PRPF31基因突变破坏剪接与纤毛生成导致视网膜色素变性
Buskin et al. | Nature Communications 2018 | DOI: 10.1038/s41467-018-06448-y
标签: #视网膜类器官 #RNA剪接 #纤毛缺陷 #PRPF31 #色素性视网膜炎 #CRISPR修复 #3D生物打印 #MEA
一、做什么 🔬
核心问题
PRPF31 是前体 mRNA 加工因子（PRPF）家族成员，参与 U4/U6.U5 三 snRNP 组装和剪接体激活。PRPF 突变导致约 15% 的常染色体显性遗传色素性视网膜炎（RP），但 PRPF 是全身性表达的剪接因子，为什么突变后只影响视网膜？这个问题在 immortalized cell lines 和动物模型中一直没能解释清楚——缺乏明确的细胞表型来定义受影响的靶细胞类型，也无法阐明视网膜特异性的病理机制。
研究设计
研究者建立了完整的患者 iPSC-视网膜分化模型体系，从四个维度展开：
| 层面 | 方法 | 目的 |
|---|---|---|
| 患者来源 | 3 名相关 RP11 患者（PRPF31 c.1115_1125del11 突变，表型从轻度到极重度）+ 3 名健康对照 | 建立梯度表型模型 |
| 细胞类型 | iPSC → RPE（视网膜色素上皮）+ 3D 视网膜类器官 | 在靶组织中重现疾病 |
| 分子机制 | RT-PCR、Western blot、E1A 剪接报告基因、RNA-seq（rMATS）、Northern blot | 解析剪接缺陷的靶基因 |
| 功能验证 | siRNA 敲除 + CRISPR/Cas9 原位基因修复 | 确认 PRPF31 的因果关系 |
为什么值得读
这篇论文首次在患者来源的视网膜细胞中揭示了 PRPF31 突变的双重打击：(1) 剪接体功能全面受损，(2) 纤毛生成障碍。特别是发现纤毛缺陷这一表型，为"为什么只影响视网膜"提供了全新的解释——光感受器的外段本质上是特化的纤毛结构，对纤毛相关基因的剪接错误极度敏感。
二、发现什么 📊
Figure 1：RP11-RPE 细胞存在极性和功能缺陷
*图1：RP11 患者来源 RPE 细胞的分化方案及功能表征。(c) 基底侧标记物 BEST1 在重度患者中表达降低；(d) 对照组 RPE 正常表达顶端 MERTK 和基底胶原 IV，而 RP11-RPE 两者均减少；(e-f) PEDF 和 VEGF 分泌显著升高；(g) 跨上皮电阻 TER 显著降低；(h) 吞噬杆状体外段能力显著下降。n=3，***p<0.0001。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| iPSC 分化为 RPE 细胞，免疫染色检测极性标记物 | 重度 RP11 患者 RPE 的基底侧标记物 BEST1 表达降低，顶端 MERTK 和基底胶原 IV 均减少 | PRPF31 突变导致 RPE 顶端-基底极性丧失，这是 RPE 功能的核心基础 |
| ELISA 检测 RPE 顶端/基底分泌物 | 重度患者 RPE 的 PEDF（顶端）和 VEGF（基底）分泌量分别升高至对照的约 3-4 倍（p<0.0001） | 细胞因子失衡可能进一步损害 RPE 极性，影响光感受器存活 |
| 跨上皮电阻（TER）检测上皮屏障功能 | RP11-RPE 的 TER 显著低于对照组（p<0.0001） | RPE 紧密连接功能受损，视网膜屏障功能下降 |
| 吞噬杆状体外段功能检测 | 重度 RP11-RPE 的吞噬能力显著降低（MFI 下降约 50%，p<0.0001） | RPE 无法正常清除光感受器脱落的外段，加速视网膜退化 |
图1→图2的逻辑：Figure 1 证明了 RPE 层面的功能和极性缺陷，但 RP 的核心病理在光感受器本身。因此接下来需要在 3D 视网膜类器官中直接观察光感受器的退化表型。
Figure 2：RP11 光感受器出现进行性退行性变化
图2：iPSC 分化为 3D 视网膜类器官及光感受器退化表型。(a) 视网膜类器官分化方案；(c) 类器官表达光感受器标记物 RECOVERIN、连接纤毛标记物 ARL13B、Müller 胶质细胞 CRALBP、双极细胞 PKCα；(d) TEM 显示 21 周时类器官含外 limiting 膜、内段（IS）、连接纤毛（CC）和发育中外段（OS）；(e) 43 周时患者光感受器含凋亡核（电子致密浓缩染色质，白箭头）和应激空泡（黑星号）。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| iPSC 分化为 3D 视网膜类器官（43 周长期培养） | 类器官含完整视网膜细胞层：光感受器（RECOVERIN+）、连接纤毛（ARL13B+）、Müller 胶质（CRALBP+）、双极细胞（PKCα+） | 患者 iPSC 能正常分化为多种视网膜细胞类型，排除发育缺陷 |
| TEM 分析 21 周和 43 周类器官的超微结构 | RP11 类器官的凋亡核细胞比例增加 150%（50 个 TEM 切片统计）；17% 的患者切片出现"应激空泡"，对照组为零 | 光感受器退化是进行性的——从 21 周到 43 周持续恶化，而非一次性损伤 |
| MEA 记录视网膜神经节细胞（RGC）的放电活动 | 对照组类器官对 GABA 有正常的增加放电反应，极重度 RP11 患者反应显著降低 | 神经网络的 GABA 信号传导受损，说明 RP11 病变不仅影响光感受器，还波及整个视网膜神经网络 |
图2→图3的逻辑：Figure 2 建立了光感受器的退行性表型，但尚不清楚分子机制。既然 PRPF31 是剪接因子，接下来需要直接检测剪接功能是否受损。
Figure 3：RP11 细胞中 pre-mRNA 剪接功能受损
核心发现（本文未提取清晰配图，以下为关键数据）：
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| RT-PCR 和 Sanger 测序检测 PRPF31 转录本 | RP11 细胞产生 NMD 不敏感的长突变体（LM, 192bp）和 NMD 敏感的短突变体（SM, 130bp），对照细胞无此转录本 | 突变产生了稳定的异常转录本，在 RPE 中尤为明显 |
| qRT-PCR 定量野生型 PRPF31 mRNA | RP11-RPE 中野生型 PRPF31 mRNA 降至对照的约 16%；视网膜类器官中降至约 42% | RPE 的 PRPF31 表达损失远大于光感受器，解释了为什么 RPE 表型更严重 |
| Western blot 检测 PRPF31 及剪接体蛋白 | RPE 中 PRPF31 野生型蛋白降至 53%，同时 U5 snRNP 蛋白 SART1 也显著下调 | PRPF31 突变引发连锁反应——其他剪接体组分也被波及 |
| E1A 剪接报告基因检测 | RP11-RPE 中 9S 和 10S 剪接产物显著减少，前体 mRNA 积累；视网膜类器官中 12S 产物减少 | 剪接效率在 RPE 和光感受器中均受损，但 RPE 的缺陷更严重 |
| Northern blot 检测 snRNA 水平 | RP11 视网膜类器官中 U4 snRNA 显著低于对照，U1/U2/U5/U6 无差异 | U4 snRNA 特异性降低提示 U2 依赖型剪接体功能受损 |
图3→图4的逻辑：Figure 3 证明了剪接功能整体受损，但哪些具体基因的剪接被破坏？需要全转录组分析来找出靶基因。
Figure 4：细胞黏附与纤毛相关基因的剪接被破坏
图4：全转录组 RNA-seq 分析揭示剪接破坏的靶基因。(a) rMATS 分析显示 RP11-RPE 的保留内含子（RI）和交替 3' 剪接位点（A3SS）比例最高；(b) GO 富集分析显示 RP11 视网膜类器官的差异剪接基因富集于纤毛组装、中心体和微管组织；(c) RT-PCR 验证关键基因（RPGR、RPGRIP1L、IFT122、SORBS1、CPSF1、CNOT3）的剪接变化；(d) Sashimi 图显示 RP11 患者（蓝色）与对照（红色）的差异剪接连接读段。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| RNA-seq + rMATS 分析四种细胞类型的差异外显子使用 | RP11-RPE 中保留内含子（RI）和交替 3' 剪接位点（A3SS）的转录本比例最高 | RPE 的剪接错误最严重，与 Figure 3 的表达水平下降一致 |
| GO 富集分析差异剪接基因的生物学过程 | RP11 视网膜类器官的差异剪接基因富集于：纤毛组装、中心体、微管组织；RPE 富集于：黏附连接、黏着斑、线粒体内膜 | 关键发现：剪接错误的靶基因直接指向纤毛相关通路——这解释了为什么视网膜（富含纤毛结构）特别敏感 |
| RT-PCR 验证关键纤毛基因 | RP11 视网膜类器官中 RPGR（PSI 58→89）、RPGRIP1L（74→63）、IFT122（84→79）、SORBS1（98→72）的剪接模式显著改变 | RPGR/RPGRIP1L 是 RP 致病基因，IFT122 是纤毛内转运蛋白——它们的剪接错误直接导致纤毛功能障碍 |
| 小鼠 Prpf31+/− 视网膜 RNA-seq 验证 | 小鼠突变视网膜的差异剪接基因同样富集于 RNA 剪接、mRNA 加工、微管和纤毛 | 人-鼠数据高度一致，确认纤毛剪接缺陷是核心病理机制 |
图4→图5的逻辑：Figure 4 在分子层面证明了纤毛相关基因被错误剪接，接下来需要在细胞层面直接观察纤毛是否真的出了问题。
Figure 5：RP11-RPE 和光感受器存在纤毛异常
图5：RP11 患者 RPE 和光感受器的纤毛缺陷。(a) ARL13B（纤毛标记物）和 pericentrin（基体标记物）共定位；(b) RP11-RPE 的纤毛发生率和纤毛长度均显著降低；(c) TEM 显示对照 RPE 有排列整齐的微管长纤毛，RP11-RPE 为短而异常的球状纤毛；(e-f) RP11 光感受器的纤毛发生率也显著降低；(g) 光感受器纤毛出现球状变形和微管错位。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 免疫荧光染色 ARL13B（纤毛）和 pericentrin（基体），定量纤毛发生率和长度 | RP11-RPE 纤毛发生率降至约 50%（p<0.001），纤毛长度缩短约 30% | PRPF31 突变直接导致纤毛生成障碍 |
| TEM 和 SBFSEM 分析纤毛超微结构 | 对照 RPE 纤毛有排列整齐的 9+0 微管结构；RP11-RPE 纤毛短粗、球状、微管排列紊乱 | 不仅是纤毛数量减少，纤毛内部结构也被破坏 |
| 同样方法检测视网膜类器官光感受器纤毛 | 患者光感受器纤毛发生率显著降低（p<0.01），TEM 显示球状变形和轴丝微管错位 | 光感受器外段（特化纤毛）的结构性损伤——直接对应 RP 的病理表型 |
图5→图7的逻辑：Figure 5 证明了纤毛结构受损，但是否是 PRPF31 缺失的直接后果？需要基因修复实验来确认因果关系。
Figure 7：CRISPR/Cas9 基因修复逆转所有细胞和功能缺陷
图7：CRISPR/Cas9 原位修复 PRPF31 突变后，RPE 和光感受器的纤毛、吞噬和极性均恢复正常。(d-e) 修复后 RPE 的纤毛长度和发生率显著增加；(f) TEM 显示修复后纤毛微管排列恢复正常；(g) 流式细胞术确认吞噬功能恢复；(h-j) MERTK 和胶原 IV 表达恢复，细胞因子分泌正常化；(k-l) 修复后光感受器纤毛发生率也恢复正常。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| CRISPR/Cas9 + ssODN 模板原位修复 RP11VS 患者的 PRPF31 突变 | 200 个 iPSC 克隆中筛选出正确修复的克隆，Sanger 测序确认，无脱靶效应 | 基因修复在分子层面完全成功 |
| 修复后的 iPSC 分化为 RPE 和视网膜类器官 | qRT-PCR 确认 PRPF31 表达恢复正常水平 | 修复的基因能正常表达 |
| 纤毛长度和发生率检测 | 修复后 RPE 纤毛发生率从约 50% 恢复至约 80%，长度从约 3μm 恢复至约 5μm（p<0.001） | 纤毛生成障碍是 PRPF31 突变的直接后果，修复后可逆 |
| TEM 分析修复后纤毛超微结构 | 修复后纤毛具有正常排列的轴丝微管，球状变形消失 | 结构层面的修复也得到确认 |
| 流式细胞术检测吞噬功能 | 修复后 RPE 的吞噬能力恢复至对照水平（MFI 从约 100 恢复至约 200） | 功能性修复——不仅是形态恢复 |
| 免疫染色和 ELISA 检测极性和细胞因子 | 修复后 MERTK 和胶原 IV 极性表达恢复正常，PEDF/VEGF 分泌量恢复至对照水平 | RPE 的顶端-基底极性完全恢复 |
三、说明什么 💡
机制链条
| 发现 | 机制意义 |
|---|---|
| PRPF31 突变导致 RPE 中 PRPF31 表达降至 16% | RPE 对 PRPF31 剂量极度敏感——"剂量效应"是视网膜特异性的关键 |
| 纤毛相关基因（RPGR、RPGRIP1L、IFT122）被错误剪接 | 剪接体缺陷不是全局性的，而是选择性地影响纤毛通路 |
| 纤毛发生率降低 50%、结构异常 | 光感受器外段 = 特化纤毛 → 纤毛缺陷 = 光感受器退化 |
| CRISPR 修复后所有表型逆转 | PRPF31 突变的损伤是可逆的，基因治疗有希望 |
核心结论
这篇论文首次在患者来源的视网膜细胞中证明了：PRPF31 突变通过破坏纤毛相关基因的选择性剪接，导致纤毛生成障碍，进而引起光感受器退化。这解释了"为什么全身表达的剪接因子突变只影响视网膜"——因为光感受器的外段本质上是一根特化的纤毛，对纤毛组装和维持所需的基因剪接精度要求极高。任何剪接错误在纤毛相关基因中都会被放大为结构性缺陷。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain HD-MEA | ⭐⭐⭐⭐ | 本文在 Figure 2 中使用 MEA 记录视网膜类器官的 RGC 放电活动，证明了神经网络功能评估的可行性。3Brain 4096 电极 CMOS-MEA 可在更高时空分辨率下记录类器官的全局网络动态，替代或补充传统 GABA 药理学测试 |
| CELLINK BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 3D 视网膜类器官的培养需要精确的基质胶封装和长期悬浮培养，CELLINK 的生物打印平台可用于构建标准化的类器官培养体系，提高批次间一致性 |
| Celvivo Clinostar2 | ⭐⭐⭐ | 本文的视网膜类器官需要 43 周长期培养，Celvivo 的自动化培养和实时成像系统可用于长期监测类器官的纤毛形态变化和光感受器退化过程 |
| SIEVEWELL 纳米井载玻片 | ⭐⭐ | 纤毛的超微结构分析可与纳米井单细胞捕获结合，实现单个光感受器的基因表达与纤毛表型的关联分析 |
原文下载
📄 PRPF31 Buskin 2018 Nat Comm.pdf
参考文献
- Buskin A, et al. Disrupted alternative splicing for genes implicated in splicing and ciliogenesis causes PRPF31 retinitis pigmentosa. Nature Communications. 2018;9:4234. DOI: 10.1038/s41467-018-06448-y
- Chakarova CF, et al. Mutation of PRPF31, encoding a U4/U6 snRNP protein, causes autosomal dominant retinitis pigmentosa. Nature Genetics. 2003;35:228-231. DOI: 10.1038/ng1253
- Rose AM, et al. PRPF31, a novel gene involved in pre-mRNA splicing, is mutated in autosomal dominant retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 2003;12:1099-1107. DOI: 10.1093/hmg/ddg119
- Lakowski P, et al. Molecular basis of splicing factor PRPF31-associated retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 2018;67:1-19. DOI: 10.1016/j.preteyeres.2018.06.002
转发语：Nature Comm 这篇解释了为什么全身表达的剪接因子突变只攻击视网膜——光感受器外段是特化纤毛，对纤毛基因的剪接精度要求极高，一旦出错就是结构性崩塌。更关键的是，CRISPR 修复后所有表型都能逆转。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top