流体剪切应力是血管新生和网络成熟的关键物理刺激。间充质球不仅提供结构支撑，还通过旁分泌信号（如 VEGF、FGF）诱导内皮出芽，而流动进一步强化了这一过程。这一发现为后续 BVO 血管化提供了"流动诱导血管成熟"的理论依据。 |
核心发现 3：干细胞来源血管类器官（BVO）在芯片内实现三维血管网络分化
图 3 | 20 个 panel 系统展示 BVO 的 15 天分化诱导全流程：胚胎体生成（第 0 天）、中胚层诱导（第 2-4 天）、血管谱系特化（第 4-7 天）、网络形成与成熟（第 7-15 天）。含明场照片（不同分化阶段形态）、CD31/PECAM1 荧光染色（绿色内皮网络）、以及网络长度、节点数、管径等 5 个定量指标的时间曲线。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 从人多能干细胞（hPSC）诱导分化生成血管类器官（BVO），遵循胚胎体 → 中胚层诱导 → 血管内皮诱导 → 网络成熟的 4 步方案。将第 15 天的 BVO 接种到微流控芯片中，在流动条件下继续培养，观察其在芯片微环境中的血管网络形成和成熟情况。对比静态培养与流动灌注的差异。 |
| 发现什么 | BVO 在 15 天分化过程中逐步形成复杂的三维血管网络，CD31+ 内皮细胞形成相互连接的管腔结构，周细胞（PDGFRβ+）包裹在内皮管外侧。接种到芯片后，流动条件下 BVO 的血管网络密度增加约 40%，网络节点数增加 35%，且血管管径分布更均匀（10-30 μm 范围内）。转录组分析显示流动组上调了血管发育、细胞外基质重塑、机械转导相关基因。 |
| 说明什么 | 干细胞来源的 BVO 具有强大的血管生成潜能，在微流控灌注环境中能进一步成熟和扩展。流动不仅增加了血管密度，还通过机械转导通路（YAP/TAZ、Integrin、PI3K/Akt）调控血管基因表达谱，使 BVO 的血管表型更接近体内真实微血管。 |
核心发现 4：BVO 与 HUVEC 内皮床之间形成功能性灌注血管网络
图 4 | 11 个 panel 展示 HUVEC 预成型内皮网络包裹 BVO 的 3D 共聚焦成像（绿色 CD31、红色 α-SMA、蓝色 DAPI）、3D 体渲染图、芯片装置示意图、以及 30 天培养期间血管网络长度的定量增长曲线（从第 3 天到第 30 天持续增长，约 2.5 倍）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在芯片中先让 HUVEC 形成预成型内皮床（endothelial bed），再加入 BVO 共培养，观察两者之间是否形成吻合连接。用 4 kDa 和 70 kDa 荧光葡聚糖灌注实验检验血管网络的功能性和通透性。在长达 30 天的培养周期中追踪血管网络的形态变化和稳定性。 |
| 发现什么 | HUVEC 内皮网络与 BVO 来源的血管网络之间形成了广泛的吻合连接（anastomosis），形成了一个连续的、可灌注的三维血管系统。4 kDa 荧光葡聚糖可以在整个血管网络中自由流动，证明血管管腔是开放且连通的。70 kDa 葡聚糖的渗漏实验显示血管通透性处于生理范围内（白蛋白级别的分子部分透过，符合微血管特性）。该血管网络在 30 天灌注培养中保持稳定，甚至持续生长。 |
| 说明什么 | 这是本研究的核心技术突破：首次在微流控芯片中实现了干细胞来源血管类器官与内皮细胞床的功能性吻合。可灌注的血管网络解决了传统类器官培养中"营养渗透受限、内部坏死"的核心瓶颈，为长期培养和高生理相关性的药物筛选提供了可能性。 |
核心发现 5：BVO 与内皮床的吻合具有功能完整性（屏障功能 + 响应性）
图 5 | 约 30 个 panel 全面表征 BVO 与 HUVEC 内皮床吻合后的功能性：荧光葡聚糖灌注检验血管通透性和完整性、钙成像（Fluo-4）检验内皮细胞对激动剂（如 ATP、组胺）的钙响应、VEGF 刺激后的血管出芽响应、以及多种内皮功能标记物（VE-cadherin、eNOS、PECAM1）的免疫荧光染色。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 通过多种功能实验系统验证吻合血管网络的生理功能完整性：（1）4 kDa / 70 kDa / 500 kDa 不同分子量葡聚糖灌注评估血管屏障功能；（2）Fluo-4 钙成像检测内皮细胞对 ATP、组胺、凝血酶等血管活性物质的钙瞬变响应；（3）VEGF 刺激评估血管出芽和重塑能力；（4）Western blot 和免疫荧光检验内皮功能蛋白（eNOS、VE-cadherin、ZO-1）的表达。 |
| 发现什么 | 吻合血管网络具有尺寸选择性的屏障功能：4 kDa 葡聚糖快速通过，70 kDa 部分透过，500 kDa 基本不透过（与体内微血管屏障特性一致）。内皮细胞对 ATP 和组胺产生快速、可逆的钙瞬变响应（响应时间 < 5 秒，恢复时间 < 30 秒），表达功能性 eNOS 和 VE-cadherin 粘附连接。VEGF 刺激 24 小时后可见明显的血管出芽和网络重塑现象。 |
| 说明什么 | 芯片中的血管网络不仅形态上"像"血管，功能上也模拟了体内微血管的关键特性：尺寸选择性屏障、血管活性物质响应性、重塑能力。这意味着该平台可以用于研究药物对血管通透性的影响、血管毒性评估、以及血管重塑相关疾病的建模。 |
核心发现 6：流动和血管化协同增强类器官的生长与成熟
图 6 | 多 panel 展示流动和血管化对类器官生长和成熟的协同促进作用：明场图像显示 BVO 在静态 vs 流动 + 血管化条件下的体积差异（流动组明显更大）、荧光染色显示细胞活性（活/死染色，流动组活细胞比例显著更高）、胰岛素分泌实验显示胰岛球在血管化 + 流动条件下葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）功能增强、以及转录组热图显示成熟相关基因的上调。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对比四种条件下类器官的生长和成熟情况：（1）静态培养（对照组）；（2）单独流动灌注；（3）单独血管化（共培养 HUVEC，不流动）；（4）流动 + 血管化（完整平台）。以 BVO 和胰岛球为模型，通过尺寸测量、活/死染色、代谢活性（ATP 含量）、功能检测（胰岛素分泌 GSIS）、转录组测序等多维度评估。 |
| 发现什么 | "流动 + 血管化"组的类器官体积比静态组大 2.3 倍（BVO），活细胞比例从 65% 提升到 92%，内部坏死核心面积减少 70% 以上。胰岛球的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）指数提升 1.8 倍，提示功能成熟度显著增强。转录组分析显示"流动 + 血管化"组上调了细胞外基质、代谢酶、细胞周期、成熟标记物等 400+ 基因，下调了凋亡和应激相关基因。 |
| 说明什么 | 流动和血管化具有协同效应：流动提供营养输送和剪切力刺激，血管化提供类器官与循环系统之间的生理接口，两者结合才能最大化类器官的生长和成熟。这一发现解释了为什么传统静态类器官培养难以达到体内水平的成熟度——缺乏的不仅是营养，还有流体力学刺激和血管微环境的协同作用。 |
三、说明什么 🌐
领域意义
本研究在类器官芯片（organoid-on-chip）领域实现了三个层面的突破：
-
技术层面：首次将干细胞来源的血管类器官（BVO）与微流控灌注系统结合，并实现了与内皮细胞床的功能性吻合。此前的血管化芯片大多使用永生化内皮细胞（如 HUVEC）形成的简单管腔，缺乏真实血管的多层细胞结构和生理功能。本平台使用的 BVO 包含内皮细胞、周细胞、细胞外基质等多种成分，更接近体内真实微血管。
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方法学层面：建立了"流动 + 血管化"双因素协同增强类器官成熟的范式。此前领域内往往单独关注流动或单独关注血管化，本研究通过四组对照实验（静态/流动/血管化/流动+血管化）清晰证明了两者的协同效应——1+1 > 2。这为未来类器官芯片的设计提供了重要参考：不应只追求"有血管"，而应追求"有功能的血管 + 有生理意义的流动"。
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应用层面：该平台具有广泛的可扩展性——不仅适用于血管类器官，还成功验证了胰岛类器官模型。从原理上讲，任何需要血管支持的类器官类型（肝、肾、脑、肿瘤）都可以移植到该平台上，为药物筛选、毒理学测试、疾病建模提供更高生理相关性的体外模型。
临床/转化价值
- 药物筛选与毒理学：可灌注的血管化类器官芯片能够更准确地模拟药物在体内的暴露动力学（浓度梯度、代谢、清除），特别是对需要血管输送的抗肿瘤药物、心血管毒性药物的评估，预测价值显著高于静态培养模型。
- 血管疾病建模：该平台可用于研究糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、血管炎等疾病的发病机制，以及评估治疗性血管新生药物的效果。
- 个性化医疗：使用患者 iPSC 来源的类器官构建个性化血管化芯片，实现精准的药物反应测试和疗效预测。
- 下一步方向：增加免疫细胞组分（如巨噬细胞、T 细胞）以模拟炎症-血管相互作用；集成传感器（如电化学、阻抗传感器）实现实时功能监测；扩大通量（从单芯片到 96 孔板级）以满足高通量筛选需求。
局限性与开放问题
- 通量较低：当前是单通道芯片，操作手工化，难以实现高通量筛选。未来需要向多孔板（96 孔/384 孔）格式升级。
- 血管类型单一：当前主要是微血管/毛细血管水平，尚未实现动脉-毛细血管-静脉的层级化血管网络。
- 长期稳定性：30 天培养已验证，但数月级别的长期培养稳定性（血管是否会退化）仍需验证。
- 与实质类器官的整合深度：当前胰岛球只是"共培养"，尚未实现血管深入胰岛球内部的深度整合——这是未来重要的技术挑战。
与可应用的产品/平台
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 生物打印机 | ⭐⭐⭐⭐ | 该平台的微流控芯片和类器官制备涉及多种生物材料的精确沉积，BIO X 系列的多喷头生物打印可用于芯片内类器官的精准接种和水凝胶包埋，提升通量和一致性。 |
| 类器官芯片 / OoC 平台（如 Mimetas OrganoPlate 同类产品） | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本研究本身就是血管化类器官芯片的标杆工作，对于同类 OoC 产品的研发和市场拓展具有直接的技术参照和文献背书价值。血管化 + 灌注 + 功能验证的"三件套"可作为产品核心卖点。 |
| 3Brain HD-MEA 系统 | ⭐⭐⭐ | 如果将该平台扩展到神经类器官血管化模型（如脑类器官 + 血管网络），3Brain 的高密度 MEA 可用于同步监测血管化后神经类器官的电生理活动，评估血脑屏障模型的药物通透性与神经功能的联动。 |
| CelVivo ClinoStar 3D 培养系统 | ⭐⭐⭐ | 类器官的制备和扩增阶段可以在 ClinoStar 中完成（低剪切悬浮培养生成高质量类器官），然后转移到微流控芯片中进行血管化和灌注实验——两者形成"扩增 + 功能化"的工作流互补。 |
参考文献
- Quintard C, Tubbs E, Jonsson G, et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 2024;15(1):2764. DOI: 10.1038/s41467-024-45710-4
- Wimmer RA, Leopoldi A, Aichinger M, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565(7740):505-510. DOI: 10.1038/s41586-018-0850-3
- Zhang YS, Aleman J, Shin SR, et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114(11):E2293-E2302. DOI: 10.1073/pnas.1612805114
- Ronaldson-Bouchard K, Vunjak-Novakovic G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 2018;22(3):310-324. DOI: 10.1016/j.stem.2018.02.011
- Hofbauer M, Jahn K, Schweizer P, et al. Blood vessel organoids for disease modeling and drug discovery. Cell Stem Cell. 2024. DOI: 10.1016/j.stem.2024.01.003
- 联系人:李东伟
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Nature Communications 重磅！Quintard 团队首次开发整合功能性血管化类器官的微流控芯片平台，蛇形通道 + 干细胞来源血管类器官 + HUVEC 吻合三重策略，实现 30 天可灌注培养，类器官体积提升 2.3 倍、活率 92%，为高生理相关性药物筛选和疾病建模提供新范式 🧠⚡