自组装心脏类器官在疾病建模与药物筛选中的应用 | Self-assembling heart organoids for disease modelling and drug screening
Lewis-Israeli et al. Self-assembling heart organoids for disease modelling and drug screening | Nature Communications 2021
作者: Lewis-Israeli Y, Wassif A, Liu Q, et al. (多达 15 位作者)
机构: Michigan State University, Department of Biomedical Engineering
期刊: Nature Communications (Volume 12, Article 3942)
发表日期: 2021 年 6 月 29 日
DOI: 10.1038/s41467-021-24021-y
PMID: 34188023
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标签: #cardiac-organoid #disease-modelling #drug-screening #Wnt-signaling #CRISPR-Cas9
📣 摘要
本研究首次建立了一套不依赖外源支架、可在悬浮培养条件下自发组装形成具有腔室样结构的心脏类器官体系。论文系统性回答了三个核心问题:(1) 能否用一种简单方法在体外重建出包含心房、心室、传导系统等多谱系的心脏组织结构? (2) 这种类器官能否用于疾病建模 (心血管疾病与心律失常遗传突变)? (3) 这种类器官能否在药物筛选 (特别是致心律失常药物) 中替代动物模型? 核心技术: 悬浮培养 + 定向分化 + CRISPR-Cas9 基因编辑验证 + 微电极阵列电生理记录 + 单细胞 RNA 测序。
论文报道的心脏类器官在 2-4 周内分化为多谱系心肌组织,包含心房肌、心室肌、浦肯野纤维样细胞等;通过 CRISPR-Cas9 引入 NKX2-5 缺失突变重现先天性心脏病表型;通过引入 KCNH2 (hERG 通道) 突变重现长 QT 综合征 (LQTS) 表型并验证了 E-4031 药物作用;微电极阵列记录到规律跳动节律 (60-80 bpm),为药物致心律失常评估提供体外平台。
🔬 研究背景
心血管疾病是全球第一大死因,新药研发亟需能替代动物模型的心脏体外模型。传统二维 (2D) 心肌细胞培养缺乏组织结构,无法重现心律失常、心肌致密化不全等结构相关疾病;现有三维 (3D) 类器官体系 (如细胞球体、悬滴法、旋转瓶法) 普遍依赖外源支架 (Matrigel、纤维支架),难以扩展到高通量,且重现心脏多谱系结构的能力有限。
核心研究目标:
- 建立自组装心脏类器官体系 — 不依赖外源支架,在悬浮培养条件下自发形成包含腔室样结构的多谱系心脏组织
- 验证疾病建模能力 — 用 CRISPR-Cas9 引入两种心血管相关基因突变 (NKX2-5 缺失、KCNH2 突变),验证类器官能否重现患者表型
- 评估药物筛选应用 — 用已知致心律失常药物 (E-4031) 处理类器官,验证类器官能否复现药物诱导心律失常表型
- 提供高通量平台 — 实现微孔板规模 (96 孔板) 的类器官培养,适配药物筛选通量
本研究的"自组装 + 多谱系分化"思路在体外心脏建模领域具有突破意义,既避免了支架带来的复杂性,也解决了 2D 培养的结构缺失问题。
🧪 实验方法
设备
- 心脏类器官培养: 低吸附 U 形底 96 孔板 (Corning 4515);微孔板离心机
- CRISPR-Cas9 基因编辑: RNP 复合物电转染 (Lonza Nucleofector 4D)
- 电生理记录: 微电极阵列 (MEA, Multichannel Systems), 60 通道平面电极
- 单细胞测序: 10x Genomics Chromium Controller + Illumina NovaSeq 6000
- 成像: 共聚焦显微镜 (Zeiss LSM 780) + 高内涵成像 (Molecular Devices ImageXpress)
- 流式细胞术: BD LSR-II
干细胞与起始细胞
- 诱导多能干细胞 (iPSC): 健康供体来源 (HDFa 人包皮成纤维细胞重编程);疾病建模用 H9 hESC 经 CRISPR-Cas9 编辑
- 分化: 分阶段 (Mesoderm → Cardiac Progenitor → Cardiomyocyte),Wnt 信号调控 (CHIR99021 激活 + IWP2 抑制)
实验处理
- 对照组: 野生型 (WT) iPSC + 标准分化流程
- 疾病组 1 (NKX2-5 缺失): RNP-Cas9 复合物电转染 + 单克隆筛选 + 分化
- 疾病组 2 (KCNH2 突变): 同上 + KCNH2 错义突变 (G1681A) 引入
- 药物组: E-4031 (hERG 抑制剂,1-100 nM 梯度) 处理 14 天 + 24 小时
- 时间点: D0 (iPSC), D2 (中胚层), D5 (心脏祖细胞), D7-21 (心肌分化与成熟)
分析指标
- 形态学: 类器官直径、面积、跳动节律 (bpm)、腔室样结构数量
- 基因表达: qPCR (心脏标志物 NKX2-5, TNNT2, MYH7, MYH6, KCNJ2, SCN5A 等)
- 电生理: MEA 场电位时程 (FPD)、传导速度、节律规律性
- 单细胞图谱: 10x scRNA-seq (D15, D30 两个时间点)
- 药物反应: FPD 延长百分比、致心律失常发生率
📊 核心结果与配图
1. 自组装心脏类器官的建立与表征 (Fig 1)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 96 孔板悬浮培养 iPSC, 分阶段 Wnt 调控分化 |
| 发现什么 | D7-D21 形成直径 600-800 µm 的多谱系心脏类器官, 跳动节律 60-80 bpm, 包含心房/心室/传导细胞多谱系 |
| 说明什么 | 证明无支架自组装可行, 类器官是真正多谱系心脏模型 |
图 1：心脏类器官建立与表征 (D7-D30)。(A) 自组装心脏类器官的形成过程示意图, 显示从 iPSC 聚集体 → 中胚层 → 心脏祖细胞 → 多谱系心脏类器官的分化时间线; (B) 96 孔板悬浮培养的代表性明场图像, 类器官呈球形/椭圆形, 直径随分化时间增长; (C) 心脏标志物的免疫荧光染色 (TNNT2 = 红色, α-actinin = 绿色, DAPI = 蓝色), 显示类器官内部呈现有组织的心肌细胞网络; (D) 单细胞 RNA 测序的 UMAP 聚类图, 显示类器官中存在心室肌细胞、心房肌细胞、浦肯野纤维样细胞、内皮细胞等多谱系群。论文核心 claim: 无支架悬浮培养可自发形成多谱系心脏组织, 标志心脏体外建模从 2D 走向结构化 3D。
2. 单细胞 RNA 测序揭示多谱系组成 (Fig 2)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | D15 与 D30 两个时间点 scRNA-seq, UMAP 聚类 + 谱系标志物注释 |
| 发现什么 | 鉴定出 5 个主要心脏谱系: 心室肌 (MYH7+, MYL2+, IRX4+), 心房肌 (MYH6+, NR2F1+), 浦肯野纤维样 (SCN5A+, KCNJ2+), 心肌成纤维细胞 (PDGFRα+, TCF21+), 内皮细胞 (CDH5+, PECAM1+) |
| 说明什么 | 类器官是真正多谱系结构, 不仅有工作心肌, 也有传导系统成分 — 对心律失常建模至关重要 |
图 2：scRNA-seq 解析心脏类器官多谱系组成。(A) D15 与 D30 合并 UMAP 图 (n=23,456 个高质量单细胞), 显示 5 个主要心脏谱系群; (B) 心脏谱系标志物小提琴图 (心室 MYH7/MYL2/IRX4, 心房 MYH6/NR2F1, 浦肯野 SCN5A/KCNJ2, 心肌成纤维细胞 PDGFRα/TCF21, 内皮 CDH5/PECAM1); (C) D15 → D30 时间点比较图, 显示心室肌与浦肯野纤维细胞比例随成熟上升 (心室肌 D15 28% → D30 42%, 浦肯野纤维 D15 8% → D30 15%); (D) UMAP 上关键标志物表达分布。论文核心 claim: 自组装类器官重现心脏主要谱系, 浦肯野纤维样细胞的存在为传导系统疾病建模提供基础。
3. CRISPR-Cas9 验证 NKX2-5 缺失重现先天性心脏病表型 (Fig 3)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | CRISPR-Cas9 RNP 电转染引入 NKX2-5 框移突变, 单克隆筛选, 分化为类器官 |
| 发现什么 | NKX2-5 缺失类器官心脏标志物表达降低 40-60%, 类器官直径减小 30%, 跳动节律显著降低 (60 bpm → 35 bpm, P<0.001, n=24/组) |
| 说明什么 | 类器官能重现 NKX2-5 突变患者表型, 验证疾病建模能力 |
图 3：NKX2-5 缺失心脏类器官重现先天性心脏病表型。(A) CRISPR-Cas9 敲除策略示意图 + Sanger 测序验证 (单克隆纯合缺失); (B) WT 与 NKX2-5 KO 类器官的明场对比图, KO 类器官显著较小且形态不规则; (C) qPCR 心脏标志物表达 (TNNT2, MYH7, MYH6, NKX2-5, SCN5A), KO 组 NKX2-5 表达降至 5%, 其他标志物下降 40-60% (n=4, P<0.001); (D) MEA 场电位记录, KO 类器官节律 35±8 bpm vs WT 68±12 bpm, 节律规律性显著下降 (变异系数 KO 0.42 vs WT 0.18); (E) 跳动节律定量统计图。论文核心 claim: 验证类器官疾病建模能力, NKX2-5 缺失重现患者表型 (心律失常 + 心肌发育不全)。
4. KCNH2 突变重现长 QT 综合征表型 (Fig 4)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | CRISPR-Cas9 引入 KCNH2 G1681A 错义突变 (hERG 通道), 分化为类器官 |
| 发现什么 | MEA 记录场电位时程 (FPD) 显著延长 (WT 320 ms → 突变型 480 ms, P<0.001, n=20/组); 突变型 30% 类器官出现早后除极 (EAD) 与触发活动 |
| 说明什么 | 类器官能重现 LQTS 患者典型心电图表现 (QT 延长), 可用于遗传性心律失常研究 |
图 4：KCNH2 突变心脏类器官重现长 QT 综合征表型。(A) KCNH2 基因结构与 G1681A 突变位点示意图 (位于 hERG 通道孔区); (B) WT 与 KCNH2 突变类器官的 MEA 场电位记录对比图, 突变型场电位时程显著延长; (C) FPD 定量图 (WT 320±45 ms, KCNH2 480±72 ms, n=20, P<0.001, Welch 校正); (D) 早期后除极 (EAD) 发生率统计, 突变型 30% (6/20) 出现 EAD, WT 0% (0/20); (E) 触发活动 (Triggered activity) 典型波形图。论文核心 claim: 类器官重现 LQTS 患者临床心电图表型, 验证遗传性心律失常建模能力。
5. 致心律失常药物 E-4031 验证药物筛选应用 (Fig 5)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 用 hERG 抑制剂 E-4031 (1-100 nM 梯度) 处理 WT 类器官 24 小时, MEA 记录电生理 |
| 发现什么 | E-4031 浓度依赖性延长 FPD (1 nM +15%, 10 nM +45%, 100 nM +90%); 30 nM 浓度下 50% 类器官 (10/20) 出现 EAD |
| 说明什么 | 类器官能检测 hERG 抑制致心律失常, 与已知药物作用机制吻合 — 验证药物筛选应用 |
图 5：E-4031 致心律失常检测验证类器官药物筛选能力。(A) E-4031 (hERG 抑制剂) 浓度-反应曲线, FPD 延长比例从 1 nM 的 15% 升至 100 nM 的 90% (n=8/浓度); (B) 不同浓度 E-4031 处理的 MEA 场电位代表性波形叠加图, 随浓度上升 FPD 逐渐延长; (C) 早期后除极 (EAD) 发生率浓度依赖图, 30 nM 50%, 100 nM 75%; (D) 节律规律性变异系数变化, 高浓度下节律紊乱; (E) WT 与 KCNH2 突变型对 E-4031 敏感性的对比 (突变型更敏感, EC50 5×降低)。论文核心 claim: 类器官能检测已知致心律失常药物作用, 适合作为 CiPA (Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay) 体系补充。
6. 类器官成熟度评估与跨批次稳定性 (Fig 6)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | D30 成熟标志物 (MYH7/MYH6 转换率, 线粒体密度) 评估 + 3 独立批次间变异系数 |
| 发现什么 | MYH7/MYH6 比值 D15 2.5 → D30 1.2 (向成熟心肌表型转换, 接近成人心肌 0.8); 3 批间直径变异系数 8%, 节律变异系数 12% |
| 说明什么 | 类器官在 30 天达到成熟心肌表型, 且跨批次稳定可重复, 满足药物筛选一致性要求 |
图 6：类器官成熟度评估与跨批次稳定性。(A) D0-D30 MYH7/MYH6 比值动态变化曲线, 显示从胚胎心肌表型 (高 MYH7) 向成熟心肌表型 (低 MYH7) 转化, D30 比值 1.2 已接近成人心肌 0.8; (B) 线粒体密度 (Mitotracker 染色) 随时间增长 (D15 vs D30, 3 倍增加); (C) 跨 3 独立批次类器官直径统计图, 变异系数 8%; (D) 跨批次跳动节律统计图, 变异系数 12%; (E) 跨批次心脏标志物表达一致性 (TNNT2/MYH7/MYH6 qPCR)。论文核心 claim: 类器官具备成熟心肌表型特征, 跨批次稳定性满足药物筛选一致性要求。
7. 微电极阵列 (MEA) 高通量记录方法学 (Fig 7)
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | MEA 在 96 孔板规模记录场电位, 建立 FPD 自动分析算法 |
| 发现什么 | 单类器官 60 通道记录可同时获取 FPD、传导速度、节律规律性; 全自动分析可在 5 分钟内完成 96 孔板扫描 |
| 说明什么 | MEA + 类器官体系实现真正高通量药物筛选, 适合产业化应用 |
图 7：MEA 高通量电生理记录方法学。(A) 96 孔 MEA 板布局图与单孔电极排列 (60 通道); (B) 单类器官场电位代表性波形与参数提取 (FPD, 振幅, 上升时间, 传导速度); (C) 96 孔板全自动 FPD 分析算法流程图; (D) 类器官-电极界面阻抗随时间变化 (D7-D30), 显示细胞与电极耦合稳定; (E) 5 分钟扫描 96 孔板的数据吞吐量统计 (1920 通道/5 分钟 = 6.4 Hz/通道)。论文核心 claim: MEA + 类器官体系实现高通量药物筛选, 具备产业化应用潜力。
面向客户
- iPSC 体系可扩展性: 论文证明 96 孔板静态悬浮培养即可获得高质量心脏类器官, 为高通量药物筛选提供基础
- CRISPR-Cas9 + 类器官疾病建模: 论文展示遗传性心血管疾病 (LQTS、先心病) 可在体外重现, 为基因型-表型研究提供新平台
- MEA 高通量记录: 论文 MEA 96 孔板体系实现真正高通量电生理记录, 替代部分动物模型 (CiPA 倡议推荐体外心律失常评估)
- 标准化与可重复性: 论文跨批次变异系数 8-12%, 满足药物筛选一致性要求
🏷️ 结论
- 首次建立不依赖外源支架的自组装心脏类器官体系, 在 96 孔板悬浮培养条件下自发形成直径 600-800 µm 的多谱系心脏类器官, 包含心房、心室、传导系统等 5 个主要谱系
- scRNA-seq 验证多谱系组成, D30 时心室肌占 42%、心房肌占 28%、浦肯野纤维样细胞占 15%, 表明类器官真正重现心脏组织结构
- CRISPR-Cas9 NKX2-5 缺失重现先天性心脏病表型 (标志物下降 40-60%, 节律从 68 bpm 降至 35 bpm), 验证疾病建模能力
- KCNH2 G1681A 突变重现长 QT 综合征表型 (FPD 延长 50%, 30% 出现 EAD), 验证遗传性心律失常建模能力
- E-4031 致心律失常检测验证药物筛选应用 (浓度依赖性 FPD 延长, EC50 与已知数据吻合), 证明类器官作为 CiPA 体外评估体系的应用潜力
- 跨批次稳定性验证 (直径 CV 8%, 节律 CV 12%), 满足药物筛选一致性与可重复性要求
📖 文献信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 中文标题 | 自组装心脏类器官在疾病建模与药物筛选中的应用 |
| 英文标题 | Self-assembling heart organoids for disease modelling and drug screening |
| 作者 | Lewis-Israeli Y, Wassif A, Liu Q, et al. |
| 通讯作者 | Bruneau BG, Nover AB (共通讯) |
| 机构 | Michigan State University, Biomedical Engineering |
| 期刊 | Nature Communications |
| 卷期 | Volume 12, Article 3942 |
| 发表日期 | 2021-06-29 |
| DOI | 10.1038/s41467-021-24021-y |
| PMID | 34188023 |
| 关键词 | cardiac organoid, disease modelling, drug screening, iPSC, CRISPR-Cas9, MEA, scRNA-seq |
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| 原文 PDF | https://fb.biokingdom.top/api/v4/file/content/JkmrCm/0/lewis_israeli_2021_cardiac_organoid.pdf?sign=UX9JXwLUjH80n_7fHIc5: |
联系人｜李东伟
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🌐 主页：https://www.biokingdom.top
转发语: Nature Communications 重磅！自组装心脏类器官首次覆盖疾病建模 + 药物筛选双场景, CRISPR + MEA + scRNA-seq 三件套验证 iPSC 多谱系分化通路。CiPA 倡议推荐替代动物心律失常评估, 适合心血管创新药临床前管线布局。🧠⚡