人肺组织单细胞 RNA 测序完整 Protocol
研究概述
期刊：STAR Protocols, 2022 | Volume 3, Issue 4, 101776
DOI：10.1016/j.xpro.2022.101776
PMCID：PMC9597186
作者：Álvaro Quintanal-Villalonga, Joseph M. Chan, Linas Mazutis, Charles M. Rudin 等
机构：Memorial Sloan Kettering Cancer Center（MSKCC）, Vilnius University 等
本报告详细描述了从人肺生物样本获取高质量单细胞转录组数据的完整流程，适用于：
- ✅ 核心针穿刺活检（Core needle biopsies）
- ✅ 细针穿刺抽吸（Fine-needle aspirates）
- ✅ 手术切除标本（Surgical resection）
- ✅ 恶性胸腔积液（Pleural effusions）
核心亮点
- 多样化样本兼容：涵盖从微创活检到大标本的全类型
- FACS 活细胞富集：CD45+/Calcein+ 双阳性分选
- 多平台适用：兼容 10× Genomics、Drop-seq 等液滴平台
- 完整数据分析流程：从原始数据到细胞注释的每一步指南
关键试剂与设备
核心 Kit
| 产品 | 货号 | 用途 |
|---|---|---|
| Human Tumor Dissociation Kit（Miltenyi） | #130-095-929 | 组织解离酶混合液 |
| Chromium Single Cell 3′ GEM Kit v3（10×） | #1000075 | scRNA-seq 文库构建 |
| Chromium i7 Multiplex Kit（10×） | #120262 | 文库索引 |
关键设备
| 设备 | 货号 | 说明 |
|---|---|---|
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | #130-096-427 | 8 样本 + 加热一体化解离 |
| gentleMACS C tube | #130-093-237 | 专用 C 管 |
| MACS SmartStrainers (70 μm) | #130-098-462 | 细胞过滤 |
| BD FACS Aria II | — | 流式分选 |
| Chromium Controller（10×） | #PN-120223 | 液滴封装 |
完整 Protocol 流程概览
图 1：Protocol 整体流程图
图 1 说明：
- Part A：手术标本解离（>100 mg，约 1 小时）
- Part B：小标本解离（活检/穿刺，10-100 mg，约 30 分钟）
- Part C：胸腔积液处理（约 30 分钟）
- Part D：活细胞染色（Calcein AM + CD45 抗体）
- Part E：FACS 分选富集
- Part F：液滴单细胞 RNA 测序
- Part G-H：数据预处理
- Part I：下游数据分析
详细步骤
Part A：手术标本解离（约 1 小时）
关键：缺血时间 < 1-2 小时，否则细胞死亡和 mRNA 降解增加
- 手术标本放入 5–20 mL 1× PBS，冰上保存
- 准备酶混合液：Enzyme H 250 μL + Enzyme R 110 μL + Enzyme A 40 μL
- 转移至 gentleMACS C 管，加入 7.5 mL 无血清培养基
- 组织切成 ~5 mm³ 小块
图 2：标本处理示意图
图 2 说明：
- (A) 肿瘤块置于培养皿
- (B) 切割操作：用镊子固定，刀片切成小块
- (C) 切割成 ~5 mm³ 的组织块
- 组织块转移至 C 管酶混合液
- 运行 "37C_H_TDK3" 程序 15 分钟
- 通过 70 μm 过滤器 过滤，20–25 mL Buffer 冲洗
- 800 × g 离心
- 红细胞裂解：ACK Buffer 1–2 mL，室温 2 分钟
- 800 × g 离心，通过 35 μm 过滤器
- 进入 Part D
Part B：小标本解离（活检/穿刺，约 30 分钟）
- 酶混合液：Enzyme H 85 μL + Enzyme R 40 μL + Enzyme A 15 μL
- 转移至 C 管，加入 2.5 mL 无血清培养基
- 运行 "37C_H_TDK3" 15 分钟（未完全解离可再加 5 分钟）
- 通过 35 μm 过滤器
- 红细胞裂解：200 μL ACK Buffer，室温 2 分钟
- 进入 Part D
Part C：胸腔积液处理（约 30 分钟）
- 500 × g 离心 浓缩细胞
- Ficoll 密度梯度离心（SepMate-50 + Ficoll-Paque PLUS）
- 1,200 × g 离心收集单核细胞
- 红细胞裂解
- 进入 Part D
Part D：活细胞染色（约 25 分钟）
- Calcein AM：活细胞标记
- PE-CD45 抗体：免疫细胞标记
- DAPI：死细胞排除
Part E：FACS 分选（约 30 分钟）
图 3：FACS 分选门设置
图 3 说明：
- (A) SSC-A vs FSC-A：排除碎片
- (B) SSC-H vs SSC-W：排除粘连体
- (C) FSC-H vs FSC-W：单细胞门
- (D) DAPI vs FSC：活细胞（DAPI⁻）
- (E) Calcein vs CD45：免疫细胞（CD45⁺）vs 非免疫细胞（CD45⁻）
分选策略：
- 富集非免疫细胞（肿瘤）：DAPI⁻ / PE⁻ / Calcein⁺
- 富集免疫细胞：DAPI⁻ / Calcein⁺ / PE⁺
Part F：液滴单细胞 RNA 测序（20–30 分钟）
图 4：scRNA-seq 文库质量
图 4 说明：
- (A) 核心活检文库 traces
- (B) 细针穿刺文库 traces
- (C) 胸腔积液文库 traces
测序参数：
- Read 1：26 cycles
- Read i7：8 cycles
- Read 2：70+ cycles
- 测序深度：30,000–50,000 reads/细胞
Part G-H：数据预处理
- 序列比对：SEQC pipeline 或 Cell Ranger
- 细胞过滤：
- 线粒体基因占比 > 20% → 排除
- 低文库复杂度 → 排除
- 空液滴过滤：CB2 算法
- Doublet 过滤：DoubletDetection
- 基因过滤：去除低表达基因
- 标准化/转换
- 批次校正：fastMNN
Part I：数据分析
图 5：数据分析流程图
图 5 说明：完整的数据分析流程，从原始数据到最终结果
关键分析步骤：
- 降维：PCA + Diffusion Map
- 聚类：Phenograph 算法
- 差异表达：MAST 回归模型
- 细胞注释：粗分类（免疫/上皮/成纤维/内皮）+ 细分类
- 癌细胞鉴定：SNV + CNV 分析（InferCNV）
- 可视化：UMAP + MAGIC 基因插补
细胞类型注释标记
粗分类
| 细胞类型 | 标记基因 |
|---|---|
| 免疫细胞 | PTPRC (CD45) |
| 上皮细胞 | EPCAM |
| 成纤维细胞 | COL1A1 |
| 内皮细胞 | CLDN5 |
细分类
免疫细胞：
- B 细胞：CD19, MS4A1, CD79A
- T 细胞：CD2, CD3D, CD3E
- NK 细胞：NCAM1, NCR1, NKG7
- 巨噬细胞：CD14, FCGR3A, ITGAM
上皮细胞：
- 神经内分泌：CHGA, CHGB, NCAM1, SYP
- 肺泡 I 型：AGER, CLIC5, PDPN
- 肺泡 II 型：SFTPC, SFTPD, MUC1
- 基底细胞：KRT5, TP63, AQP3
- 纤毛细胞：FOXJ1, CCDC78
- 杯状细胞：MUC5AC, MUC5B
关键注意事项
⚠️ 必须注意
- 缺血时间 < 1 小时：标本取出后尽快开始解离
- 冰上运输：标本置于 PBS 或培养基中，冰上保存
- 水平转子离心：除非特别说明
- LoBind 管：FACS 收集必须使用，减少细胞粘附
- 细胞活力 ≥ 80%：否则影响 scRNA-seq 质量
💡 技巧
- 肿瘤细胞占比低（0.1–10%）时，CD45 阴性分选可富集肿瘤细胞
- 细胞计数 < 50,000 时，CD45neg 与 CD45pos 合并
- 细胞活力 < 60% → 参考 Troubleshooting
与 Miltenyi 产品的关联
本 Protocol 的核心解离步骤完全依赖 Miltenyi 产品：
| 产品 | 作用 | 不可替代性 |
|---|---|---|
| Human Tumor Dissociation Kit | 酶混合液（Enzyme H/R/A） | 核心试剂 |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | 机械 + 酶解一体化 | 标准化程序 "37C_H_TDK3" |
| gentleMACS C tube | 专用反应管 | 匹配设备 |
| MACS SmartStrainers | 细胞过滤 | 70 μm/35 μm |
这是 Miltenyi 在人肺组织单细胞测序领域的标杆性 Protocol。
文献信息
| 字段 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | Protocol to dissociate, process, and analyze the human lung tissue using single-cell RNA-seq |
| 中文翻译 | 人肺组织单细胞 RNA 测序的解离、处理和分析 Protocol |
| 作者 | Álvaro Quintanal-Villalonga, Joseph M. Chan, Linas Mazutis, Charles M. Rudin 等 |
| 机构 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Vilnius University |
| 期刊 | STAR Protocols |
| 发表日期 | 2022 年 12 月 16 日 |
| 卷期 | Volume 3, Issue 4, 101776 |
| DOI | 10.1016/j.xpro.2022.101776 |
| PMCID | PMC9597186 |
| 开放获取 | CC BY |
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