高通量人源肝脏类器官-微流控芯片平台：用于肝病建模与纳米药物筛选
Defu Kong, Shihang Yu, Janette Heegsma, Tjasso Blokzijl, Tian Qin, Yixiao Pan, Hans Blokzijl, Vincent E. de Meijer, Yourong Duan, Klaas Nico Faber*, Qiang Xia*, Kang He* | Journal of Nanobiotechnology (2026) 24:583 | DOI: 10.1186/s12951-026-04477-0
标签: #肝脏类器官 #OrganoPlate #器官芯片 #MAFLD #胆汁淤积型肝损伤 #纳米药物筛选 #肝脏分区 #上海交大 #UMCG
一、做什么 🔬
研究背景：肝脏疾病（尤其是代谢相关脂肪性肝病 MAFLD）影响全球数亿人，现有药物研发面临严峻瓶颈——传统啮齿类动物模型难以复现人类特异性疾病机制，肝细胞系丧失组织结构，原代肝细胞在体外迅速失功能，移植供肝稀缺。在纳米医学这一新兴领域，物种间肝清除与屏障功能差异更是让啮齿类数据向人体外推时常常失效。现有肝脏类器官虽能在 Matrigel 中长期扩增并分化为肝细胞与胆管上皮，但仍处于静态三维培养状态——缺乏生理性流体灌注、胆汁网络和极化微环境，无法支撑胆汁酸转运、胆汁淤积性损伤等依赖组织极化的关键过程建模。肝脏芯片（Liver-on-Chip）虽有灌注优势，但既往系统多依赖原代肝细胞、肝癌细胞系或 iPSC 来源的肝细胞样细胞，长期稳定性、可扩展性和功能成熟度均受限。人源组织来源的肝脏类器官与微流控芯片的系统整合仍是空白。
核心问题：
- 问句1：能否将人源肝脏组织来源的类器官规模化整合进灌注型高通量微流控芯片？
- 问句2：在持续灌注下类器官能否分化形成具有功能性胆汁毛细管网络的成熟肝细胞样结构？
- 问句3：该平台能否复现药物诱导胆汁淤积性肝损伤的关键表型（曲格列酮模型）？
- 问句4：该平台能否建模早期 MAFLD 表型（脂滴积聚、脂质合成上调、ROS 升高）？
- 问句5：该平台能否用于纳米治疗药物（如姜黄素脂质体）的高通量肝毒性筛选与疗效评价？
研究模型：
- 健康人肝组织来源的肝脏类器官（LGR5+ 肝祖细胞衍生），3 个独立供体
- OrganoPlate 3-lane 微流控平台（Mimetas，40 chip 单元 / 板）
- 体外 HepLoC（Hepatic Liver-on-Chip）模型
技术路线：
- 类器官建立：LGR5+ 肝祖细胞在 Matrigel 3D 中扩增，传至 P3-P15 仍稳定
- 芯片接种：单细胞化类器官细胞接种于 OrganoPlate 顶层通道，与 ECM 凝胶通道相邻
- 灌注培养：OrganoFlow® S 摇床平台，倾斜 7°（分化阶段 14°），间隔 8 min 摆动，37℃ 5% CO₂
- 肝向分化：BMP7 预诱导 → 分化培养基（DM）成熟相培养 7 天
- 跨学科表征：qPCR、免疫荧光、ELISA（ALB/AAT/尿素）、TEM、CDFDA 胆汁网络活细胞成像、Bulk RNA-seq、GSEA、BODIPY 脂滴染色
- 疾病建模与药筛：曲格列酮（TGZ）诱导胆汁淤积；FFA（油酸 + 棕榈酸）诱导 MAFLD；4 种参考肝毒物 + 3 种 MAFLD 候选药 + 姜黄素脂质体
二、发现什么 📊
核心发现 1：HepLoC 平台建立——类器官细胞在芯片上形成成熟 3D 腔管结构
图1：人源 LGR5+ 肝祖类器官（EM 扩增）→ 单细胞化 → 接种 OrganoPlate 顶层通道 → 摇床灌注培养 7 天 → HepLoC 成型。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 用 LGR5+ 肝祖类器官（来自 3 个独立健康供体）单细胞化后接种于 OrganoPlate 3-lane 顶层通道，底层通道培养基灌注；7 天后评估 3D 腔管形成情况 |
| 发现什么 | HepLoC 顶层通道形成连续细胞管（直径约 50 μm），DAPI 染色显示管腔结构；150 kDa FITC-葡聚糖灌注显示屏障完整性（8 min 内渗漏有限）；KI67 阳性显示细胞保留增殖能力 |
| 说明什么 | 这是首个规模化将人源组织来源肝脏类器官整合进灌注型微流控平台的报告——既往 LoC 系统多用 iPSC/原代/癌细胞系，本工作用的是可长期稳定扩增的 LGR5+ 祖细胞来源类器官 |
核心发现 2：HepLoC 显著提升类器官向成熟肝细胞的分化效率
图2：肝类器官细胞在芯片顶层通道形成 3D 腔管（上/下层图像、DAPI 核染最大密度投影、KI67 增殖标记、150 kDa FITC-葡聚糖屏障实验）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将 HepLoC 与传统 HepOrg（Matrigel 3D 培养）以及 LoC（芯片但未分化）对比，qPCR 测肝成熟标志物、ELISA 测分泌功能、免疫荧光看极化定位 |
| 发现什么 | HepLoC 中 ALB/HNF4A mRNA 显著上调（接近 PH 原代肝细胞水平），LGR5 干性标志几乎消失；分泌 ALB/AAT/尿素/氨清除均显著高于 HepOrg 和 LoC；MRP2/BSEP 极化定位至细胞膜（LoC 中无） |
| 说明什么 | 与传统 Matrigel 静态培养相比，灌注型微流控环境是肝细胞成熟度跃升的关键驱动因素；这是首次在 LGR5+ 类器官体系中复现接近原代肝细胞的极化转运能力 |
核心发现 3：Bulk RNA-seq 证实 HepLoC 拥有更完整的肝特异性转录组特征
图3：qPCR 验证 LGR5/KRT19/HNF4A/ALB 表达（HepLoC vs HepOrg vs LoC vs 原代肝细胞 PH）、ALB/AAT/尿素/氨清除定量、LGR5+MRP2/KRT19+BSEP/ALB+HNF4A 共染免疫荧光。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对 3 个供体的 HepLoC 与 HepOrg 做 Bulk RNA-seq，PCA + 火山图 + 组织/细胞类型特异性 GSEA + GO/KEGG 富集 |
| 发现什么 | PCA 显示两组明显分离；HepLoC 中肝特异性基因（SAA2/SAA/GC/CYP3A5/ALB/ADH6）显著上调；KEGG 富集到 CYP450 代谢、胆汁酸代谢、脂质转运、酒精性肝病、Wnt 通路；组织富集分析显示 HepLoC 几乎无非肝标志物污染 |
| 说明什么 | 转录组层面的肝特异性大幅提升不是几个标志物偶然升高，而是整个肝功能程序被重新激活；为 HepLoC 作为"接近原代肝细胞"的体外模型提供了多组学证据 |
核心发现 4：HepLoC 形成功能性胆汁毛细管网络——胆汁淤积建模的形态学基础
图4：HepLoC vs HepOrg PCA、火山图（肝富集基因标红/蓝）、组织/细胞类型 GSEA、GO/KEGG 富集、CYP450/脂质转运/胆汁酸代谢热图。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 用 CDFDA（5-(and-6)-carboxy-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯）活细胞成像 + TEM 表征 HepLoC 中胆汁毛细管网络；CDFDA 被动扩散入细胞 → 酯酶水解为荧光 CDF → 经 MRP2 外排至胆汁毛细管 |
| 发现什么 | HepLoC 在 5 min 时间序列上呈现典型的胆汁网络荧光信号；TEM 证实 HepLoC 紧密连接显著大于 LoC、胆汁毛细管腔增大、细胞表面观察到纤毛——成熟肝细胞的形态学标志 |
| 说明什么 | 这是体外首次在 LGR5+ 类器官来源肝细胞中复现功能性胆汁网络——为胆汁淤积性肝病建模（既往 LoC 系统普遍缺乏）打开了大门；纤毛的出现说明极化方向正确建立 |
核心发现 5：曲格列酮（TGZ）处理复现胆汁淤积性肝损伤关键表型
图5：CDFDA 进入肝细胞→被 MRP2 外排至胆汁网络（示意图）、LoC vs HepLoC 时间序列 CDFDA 信号、TEM 显示紧密连接/胆汁毛细管/纤毛。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 用已知胆汁淤积药物曲格列酮（TGZ）处理 HepLoC 6 h，梯度浓度检测 LDH/PrestoBlue、MRP2/ZO-1 免疫荧光、CDFDA 实时转运、TEM |
| 发现什么 | TGZ 浓度依赖性降低细胞活力、升高 LDH；MRP2 由质膜重定位至胞质（转运功能受损）；ZO-1 由紧密连接处移位；CDFDA 外排至胆汁网络显著减少；TEM 证实紧密连接破坏 |
| 说明什么 | HepLoC 复现了 TGZ 临床已知的胆汁淤积机制（BSEP/MRP2 抑制、紧密连接破坏、胆汁酸外排障碍）；证明该平台能用作药物诱导胆汁淤积性肝损伤的体外模型 |
核心发现 6：HepLoC 复现早期 MAFLD 表型——脂代谢紊乱的体外建模
图6：TGZ 作用机制示意（BSEP/MRP2 抑制）、剂量-反应曲线、MRP2+ZO-1 重定位、CDFDA 转运障碍、TEM 紧密连接破坏。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 用 FFA 混合物（油酸 500 μM + 棕榈酸 250 μM）处理 HepLoC 3 天诱导脂质积聚；检测脂滴、TG 含量、脂代谢基因（PPARα/ACACA/FASN）、BODIPY、ROS |
| 发现什么 | FFA-HepLoC 出现明显胞质暗色脂滴；TG 含量显著升高；ACACA/FASN 上调、PPARα 下调（脂代谢程序失衡）；BODIPY 染色证实脂滴；ROS 升高；细胞活力基本保留——符合早期 MAFLD 表型 |
| 说明什么 | HepLoC 能复现早期 MAFLD 的关键代谢紊乱而不直接进入细胞死亡阶段——这是 MAFLD 体外建模的核心难点（既往模型要么太严重直接死、要么没表型） |
核心发现 7：HepLoC 区分纳米载体肝毒性谱——DSPE-PEG2000 安全、DOTAP 阳离子脂质毒性最强
图7：HepLoC 与 FFA-HepLoC 相差显微图、TG 含量、PPARα/ACACA/FASN/TNFA/IL6 qPCR、GSEA（脂肪酸代谢/氧化磷酸化/TNFA-NFκB）、BODIPY 脂滴、ROS 染色。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 用 4 种参考肝毒物（对乙酰氨基酚、四环素）+ 3 种 LNP 脂质（DSPE-PEG2000、DOTAP chloride、D-Lin-MC3-DMA）+ 3 种 MAFLD 候选药（非诺贝特、奥贝胆酸、rhFGF19）+ 姜黄素脂质体 vs 游离姜黄素做 2 天暴露剂量-反应 |
| 发现什么 | DSPE-PEG2000 生物相容性优良；DOTAP 阳离子脂质剂量依赖性肝毒（膜破坏机制）；D-Lin-MC3-DMA 治疗窗口安全、高剂量毒性；FFA-HepLoC 上 3 种候选药显著降低脂滴积聚且无肝毒；姜黄素脂质体 vs 游离姜黄素，脂质体效力显著提升 |
| 说明什么 | HepLoC 能区分已知阳离子 vs 中性 vs 离子化脂质的纳米毒性特征——这是临床前 LNP 配方优化的关键筛选维度；姜黄素脂质体案例展示了该平台在纳米药物疗效-毒性联合评价中的实际用途 |
核心发现 8：HepLoC 在纳米药筛选中具备临床转化级别的判别能力
图8：HepLoC 上对乙酰氨基酚/四环素/Fenofibrate/Obeticholic acid/rhFGF19/Curcumin/Curculosomes 剂量-反应曲线、BODIPY 脂滴、TG 含量定量。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在 FFA-HepLoC 上对 3 种临床前 MAFLD 候选药（非诺贝特、奥贝胆酸、rhFGF19）做抗脂肪变性筛选；同时比较姜黄素脂质体 vs 游离姜黄素 |
| 发现什么 | 3 种候选药均显著降低脂滴积聚和 TG 含量且无明显肝毒——模型对治疗干预有生理响应；姜黄素脂质体脂质清除效力显著优于游离姜黄素（溶解度限制 → 纳米载体递送增益） |
| 说明什么 | 这是 HepLoC 在 MAFLD 候选药 + 纳米制剂疗效评价中的"双重用途"案例——临床前转化医学的实用工具；姜黄素脂质体的案例直接呼应了纳米医学领域"载药平台可显著提升疏水药物细胞内递送"的核心命题 |
三、说明什么 💡
领域意义：本研究首次将人源组织来源 LGR5+ 肝脏类器官（而非 iPSC/原代/癌细胞系）规模化整合进高通量 OrganoPlate 微流控芯片——填补了"可长期扩增的成体肝祖细胞 + 灌注型芯片"这一空白。既往 LoC 系统普遍依赖原代肝细胞（供体稀缺、迅速失功能）或 iPSC（成熟度不足）或癌细胞系（功能不全），HepLoC 提供了第三条路径——既能像类器官一样长期扩增（数月稳定传代），又能在芯片灌注下达到接近原代肝细胞的成熟度与极化转运能力（MRP2/BSEP 膜定位、功能性胆汁网络）。Bulk RNA-seq 多供体验证 + 形态学/功能学多重证据，使 HepLoC 成为同类平台中可信度最高的肝类器官-芯片系统之一。
临床转化价值：
- MAFLD 临床前模型：早期 MAFLD 表型（脂滴积聚、PPARα 下调、ROS 升高）建模成功，且能区分 3 种临床前候选药（非诺贝特/奥贝胆酸/rhFGF19）的抗脂肪变性效力，可直接对接药企转化医学部门。
- DILI（药物诱导肝损伤）筛选：曲格列酮胆汁淤积模型准确复现 BSEP/MRP2 抑制、紧密连接破坏、胆汁外排障碍——可直接用于新药临床前肝毒性早期发现。
- 纳米医学肝毒性评估：4 种参考肝毒物 + 3 种 LNP 脂质（DSPE-PEG2000/DOTAP/MC3）的剂量-反应数据，展示了 HepLoC 在 mRNA 疫苗 LNP 配方优化、肝靶向纳米载体安全性评价中的实用价值——尤其契合当前纳米药物开发热潮。
- 人源 + 可扩展 + 可标准化：3 个独立供体验证 + OrganoPlate 40 chip/板通量 + 7 天分化成熟周期，符合工业级筛选平台要求。
局限与未来：
- 本研究主要聚焦肝细胞成熟度与基础疾病建模，未涉及 Kupffer 细胞、肝脏星状细胞等非实质细胞的整合——免疫微环境和纤维化建模仍是空白。
- 胆汁网络虽已形成但长期稳定性未充分评估（7 天观察窗为主），需长期培养实验验证。
- LNP 脂质筛选仅 3 种，覆盖度有限；新型可电离脂质（如 SM-102、ALC-0315）的毒理学谱仍需扩展测试。
- 未做体内-体外一致性验证——HepLoC 数据与临床肝毒性数据的相关性需要后续更大规模跨平台研究确认。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| ClinoStar 2（3D 旋转生物反应器） | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本研究的 LGR5+ 肝祖类器官扩增阶段（EM → P3-P15）完全可在 ClinoStar 2 平台完成——低剪切悬浮培养相比 Matrigel 静态 3D 培养可获得更高的扩增通量、更均一的细胞球、更低的凝胶成本，与本研究"先扩增再芯片"的策略无缝衔接；同一供体来源类器官可在 ClinoStar 2 扩增至数十份后接种多块 OrganoPlate 板，实现真正的高通量筛选 |
销售切入点（数据出处可追溯）：
- 肝病药企转化医学部门：本研究 Fig 6-8 的曲格列酮胆汁淤积模型 + FFA-MAFLD 模型 + 3 种临床前候选药筛选数据（论文 §Fig 6-8）→ 客户开发时可作为"3D 肝毒筛 + MAFLD 抗脂肪变性筛选"完整解决方案的案例
- 纳米药物 / mRNA 疫苗开发商：本研究 Fig 8 的 LNP 脂质肝毒性谱（DSPE-PEG2000/DOTAP/MC3）→ 客户开发时可作为"纳米载体临床前肝毒性早期评价"标准化流程的标杆（论文 §Fig 8）
- 类器官 CRO / CDMO：本研究"3 个独立供体验证 + 40 chip/板通量 + 7 天成熟周期"展示了肝类器官-芯片的工业级可扩展性 → 客户开发时可作为"CRO 如何把研究级 3D 模型工业化"的方法学标杆（论文 §Fig 1-2）
参考文献
- Kong D, Yu S, Heegsma J, et al. High-throughput human microfluidic organoid-on-a-chip platform for modeling liver diseases and screening nanotherapeutics. Journal of Nanobiotechnology. 2026;24:583. DOI: 10.1186/s12951-026-04477-0
- Huch M, Dorrell C, Boj SF, et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 2013;494(7436):247-250. DOI: 10.1038/nature11826
- Bein A, Shin W, Jalili-Firoozinezhad S, et al. Microfluidic organ-on-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2018;5(4):659-668. DOI: 10.1016/j.jcmgh.2017.12.010
- Messner S, Agarkova I, Moritz W, Kelm JM. Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing. Archives of Toxicology. 2013;87(1):209-213. DOI: 10.1007/s00204-012-0968-2
- Eslam M, Sanyal AJ, George J, et al. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 2020;158(7):1999-2014.e1. DOI: 10.1053/j.gastro.2019.11.312
转发语：Journal of Nanobiotechnology 重磅！上海交大 + UMCG + 仁济医院联合团队首次将人源 LGR5+ 肝祖类器官规模化整合进 OrganoPlate 高通量微流控芯片，建立 HepLoC 平台——同时复现胆汁淤积性肝损伤（曲格列酮）和早期 MAFLD 表型，并完成 3 种 LNP 脂质 + 姜黄素脂质体的临床前肝毒-疗效双评价。类器官 + 器官芯片 + 纳米医学三件套，转化医学落地新标杆 🧬💊
联系人：李东伟
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