无 Matrigel 肺肿瘤类器官建立与表征方案
来源文献: Dona F, Erratico S, Terracciano LM, et al. Protocol for the establishment and characterization of lung tumoroids from surgical resection without the use of Matrigel. STAR Protocols. 2025;6:103923.
DOI: 10.1016/j.xpro.2025.103923
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发表日期: 2025年9月19日
机构: 意大利 Humanitas 研究医院 · Humanitas 大学
核心内容
这篇 STAR Protocols 2025 论文提供了一套完整的无 Matrigel 肺肿瘤类器官建立和表征方案。该方案消除了对昂贵且动物来源的 Matrigel 的依赖，使用 ClinoStar 生物反应器进行悬浮培养，提高了类器官研究的可及性和可扩展性。
关键亮点
- 无 Matrigel 培养——消除了对 Matrigel 的依赖，降低成本和批次差异
- ClinoReactor 悬浮培养——使用 Celvivo ClinoReactor 进行动态悬浮培养
- 患者来源——从手术切除的肺癌组织直接建立类器官
- 完整的 IHC 表征——TTF-1、p40、CK7、CK5/6 等标志物验证
- 可推广性——方案可适配其他器官类型（如结肠癌）
核心步骤
1. 组织处理
手术切除的肺癌组织分为三部分：
- 固定/组织学：8% 福尔马林固定 12 小时，石蜡包埋
- 类器官建立：机械切碎 → 酶解（Collagenase IV + DNase I + Hyaluronidase）
- SNAP 冻存：液氮长期保存
图1 | 手术切除肺组织处理流程
2. 红细胞裂解
组织消化后，如果 pellet 呈红色（表明有红细胞），需要进行红细胞裂解：
图2 | 红细胞裂解前后对比
3. 类器官形成
- 铺板: 100,000 细胞/20 μL Matrigel 圆顶
- 培养: 约 2 周形成肿瘤类器官（患者特异性）
- 传代: 当圆顶融合时进行传代
图3 | 肺肿瘤类器官形成
4. 转移到 ClinoReactor 悬浮培养
- 消化圆顶中的类器官
- 转移到 ClinoReactor 中进行无 Matrigel 悬浮培养
- 维持平行圆顶培养作为备份
图4 | 从静态圆顶到 ClinoReactor 悬浮培养的转移
5. 免疫组化表征
- 石蜡包埋: 使用 HistoGel 处理类器官
- 抗原修复: Tris-EDTA 缓冲液
- 染色: TTF-1、p40、CK7、CK5/6 等
- 比较: 与原发肿瘤 FFPE 切片比较，验证类器官保留关键特征
图5 | 肺肿瘤类器官免疫组化表征
对 Celvivo/类器官研究的意义
无 Matrigel 培养的优势
| 特性 | Matrigel 培养 | 无 Matrigel (ClinoReactor) |
|---|---|---|
| 成本 | 高（动物来源，批次差异） | 低（化学成分确定） |
| 可扩展性 | 有限 | 高（生物反应器） |
| 剪切力控制 | 无 | 有（动态培养） |
| 气体交换 | 受限 | 优化 |
| 高通量 | 困难 | 容易 |
Celvivo ClinoReactor 应用
- 动态悬浮培养: 模拟体内微环境，提供更好的气体和营养交换
- 无 Matrigel: 消除动物来源成分，提高实验可重复性
- 可扩展: 适合大规模药物筛选和个性化医疗
关键试剂与培养基
肺培养基配方
| 成分 | 终浓度 |
|---|---|
| B27 supplement | 1X |
| Nicotinamide | 10 mM |
| N-acetyl-l-cysteine | 1.25 mM |
| A83-01 | 500 nM |
| FGF-10 | 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | 100 ng/mL |
| R-spondin 1 | 500 ng/mL |
| FGF-7 | 25 ng/mL |
| SB202190 | 10 μM |
| Rock inhibitor | 10 μM |
关键抗体
| 抗体 | 用途 | 稀释度 |
|---|---|---|
| TTF-1/NKX2.1 | 肺腺癌标志物 | 1:200 |
| p40 (ΔNp63) | 鳞状细胞癌标志物 | 1:100 |
| Cytokeratin 7 | 腺上皮标志物 | 1:800 |
| Cytokeratin 5/6 | 基底细胞标志物 | 1:500 |
论文信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | Protocol for the establishment and characterization of lung tumoroids from surgical resection without the use of Matrigel |
| 期刊 | STAR Protocols |
| 发表日期 | 2025年9月19日 |
| DOI | 10.1016/j.xpro.2025.103923 |
| 第一作者 | Federico Dona, Silvia Erratico |
| 通讯作者 | Salvatore Piscuoglio |
| 合作机构 | Humanitas 研究医院 · Humanitas 大学 |
| 关键技术 | 肺肿瘤类器官、ClinoReactor、无 Matrigel 培养、IHC 表征 |
联系人｜李东伟
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