CELLINK BIO X 气动打印头 3D 打印神经组织 Protocol
文献信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| DOI | 10.1016/j.xpro.2022.101348 |
| 标题 | Protocol for printing 3D neural tissues using the BIO X equipped with a pneumatic printhead |
| 作者 | Josie Chrenek, Rebecca Kirsch, Kali Scheck, Stephanie M. Willerth |
| 机构 | 加拿大维多利亚大学生物医学工程系/机械工程系、英属哥伦比亚大学生物医学工程学院 |
| 期刊 | STAR Protocols (Cell Press) |
| 发表日期 | 2022年6月17日 |
| 文献类型 | Protocol |
| 类器官类别 | 神经组织/3D 生物打印 |
核心科学问题
3D 生物打印神经组织缺乏标准化 Protocol：
- 神经组织 3D 打印涉及多种细胞类型和生物墨水组合
- 打印参数（压力、速度、层厚）对细胞活力和结构完整性至关重要
- 需要可重复的 Protocol 支持药物筛选和疾病建模
为什么这个 Protocol 重要：
- 直接使用 CELLINK BIO X 打印机 + 气动打印头
- 兼容多种细胞系：神经祖细胞（NPCs）、胶质母细胞瘤（GBMs）、MSCs、HDFs
- 两种生物墨水方案：TissuePrint-HV（纤维蛋白基）和 Alg/Gel（海藻酸盐/明胶）
- 支持多种打印模式：琼脂糖支撑浴、直接打印到培养板、预交联
技术创新：CELLINK BIO X 气动打印神经组织
核心方法
研究团队开发了完整的 CELLINK BIO X 气动打印 3D 神经组织 Protocol：
- 生物墨水：Axolotl Biosciences TissuePrint-HV Kit（纤维蛋白基）
- 交联剂：TissuePrint Crosslink（20 mL 交联剂 / 5 mL 生物墨水）
- 备选墨水：2% Alginate / 2% Gelatin（Alg/Gel）
- 支撑浴：0.5% 琼脂糖（可选，用于复杂结构）
- 打印头：CELLINK BIO X 气动打印头（Pneumatic 3 mL）
- 针头：22G 标准锥形生物打印喷嘴
- 细胞密度：1×10⁶ cells/mL（推荐），200,000-350,000 cells/构建体
关键参数
| 参数 | TissuePrint-HV（琼脂糖浴） | TissuePrint-HV（直接打印） | Alg/Gel |
|---|---|---|---|
| 压力 | 10 kPa | 5 kPa | 按需调整 |
| 打印速度 | 15 mm/s | 10 mm/s | 按需调整 |
| 细胞密度 | 1×10⁶ cells/mL | 1×10⁶ cells/mL | 1×10⁶ cells/mL |
| 交联方式 | 化学交联（TissuePrint Crosslink） | 预交联 | CaCl₂ 交联 |
| 支撑浴 | 0.5% 琼脂糖 | 无 | 无 |
| 构建体形状 | 圆柱/圆顶/立方体 | 圆柱/圆顶/立方体 | 圆柱/圆顶/立方体 |
| 填充率 | 25% | 25% | 25% |
| 产出 | 3 个 10×10 mm 圆柱/1 mL 墨水 | 3 个 10×10 mm 圆柱/1 mL 墨水 | 3 个 10×10 mm 圆柱/1 mL 墨水 |
生物墨水配方
TissuePrint-HV Kit（Axolotl Biosciences）：
- Component 1：纤维蛋白原溶液
- Component 2：细胞悬浮液（1×10⁶ cells/mL）
- Component 3：凝血酶溶液（交联启动）
- 特点：高粘度、化学交联、支持多种细胞类型
Alg/Gel（自制）：
- 2% Alginate（w/v）+ 2% Gelatin（w/v）
- 加热至 135°C 搅拌至完全溶解
- 特点：高粘度、自支撑、CaCl₂ 交联、可存储 2 周
支撑浴制备
0.5% 琼脂糖：
- 蒸馏水 + 0.5% 琼脂糖
- 70°C 加热搅拌 3-4 小时至完全溶解
- 900 rpm 搅拌冷却至室温
- 粘度：介于水和糖浆之间
- 存储：4°C 最长 1 周
关键 Protocol 步骤
1. 生物墨水准备（1.5 小时）
TissuePrint-HV + 细胞：
- Component 1 和 3：4°C thaw 前一天
- Component 2：室温 thaw（打印前）
- Component 2 加入 Component 1，宽口移液器混匀
- 细胞离心（300 g, 5 min），去上清
- Component 2 重悬细胞沉淀
- 打印前立即加入 Component 3
- 注意：混合后 1 小时内使用，避免絮凝
2. 打印机准备（1 小时）
CELLINK BIO X 设置：
- 生物安全柜（BSC）内放置打印机
- 消毒：MycoClean + Conflikt + 70% 乙醇
- UV 灭菌打印舱（Utilities → Clean chamber）
- 安装打印头（Tool 1）
- 连接气压管
注射器装填：
- Piece 1 放入 Syringe B，推至底部
- Syringe A 连接 Syringe B（通过 Piece 2）
- 生物墨水倒入 Syringe A
- 推杆将墨水推入 Syringe B
- 移除 Piece 2，安装 Piece 3（或钝头针）
- 插入打印头（Tool 1）
3. 打印参数设置（15 分钟）
BIO X 触摸屏设置：
- Bioprint → 选择模型（圆柱/圆顶/立方体）
- Surface → 选择打印表面（培养皿/孔板）
- Printer：
- Tool type：Pneumatic 3 mL
- Bioink profile：CELLINK START
- Photo-crosslinking：Off
- 压力/速度：见上表
- Layers：
- Layer profile：Grid Lattice（推荐）
- Infill density：25%
- Print → 保存/打印
4. 校准（15 分钟）
手动校准：
- 琼脂糖浴：针尖距底部 ~1 mm
- 直接打印：针尖距底部 ~0.1 mm
- 测试压力：调整至 ~1 滴/秒
- 清洁喷嘴：乙醇 Kimwipe 擦拭
5. 打印模式
模式 A：琼脂糖支撑浴打印：
- 适用：低粘度墨水、复杂结构
- 6 孔板 + 0.5% 琼脂糖
- 压力：10 kPa，速度：15 mm/s
模式 B：直接打印 + 预交联：
- 适用：高粘度墨水、简单结构
- 直接打印到细胞培养板
- 压力：5 kPa，速度：10 mm/s
模式 C：Alg/Gel 直接打印：
- 适用：高粘度 Alg/Gel 墨水
- 自支撑，无需支撑浴
- CaCl₂ 交联
学术启示
1. CELLINK BIO X 神经组织打印 = 标准化 Protocol
这篇 STAR Protocols 证明了CELLINK BIO X 可以标准化打印 3D 神经组织：
- 完整 Protocol：从生物墨水准备到打印到培养
- 多种细胞兼容：NPCs、GBMs、MSCs、HDFs
- 两种墨水方案：TissuePrint-HV（商业）和 Alg/Gel（自制）
- 多种打印模式：支撑浴、直接打印、预交联
2. 与我们产品线的直接呼应
| 本研究 | 我们的产品 |
|---|---|
| CELLINK BIO X 气动打印 | CELLINK BIO X（气动/挤出双模式） |
| TissuePrint-HV 生物墨水 | CELLINK 生物墨水兼容 |
| Alg/Gel 自制墨水 | 客户可自制，降低成本 |
| 神经组织打印 | 脑类器官/神经疾病建模 |
| 3D 打印神经组织 | 可结合 CelVivo 成熟培养 |
销售话术：
"这篇 STAR Protocols 2022 提供了完整的 CELLINK BIO X 打印 3D 神经组织 Protocol，神经祖细胞、胶质母细胞瘤、MSCs 都能打，1 mL 墨水出 3 个 10×10 mm 构建体。BIO X 气动打印头直接按 Protocol 设置参数就能用，细胞活力高、结构完整。"
3. 潜在应用方向
- 神经疾病建模：胶质母细胞瘤（GBMs）3D 打印模型
- 药物筛选：3D 神经组织药物毒性/疗效筛选
- 再生医学：神经组织工程支架
- 教育/培训：标准化 Protocol 适合教学
关键图片（完整 Figure 页面，3x 分辨率）
图1：0.5% 琼脂糖支撑浴、交联剂和生物墨水代表性图像
图2：生物打印所需的实验室设备
图3：BIO X 打印头和注射器设置
图4：BIO X 打印机参数设置界面
图5：直接打印到细胞培养板 + 预交联
图6：琼脂糖支撑浴打印流程
图7：Alg/Gel 生物墨水打印
图8：最终打印的 3D 神经组织构建体
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