跨突触示踪技术解析胶质母细胞瘤的神经元连接组
Yusha Sun, Xin Wang, Zhijian Zhang, Guo-li Ming & Hongjun Song | Nature Protocols 2025 | DOI: 10.1038/s41596-025-01287-w
标签: #胶质母细胞瘤 #跨突触示踪 #狂犬病毒 #单纯疱疹病毒 #类器官 #脑肿瘤-神经环路 #3Brain
一、做什么 🔬
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最致命的癌症之一。近年研究发现，GBM 细胞能够与大脑神经元形成功能性突触连接，整合进神经环路中——这种"肿瘤-神经元对话"不仅促进肿瘤生长和侵袭，还会导致神经元过度兴奋和脑功能损伤。但一个核心难题始终是：如何在全脑尺度上精确定位并操控这些与肿瘤形成连接的神经元？
本 Protocol 由宾夕法尼亚大学 Ming Song 实验室（Sun et al. Nature 2025 的方法学延伸）提供了一套完整的跨突触病毒示踪技术方案，用于系统绘制 GBM 的神经元输入连接组（connectome）。核心方法包括：
| 技术 | 病毒类型 | 示踪方向 | 用途 |
|---|---|---|---|
| 逆行单突触示踪 | 狂犬病毒（RV-ΔG + RTG） | 肿瘤→神经元（逆向） | 识别向 GBM 提供输入的神经元 |
| 顺行单突触示踪 | 单纯疱疹病毒（HSV-ΔTK + DIO-TK） | 神经元→肿瘤（顺向） | 从特定神经元群体追踪到肿瘤 |
| 多突触 HSV 示踪 | HSV-ΔTK | 多突触传播 | 人脑切片中追踪更广泛的环路 |
实验模型涵盖：
- 体内（in vivo）：GBO（胶质母细胞瘤类器官）移植到免疫缺陷小鼠脑内
- 体外（ex vivo）：GBO 与 iPSC 衍生神经元/皮层类器官共培养、人脑手术组织切片气液界面培养
二、发现什么 📊
核心技术流程
图1：跨突触示踪技术总览。a 部分展示逆行（狂犬病毒，左）和顺行（HSV，右）两种示踪方向的原理；b 部分展示四种狂犬病毒逆行示踪的实验流程（共培养、组装体、短期体内、长期体内）；c 部分展示 HSV 顺行示踪的两种模型（小鼠脑内移植、人组织切片共培养）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 系统梳理了狂犬病毒逆行示踪和 HSV 顺行示踪的病毒学原理及四种实验流程，涵盖从体外共培养到体内移植的完整技术路线 |
| 发现什么 | 逆行示踪（RV-ΔG 系统）需两步法：先用逆转录病毒（RTG）在 GBM 细胞中表达狂犬病毒糖蛋白 G 和组蛋白 H，再注射缺失 G 蛋白的狂犬病毒（RV-ΔG），病毒只能逆向跨单突触传播到输入神经元；顺行示踪（HSV-ΔTK 系统）利用 Cre/LoxP 和胸苷激酶互补，从特定神经元群体顺向传播到肿瘤细胞 |
| 说明什么 | 两种方向互补：逆行示踪回答"哪些神经元连接到肿瘤"，顺行示踪回答"特定类型神经元是否能连接到肿瘤"，共同构建完整的肿瘤-神经连接图谱 |
图2：GBO 解离、再聚集与病毒转导的完整表征流程。a 实验流程图（解离→病毒转导→再聚集）；b 明场形态学观察；c 免疫荧光验证多细胞组成；d 细胞比例定量；e-g 单细胞转录组分析（UMAP 聚类、基因表达、CNV 变异）；h-i 病毒转导效率验证。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 建立了 GBO 的标准化处理流程：将患者手术组织来源的 GBM 类器官解离为单细胞→用逆转录病毒转导表达狂犬病毒辅助蛋白→在 U 型底板中重新聚集形成类器官→通过免疫荧光（OLIG2、SOX2、NeuN、IBA1 等）、单细胞 RNA 测序和拷贝数变异（CNV）分析验证模型质量 |
| 发现什么 | 再聚集后的 GBO 保留了原发肿瘤的异质性：包含 OLIG2+ 肿瘤细胞、IBA1+ 小胶质细胞、CD3+ T 细胞等微环境成分；scRNA-seq 显示存在星形胶质细胞样（AC）、间充质样（MES）、神经前体（NPC）等多种亚群；CNV 热图显示典型的 GBM 基因组特征（7 号染色体扩增、10 号染色体缺失）；病毒转导效率可达 60% 以上 |
| 说明什么 | GBO 是研究肿瘤-神经互动的理想模型——保留了患者肿瘤的遗传异质性和微环境，且能够高效接受病毒转导，为后续跨突触示踪提供可靠的起始细胞平台 |
图3：狂犬病毒跨单突触示踪的核心结果。a-b 体外共培养模型验证（GBO 与皮层类器官、iPSC 胆碱能神经元共培养，橙色箭头指示突触接触）；c 体内移植后起始 GBM 细胞定位；d 阴性对照（RTΔG 无扩散）；e 连接神经元数量时间动态；f 全脑输入连接组（同侧/对侧，按注射位点分类）；g-i 特定神经递质输入验证（胆碱能 ChAT、血清素能 TPH2、儿茶酚胺能 TH）；j 长期示踪结果。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在人脑手术组织切片中执行多突触 HSV 示踪：新鲜手术组织→振动切片机切片→气液界面（ALI）培养 3 天→HSV 标记→与 GBO 共培养 3 天→免疫组化分析。同时在体内模型中，将 GBO 移植到小鼠脑内不同区域（海马、运动皮层等），7-30 天后注射示踪病毒，分析全脑范围的输入神经元分布 |
| 发现什么 | GBM 细胞接收来自全脑多个区域的神经输入，包括皮层（Isocortex）、丘脑（Thalamus）、下丘脑（Hypothalamus）、中脑（Midbrain）等；输入涉及多种神经递质系统：胆碱能（ChAT+）、血清素能（TPH2+）、儿茶酚胺能（TH+）；长期示踪（>14-30 天）可检测到远距离脑区的输入神经元；连接数量随时间增长（3→5→10 天） |
| 说明什么 | GBM 不是孤立的肿块，而是广泛整合进大脑神经环路中的"网络节点"——它接收来自多个脑区、多种神经递质系统的输入，这解释了为什么 GBM 能利用神经活动信号促进自身生长，也提示针对特定神经递质受体（如 CHRM3）可能成为新的治疗策略 |
三、说明什么 💡
科学意义
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| GBM 整合进全脑神经环路 | 颠覆了"肿瘤是局部病变"的传统认知，GBM 是"神经网络参与者" |
| 多种神经递质驱动肿瘤生长 | 胆碱能、血清素能、儿茶酚胺能均可促进 GBM，提示神经调控治疗的广泛潜力 |
| 跨突触示踪可精确定位输入神经元 | 从"知道有连接"到"知道谁在连接"，为精准干预提供靶点 |
| GBO 模型保留肿瘤异质性 | 比传统细胞系更贴近临床，是药物筛选和机制研究的理想平台 |
与我们产品的关联
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain HD-MEA | ⭐⭐⭐⭐ | 本 Protocol 虽未直接使用 MEA，但 GBO-神经元共培养体系中神经元网络功能验证（突触形成后的电生理活动）是核心质控环节。3Brain 4096 电极 HD-MEA 可实时监测 GBO 共培养体系中神经元网络的同步放电、burst 频率、突触后电位等，是验证"功能性突触连接"的金标准 |
| 3Brain USB-MEA | ⭐⭐⭐ | 适用于 GBO 解离再聚集后的细胞电生理表型分析，验证肿瘤细胞的兴奋性和突触后反应 |
| Celvivo 3D 培养系统 | ⭐⭐ | GBO 的长期培养和气液界面（ALI）培养需要稳定的 3D 培养环境，3D 生物打印可构建更复杂的肿瘤-神经微环境模型 |
技术优势与局限
| 优势 | 局限 |
|---|---|
| 全脑尺度、细胞分辨率 | 需要 >100 只动物的体内实验验证 |
| 兼容多种模型（体内/体外/人组织） | 仅 ~30% 的 GBO 能耐受解离和再聚集 |
| 可识别特定神经递质类型的输入 | 需要专业病毒学操作和 BSL-2 以上防护 |
| 结果可直接指导靶向治疗 | 长期示踪（>30 天）存在动物死亡风险 |
原文下载
📄 Sun_2025_NatProtoc_GBM_Transsynaptic_Tracing.pdf
参考文献
- Sun Y, et al. Brain-wide neuronal circuit connectome of human glioblastoma. Nature. 2025;641:222-231. doi:10.1038/s41586-025-08634-7
- Tetzlaff SK, et al. Characterizing and targeting glioblastoma neuron-tumor networks with retrograde tracing. Cell. 2025;188:390-411.e36. doi:10.1016/j.cell.2024.11.023
- Venkataramani V, et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 2019;573:532-538. doi:10.1038/s41586-019-1564-x
- Venkatesh HS, et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 2019;573:539-545. doi:10.1038/s41586-019-1554-z
- Monje M, Winkler F. The neuroscience of cancer. Nature. 2023;618:467-479. doi:10.1038/s41586-023-06040-5
转发语：Nature Protocols 最新 Protocol——用狂犬病毒和 HSV 跨突触示踪技术，全脑尺度绘制胶质母细胞瘤的神经元输入图谱。GBM 不是孤立的肿块，而是深度整合进神经环路的"网络节点"，接收来自皮层、丘脑、中脑等多区域的胆碱能、血清素能、儿茶酚胺能输入。这套方案为精准靶向肿瘤-神经突触提供了技术平台。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top