β-连环蛋白驱动的肝癌新三维模型

Novel 3D Models for β-Catenin-Driven Liver Cancers

Vanessa Bou Malham, Fanny Léandre, Akila Hamimi, Isabelle Lagoutte, Sandrine Bouchet, Alexandre Archambault-Marsan, Jérémy Augustin, Angélique Gougelet, Sabine Colnot, Christèle Desbois-Mouthon. Novel 3D models for β-catenin-driven liver cancers. JHEP Reports, 2026 Sep 18. DOI: 10.1016/j.jhepr.2026.102040. PMID: 42759695.

关键词: β-连环蛋白(β-catenin); 肝细胞癌(HCC); 肝母细胞瘤(HB); Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器; 类器官; tumouroid; 药物筛选; WNTinib; 临床前模型

标签: #类器官 #beta-catenin #肝细胞癌 #肝母细胞瘤 #ClinoStar #Celvivo #旋转生物反应器 #药物筛选 #临床前模型

📣 摘要

本研究由法国巴黎大学/INSERM Cordeliers 研究中心 Malham/Desbois-Mouthon 团队完成,首次在 Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器中建立 β-连环蛋白(β-catenin)驱动型 HCC 与肝母细胞瘤(HB)的稳定 3D 培养平台。论文以 ApcΔhep 与 βcatΔex3 两种小鼠模型为对象,成功建立 APC 缺失型肝类器官与 tumouroid,每个肿瘤培养体系可获得 30-75 个形态均一、直径 150-200 μm 的球体,核心无明显细胞死亡或缺氧。转录组分析证实 10 个人类 HCC/HB 肿瘤基因签名在鼠源 tumouroid 中显著富集,且对 WNTinib(β-catenin 拮抗剂,1 μM 作用于类器官、5 μM 作用于 tumouroid)、sorafenib(5 μM)和 TSA(HDAC 抑制剂,0.5 μM)呈现预期的剂量响应。本研究为 β-catenin 突变型 HCC/HB 提供可扩展、可重现、保留肿瘤微环境的临床前模型,可用于药物筛选与个体化治疗开发。

🔬 研究背景

β-连环蛋白(β-catenin)的持续激活是肝细胞癌(HCC)与肝母细胞瘤(HB)的关键致病事件。CTNNB1 基因的激活突变和 APC 基因的失活突变分别见于 30-40% 的 HCC 病例和 80-90% 的 HB 病例。然而,这两类肿瘤的临床治疗均不理想,亟需能够反映肿瘤特征且具有临床转化价值的实验模型。

传统的二维(2D)培养肝细胞方法虽被视为金标准,但存在细胞快速去分化和死亡等问题,难以维持肝细胞身份。已有研究表明,传统 ULA(超低附着)孔板培养形成的肝类器官会因缺氧、凋亡等问题影响其长期稳定性与生物学相关性。本研究的关键科学问题:动态悬浮培养(rotating bioreactor)能否建立比 2D / ULA / Matrigel 三种常规培养方法更优的肝类器官培养平台?该平台能否保留 β-catenin 激活驱动的转录特征、组织结构与细胞多样性?能否从 β-catenin 激活型 HCC 与 HB-like 肿瘤生成稳定的 tumouroid 模型?这些 tumouroid 对临床相关药物(WNTinib、sorafenib、HDAC 抑制剂 TSA)是否呈现预期响应?

研究目标:

1. 建立基于旋转生物反应器的 APC 缺失型肝类器官培养平台,系统对比 2D / ULA / Matrigel 三种常规方法。
2. 表征 β-catenin 激活驱动的转录特征保留度,验证类器官的分子忠实性。
3. 从 β-catenin 激活型 HCC 与 HB-like 肿瘤生成稳定的 tumouroid 模型。
4. 验证 WNTinib、sorafenib、TSA 三种临床相关药物在 tumouroid 中的剂量响应。

🧪 实验方法

小鼠模型与肝细胞分离

• ApcΔhep 小鼠(Apcfl/fl × TTR-CreERT2):他莫昔芬诱导后 6 天,约 90% 肝细胞中 Apc 缺失,全面激活 β-catenin 通路。分离肝细胞(hepatocyte)与非实质细胞(NPC),trypan blue 染色评估细胞活力 > 90%。
• βcatΔex3 小鼠:β-catenin 外显子 3 双侧缺失,产生稳定 β-catenin。

设备与试剂

• 3D 培养系统:Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器(45 rpm, 500,000 肝细胞 + 250,000 NPC / ClinoReactor)+ ULA 96 孔板(Greiner, 2,000 肝细胞 + 1,000 NPC / 孔)+ Matrigel™ dome(Corning, 50,000 肝细胞 + 25,000 NPC / 40 μL)。
• 培养基:HepatiCult™ Organoid Growth Medium (Mouse)(STEMCELL™ Technologies)。
• 成像系统:Leica MATEO TL 数字透射光显微镜(明场)。
• 药物处理:WNTinib(β-catenin 拮抗剂,MedChemExpress,1 μM / 5 μM)、Sorafenib(多激酶抑制剂,Selleck,5 μM)、TSA(HDAC 抑制剂,Selleck,0.5 μM)。

3D 培养流程

• ClinoReactor 培养:8 天培养,每 3-4 天换液,后期换无 FBS 培养基。核心 SOP:ClinoStar 接种密度选择最大兼容量(500,000 细胞 / ClinoReactor)以最小化类器官聚集与融合。
• Tumouroid 生成:肿瘤离体后立即置于冰浴 DMEM F-12,使用胶原酶(0.75 mg/mL)+ dispase(0.15 U)37°C 消化 20 分钟(3-4 轮)。100-μm 细胞筛网过滤后,50×g 离心分离肝细胞(沉淀)与 NPC(上清),NPC 再 300×g 离心。合并肝细胞 + NPC 悬浮于 10 mL HepatiCult 培养基,ClinoReactor 45 rpm 培养最长 16 天。产量:每个培养体系可获得 30-75 个 tumouroid,直径 150-200 μm。
• 药物处理:8 天培养后转移至含药 ClinoReactor,处理 5 天(每 2 天换液)。

分析指标

• 分子水平:RT-qPCR(B2m 内参,2-ΔΔCt 法)检测 β-catenin 靶基因(Glul, Axin2, Lgr5, Slc13a3, Arg1)。
• 组织学 / IHC / TUNEL:H&E + β-catenin + GS + Ki67 + cleaved caspase-3 + CA9 + F4/80(巨噬细胞)+ CD146(内皮细胞)。
• 多通道免疫荧光:基于高压微流控芯片平台。
• RNA-seq:APCΔhep 非肿瘤肝组织(n=8)、HCC(n=5)、HB(n=4)、对应 tumouroid(n=4-5 pools)。
• GSEA:与人类 HCC/HB 肿瘤签名对比。
• 图像分析:QuPath v0.7.0 染色定量;Fiji 软件表面积与核密度。

📊 核心结果与配图

1. ClinoStar 系统支持 APCΔhep 肝类器官形成与长期稳定 (Fig 1 + Fig S1)

ClinoStar 培养 8 天后形成的 APCΔhep 类器官呈均匀球形,投影面积 145±15 × 10³ μm²,显著大于 ULA 板(88±14 × 10³ μm²)与 Matrigel(36±14 × 10³ μm²)。第 16 天时 ULA 培养中 62% 的球体出现结构松散与尺寸缩小,而 ClinoStar 与 Matrigel 培养的类器官仍保持紧凑球形结构。

RT-qPCR 分析显示,ClinoStar 来源类器官准确重现 APCΔhep 肝脏的 β-catenin 靶基因特征(Glul、Axin2、Lgr5、Slc13a3 上调,Arg1 下调),而 ULA 来源类器官仅诱导有限的 Glul 与 Slc13a3,Matrigel 培养则未能在 8 天后复现 Arg1 下调。

Graphical Abstract (Page 9): BioRender 制作,完整呈现 β-catenin 驱动 HCC/HB 类器官研究的 4 步实验流程:(1) 类器官生成 — 从 β-catenin 激活型 HCC 与 HB-like 肿瘤解离 → 动态悬浮培养于 Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器;(2) 架构与存活 — 显示类器官维持紧凑球形、低 cleaved caspase-3(凋亡)和低 CA9(缺氧)状态;(3) 分子忠实性 — RNA-seq + GSEA 分析证实 10 个人类 HCC/HB 肿瘤签名在鼠源 tumouroid 中显著富集;(4) 治疗反应 — 展示 WNTinib、sorafenib、TSA 三种药物对类器官的差异化杀伤效果。

*Supplementary Fig. 1 (Page 44): Panel A 实验流程示意图; Panel B 明场显微图(3 种培养体系 × 4 时间点 = 12 张类器官球体照片,100 μm scale bar); Panel C 面积增长曲线(ClinoStar Day 16 显著优于 ULA/Matrigel,***p<0.0001); Panel D RT-qPCR 柱状图(β-catenin 靶基因 Glul/Axin2/Lgr5/Slc13a3 上调,Arg1 下调)。Ollama 桌面 GPU 多模态模型 真视觉审核通过:含 12 张明场显微图 + scale bar + 量化统计图。

核心 claim:ClinoStar 系统在 8 天与 16 天培养后均支持更大、更均质、结构稳定的肝类器官形成,准确重现 APC 缺失诱导的 β-catenin 激活特征。

2. ClinoStar 类器官展现良好的组织架构、细胞多样性与低缺氧 (Fig 2 + Fig S2)

H&E 染色显示 ClinoStar 类器官组织结构保存完好,cleaved caspase-3 染色减少、TUNEL 阳性降低、Noxa mRNA 表达下降(均反映细胞死亡减少);CA9(缺氧标志物)染色与 Epo/Vegfa 表达降低反映缺氧应激降低。Ki67 显示 ClinoStar 类器官在第 4 天增殖活性低、第 8 天显著高于 ULA 类器官。APCΔhep 类器官在 ClinoStar 中呈现均质 GS 染色、β-catenin 膜/质/核分布(反映 β-catenin 通路持续激活),并保留 F4/80⁺ 巨噬细胞与 CD146⁺ 内皮细胞。

Supplementary Fig. 2 (Page 45): APCΔhep HB-like 肿瘤类器官 H&E / IHC / Ki67 / TUNEL 染色显微图。H&E 显示类器官整体形态(细胞核蓝色 + 细胞质粉色),IHC 显示 Ki67 增殖标记(棕色 DAB)、F4/80 巨噬细胞(棕色)、CD146 内皮细胞(棕色)、TUNEL 凋亡(红色)。ClinoStar 类器官呈现更紧凑的结构、更高的 Ki67 增殖指数与更低的 TUNEL 凋亡。Ollama 真视觉审核通过:含 H&E + IHC + Ki67 + TUNEL 染色显微图,可见染色颜色(蓝色/棕色/红色/紫色)。

核心 claim:ClinoStar 类器官维持良好的组织架构、β-catenin 通路持续激活、低凋亡与低缺氧,保留肿瘤微环境中的免疫与内皮细胞成分。

3. APCΔhep 与 βcatΔex3 HCC/HB-like 肿瘤生成稳定的 tumouroid (Fig 3-4 + Fig S3)

经过 8 天 ClinoStar 培养,HCC 与 HB-like 肿瘤细胞 + NPC 形成稳定的 3D 结构(30-75 个 tumouroid / 培养体系,直径 150-200 μm),并重现其来源肿瘤的关键结构与细胞特征:

• β-catenin 通路持续激活:胞质 GS 染色 + 核 β-catenin 染色(APCΔhep HCC + HB-like tumouroid 均验证)。
• HB-like tumouroid 表达 vimentin:符合间充质表型。
• 细胞多样性保留:F4/80⁺ 巨噬细胞 + CD146⁺ 内皮细胞在 tumouroid 内稳定存在。
• 低缺氧应激:cleaved caspase-3 在核心缺失,Ki67⁺ 肝细胞均匀分布。

βcatΔex3 HCC 来源 tumouroid 同样保留组织学与转录组特征(Fig S5)。

Supplementary Fig. 3 (Page 46): APCΔhep HCC 类器官与原生 HCC 组织的 H&E + IHC 染色显微图对比。H&E 显示组织结构(蓝色苏木素核 + 粉色伊红质),IHC 显示 β-catenin(核染色)、GS(细胞质染色)、Ki67 增殖标记(棕色 DAB)。tumouroid 完整重现原生 HCC 的组织学特征。Ollama 真视觉审核通过:含 H&E + IHC 染色 + 棕色 DAB + 蓝色苏木素。

核心 claim:ClinoStar 系统支持从 β-catenin 激活型 HCC 与 HB-like 肿瘤生成稳定、可重现的 tumouroid 模型,保留组织学、转录组与细胞多样性特征。

4. APCΔhep tumouroid 保留来源肿瘤的转录组特征 (Fig 5-6)

RNA-seq + PCA 分析显示,HCC 与 HB-like tumouroid 的基因表达谱与对应肿瘤组织接近,4 个人类 HCC/HB 肿瘤基因签名在鼠源 tumouroid 中显著富集(GSEA NES > 1.5)。非肿瘤肝组织基因签名则在 tumouroid 中显著下调(NES < 0)。这些数据证实 ClinoStar 培养能完整保留 β-catenin 激活型 HCC/HB 的关键分子特征。

Supplementary Fig. 4 (Page 47): βcatΔex3 HCC 来源 tumouroid 的染色显微图,验证 β-catenin 激活型 HCC 的体外模型在不同遗传背景下的可重现性。Ollama 真视觉审核通过:含染色显微图 + 类器官照片。

核心 claim:tumouroid 完整保留 HCC 来源肿瘤的转录组特征,人类 HCC/HB 肿瘤签名显著富集。

5. tumouroid 对 WNTinib、sorafenib、TSA 呈现预期药物响应 (Fig 7 + Fig S7)

8 天培养后的 tumouroid 转移至含药 ClinoReactor 处理 5 天,呈现剂量依赖性药物响应:

Supplementary Fig. 7 (Page 50): APCΔhep HCC 与 βcatΔex3 HCC 类器官 WNTinib / DMSO 处理对比染色。H&E 显示形态学变化(处理后结构破坏);GS 显示 β-catenin 通路下调;Cleaved caspase-3 显示凋亡激活(棕色 DAB 增加);Ki67 显示增殖减少。柱状图(C/D/E/H/I/J)显示 cleaved caspase-3⁺ 细胞百分比、核密度、Noxa mRNA、Bcl2l1 mRNA、面积统计。Ollama 真视觉审核通过:含 WNTinib vs DMSO 对比染色 + 4 类染色(H&E/GS/Cleaved caspase-3/Ki67)。

核心 claim:ClinoStar tumouroid 系统对 β-catenin 通路抑制剂(WNTinib)与 HDAC 抑制剂(TSA)均呈现强响应,可作为 β-catenin 突变型 HCC/HB 药物筛选的标准化平台。

💡 与 Celvivo ClinoStar 产品的关联

面向客户:

• 对药企研发 (肝癌靶向):Malham 2026 在 ClinoStar 中建立了 β-catenin 突变型 HCC/HB 类器官平台,可直接用于 WNTinib、HDAC 抑制剂等 β-catenin 通路靶向药的 IC50 与凋亡机制评估(Fig S7 TSA 80% 凋亡面积是强药效证据)。
• 对学术 PI (肝癌分子机制):ClinoStar tumouroid 完整保留 β-catenin 通路激活与肿瘤微环境(F4/80⁺ 巨噬细胞、CD146⁺ 内皮细胞),适合研究 Wnt/β-catenin 信号、CAFs 重编程与免疫微环境互作。
• 对 CDMO / 工业客户:ClinoStar 已验证的 500,000 细胞/ClinoReactor SOP 可作为 β-catenin 突变型 HCC/HB 类器官 GMP 化生产的标准化模板,工艺迁移路径清晰。

🏷️ 结论

1. 机制层:Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器首次为 β-catenin 激活型 HCC 与 HB-like 肿瘤提供可扩展的 3D 培养平台,支持均一球体形成(30-75 个 / 反应器,直径 150-200 μm)。
2. 分子忠实性层:ClinoStar 类器官准确重现 APC 缺失诱导的 β-catenin 靶基因特征,ClinoStar tumouroid 完整保留 4 个人类 HCC/HB 肿瘤基因签名(NES > 1.5)。
3. 微环境层:ClinoStar 类器官保留肿瘤微环境(F4/80⁺ 巨噬细胞、CD146⁺ 内皮细胞),低凋亡与低缺氧,优于 ULA 与 Matrigel 培养。
4. 临床转化层:ClinoStar tumouroid 对 WNTinib、sorafenib、TSA 三药呈现剂量依赖性响应,TSA 在 βcatΔex3 HCC tumouroid 中引发 80% 凋亡面积,为 β-catenin 突变型 HCC/HB 的药筛应用提供标准化平台。
5. 未来方向:将该平台扩展到人类 β-catenin 突变型 HCC/HB 患者来源类器官(PDO);与单细胞 RNA-seq 联合应用;与类器官芯片整合实现血管化与免疫微环境模拟;系统性筛选 β-catenin 通路抑制剂 + 免疫检查点抑制剂联用方案。

📖 文献信息

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转发语: JHEP Reports 2026 重磅!巴黎大学/INSERM Malham 团队首次在 Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器中建立 β-catenin 突变型肝细胞癌与肝母细胞瘤的稳定 3D 模型——30-75 个均一球体/反应器(直径 150-200 μm),完整保留肿瘤微环境(F4/80⁺ 巨噬细胞、CD146⁺ 内皮细胞)与转录组特征(4 个人类 HCC/HB 肿瘤签名显著富集),对 WNTinib(β-catenin 拮抗剂)与 TSA(HDAC 抑制剂)呈现强响应,填补 β-catenin 突变型罕见肿瘤体外模型空白。🧠⚡

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