GenX 暴露持续时间对肝球体转录组的影响：急/慢性剂量响应的非单调差异
Exposure Duration Shapes the Hepatic Response to GenX: Divergent Acute and Chronic Transcriptomic Profiles Reveal Non-Monotonic Dose Effects and Increased Sensitivity in Human Liver Spheroids
作者：Chanhee Kim, Abderrahmane Tagmount, Zhaohan Zhu, W. Brad Barbazuk, Rhonda Bacher, Christopher D. Vulpe
机构：Center for Human and Environmental Toxicology, Department of Physiological Sciences, College of Veterinary Medicine, University of Florida, Gainesville, FL
期刊 / DOI：bioRxiv preprint（2026-08-14 发布），DOI 10.64898/2026.08.08.743693
通讯邮箱：1008zhangtingat163.com（中文名待确认）
核心技术：ClinoStar 旋转生物反应器 (Celvivo) | HepG2/C3A 3D 肝球体 | TempO-Seq 全转录组 | BMD 基准剂量建模 | 急/慢性暴露对比
📣 摘要
本研究使用 Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器 培养 HepG2/C3A 三维肝球体，在 0.08-50 μM 五档 GenX（HFPO-DA，新一代 PFAS 替代物）浓度下分别进行 急性（4 天） 与 慢性（4 周） 暴露，结合 TempO-Seq 全转录组测序与基准剂量（BMD）建模，系统揭示暴露持续时间是决定 GenX 转录毒性的关键变量。核心发现：① 急性暴露呈非单调剂量响应，0.4 μM（中间浓度）差异表达基因（DEG）数量最多，主要由细胞周期通路驱动；② 慢性暴露呈更线性的剂量响应，在最低测试浓度（0.08 μM）即出现脂代谢通路抑制；③ 急/慢性暴露诱导的转录谱在匹配浓度上几乎不重叠，提示常规短期检测可能严重低估 GenX 的真实生物学影响；④ BMD 建模显示慢性 tPOD 显著低于急性 tPOD，慢性模型对人体风险评估更敏感。本研究支持将 慢性、人源相关体外模型 与 转录组终点 整合进 PFAS 风险评估。
🔬 研究背景
GenX（六氟环氧丙烷二聚酸，HFPO-DA）作为传统 PFOA/PFOS 的主要替代品，正日益广泛地检出于环境水体与受污染场地饮用水中。然而其慢性毒理学特征仍严重缺乏，现行安全评估主要依赖短期、高剂量动物实验和 2D 培养，这些模型无法捕捉长期低剂量暴露的真实生物学后果——这是 PFAS 风险评估领域悬而未决的核心方法学缺口。
现有体外 GenX 毒性研究多采用 2D 单层培养或短期（24-96 h）暴露，缺乏人源 3D 模型在慢性时间尺度上的系统数据。HepG2/C3A 三维球体模型因能维持肝细胞极性、代谢酶活性和长期功能（数周至数月）而被推荐用于慢性毒性评估，但 4 周时间尺度的 GenX 转录组效应仍属空白。
研究目标：1) 利用 ClinoStar 旋转生物反应器培养长期稳定的 HepG2/C3A 3D 球体，实现 4 周连续培养；2) 系统比较 0.08-50 μM GenX 在 4 天 vs 4 周两个时间尺度上的全转录组响应；3) 通过 BMD 建模定量比较急/慢性暴露的转录组基准剂量，明确长期低剂量暴露的真实风险。
🧪 实验方法
设备与平台
HepG2/C3A 细胞（ATCC）维持在 MEM + 10% FBS + 1% 非必需氨基酸 + 1% 抗真菌抗生素（37°C，5% CO₂）。3D 球体通过 ClinoStar 旋转生物反应器 (Celvivo) 培养：细胞以 500 cells/微孔接种于 SP5D 球形板，24 h 预聚集后转入 ClinoReactor，在 ClinoStar 连续旋转条件下维持培养。培养基每 2-3 天换液一次，支持 4 周长期稳定培养。
暴露与分组
成熟 HepG2/C3A 球体（预聚集后第 1 天）暴露于 0.08、0.4、2、10、50 μM GenX（HFPO-DA）。DMSO 溶媒对照。两个时间点：急性 4 天 / 慢性 4 周（慢性组每次换液补充新鲜含 GenX 培养基）。每组 3 个独立生物学重复。
转录组测序
使用 TempO-Seq Human Whole Transcriptome Assay panel (BioSpyder)：RNeasy Plus Mini Kit 抽提总 RNA，DNase I 去除基因组 DNA 污染，标准化至 100 ng/μL，等体积 2× 增强裂解液处理后与检测探针（DO）混合。完成人全转录组（约 20,000 基因）测序。
剂量-响应建模
差异表达基因（DEG）筛选阈值：|Log2FC| > 1 且 FDR < 0.05。UpSet 图展示各浓度 DEG 重叠；Trendy 分段回归识别单调/阈值/非单调剂量模式；基准剂量（BMD）建模 通过累积 BMD 分布计算急/慢性 tPOD 定量比较。
📊 核心结果与配图
1. 急性暴露呈非单调剂量响应，中间浓度 DEG 最多（Fig 1）
图 1：6 panels (A-F) 实验设计 + 全局转录组概览。(A) 实验流程图：HepG2/C3A 球体在 ClinoStar (Celvivo) 中经 4 天（急性）或 4 周（慢性）暴露于 0.08-50 μM GenX，收集后做 TempO-Seq 全转录组测序。(B) PCA 图显示所有样本按暴露时间和剂量分离。(C)/(D) 急性（4 天）和慢性（4 周）暴露的差异表达基因（DEG，|Log2FC|>1，FDR<0.05）数量随剂量变化。关键发现：急性暴露 DEG 数量在 0.4 μM（中间浓度）出现峰值（非单调响应），慢性暴露 DEG 数量随剂量整体增加（除 10 μM 外）。核心 claim：暴露持续时间是 GenX 转录毒性的主要决定因素，4 周 vs 4 天诱导出定性不同的转录组响应。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | ClinoStar 培养 4 天 vs 4 周 HepG2/C3A 球体；5 档 GenX 浓度 (0.08-50 μM)；TempO-Seq 全转录组测序；3 个生物学重复 |
| 发现什么 | 急性 0.4 μM DEG 数量最多（非单调峰值）；慢性 0.08-50 μM DEG 数量随浓度递增（除 10 μM 外）；急/慢性在匹配浓度上重叠极低 |
| 说明什么 | 4 周 vs 4 天是定性不同的生物学响应，不能用短期数据外推长期效应；支持长期低剂量模型在 PFAS 风险评估中的必要性 |
2. 急性（4 天）GenX 响应在所有浓度下高度可变（Fig 2）
图 2：2 panels (A-D) 急性（4 天）GenX 暴露下浓度间 DEG 重叠。(A)/(C) UpSet 图分别显示在 0.08/0.4/2/10/50 μM 五个浓度下被上调/下调的 DEG 之间的重叠关系，水平柱表示每个浓度的 DEG 数量，垂直柱表示指定浓度组合间共享的基因数。(B)/(D) 跨浓度方向变化趋势的代表性转录本：使用 Trendy 分段回归识别单调型（monotonic）、阈值型（threshold-like）、非单调型（non-monotonic） 三种剂量依赖表达模式，实线为分段回归拟合曲线，表达值以归一化 count 表示。关键发现：急性暴露中只有少数转录本在所有 5 个浓度下都被改变，绝大多数响应是浓度特异的；Trendy 回归显示相当比例转录本呈非单调剂量响应（中间浓度变化最大）。核心 claim：急性 4 天暴露的 GenX 转录响应存在显著异质性，不能用"低剂量-高剂量"线性外推。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | UpSet 跨 5 浓度分析 DEG 重叠；Trendy 分段回归对全转录组分型；阈值 |Log2FC|>1，FDR<0.05 |
| 发现什么 | 急性 4 天中跨 5 浓度共享的转录本数量有限；Trendy 识别出相当比例的非单调剂量响应模式；0.4 μM 是 DEG 峰 |
| 说明什么 | 急性响应不能简单外推；PFAS 风险评估的剂量-响应关系在低剂量段可能复杂；支持采用 BMD 累积分布而非点估计 |
3. 慢性（4 周）暴露揭示与急性完全不同的剂量模式（Fig 3）
图 3：3 panels (A-F) 慢性（4 周）GenX 暴露下浓度间 DEG 重叠。(A)/(C) UpSet 图分别显示 0.08-50 μM 慢性暴露下上调/下调 DEG 跨 5 浓度的重叠。(B)/(D) Trendy 分段回归对慢性转录组响应的分型。(E)/(F) 慢性暴露下特定浓度（特别是 0.08 μM 最低浓度）的 DEG 数量及其通路富集特征。关键发现：慢性 4 周暴露下跨 5 浓度共享的转录本比急性 4 天多；但慢性特有的"低浓度即出现脂代谢抑制"模式是急性 4 天检测不到的；慢性 0.08 μM 即出现有意义 DEG 是急性 4 天在任何浓度下都未观察到的响应。核心 claim：4 周慢性模型揭示了急性 4 天检测不到的低剂量 GenX 转录毒性，支持"长期低剂量风险可能被短期检测系统低估"。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 同样 UpSet + Trendy 分析慢性 4 周样本；与急性结果对比 |
| 发现什么 | 慢性跨浓度共享转录本多于急性；0.08 μM（最低浓度）慢性即出现脂代谢通路抑制；急/慢性在匹配浓度上重叠极低 |
| 说明什么 | 慢性检测能发现急性 4 天漏掉的低剂量效应；4 周时间尺度对 GenX 真实风险评估至关重要；短期（4 天）高剂量实验会显著低估慢性低剂量 GenX 的生物影响 |
4. 急性暴露诱导细胞周期向脂代谢的过渡（Fig 4）
图 4：多 panels (A-F) 急性 4 天 GenX 暴露的功能富集与通路变化。(A)/(B) 急性 4 天不同浓度下上调/下调 DEG 的功能通路富集（GO/KEGG）结果。(C)/(D) 代表性通路（如细胞周期、脂代谢）的转录本剂量响应曲线。(E)/(F) 与脂代谢、压力反应相关的关键基因集分析。关键发现：急性低浓度（0.08-0.4 μM）GenX 优先调节细胞周期相关通路；急性高浓度（10-50 μM）则抑制脂代谢通路转录本并激活压力/毒性相关信号；响应模式随剂量发生质变（细胞周期 → 脂代谢 + 压力）。核心 claim：急性 4 天 GenX 在不同剂量段诱导完全不同的生物学过程——低剂量 = 细胞周期扰动，高剂量 = 代谢/压力毒性，印证非单调剂量响应。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 急性 4 天 DEG 通路富集；按浓度分段分析；细胞周期 vs 脂代谢 vs 压力信号通路转录本剂量曲线 |
| 发现什么 | 急性低剂量（0.08-0.4 μM）主要调节细胞周期通路；急性高剂量（10-50 μM）抑制脂代谢 + 激活压力/毒性信号 |
| 说明什么 | 急性 4 天在不同浓度段触发质上不同的生物学过程；非单调响应来自"低剂量扰动-高剂量毒性"的两段机制；不能用单一通路代表 GenX 急性响应 |
5. 慢性暴露渐进性重塑生物学响应为代谢重编程（Fig 5）
图 5：多 panels (A-F) 慢性 4 周 GenX 暴露的功能富集。(A)/(B) 慢性 4 周不同浓度下上调/下调 DEG 的功能通路富集。(C)/(D) 慢性暴露代表性通路的剂量响应曲线。(E)/(F) 慢性 vs 急性的通路差异分析。关键发现：慢性 4 周暴露渐进性地从基础扰动过渡到代谢重编程与细胞信号传导改变；在最低测试浓度（0.08 μM）即出现脂代谢通路抑制，这是急性 4 天在任何浓度下都未观察到的特征；慢性暴露触发的通路变化在急性 4 天暴露中未出现；慢性总 DEG 数量随浓度整体递增（除 10 μM 外），提示剂量-响应在长期低浓度下变得稳定。核心 claim：慢性 4 周 GenX 暴露是渐进性代谢重编程，不能用急性 4 天数据外推——4 周时间尺度下 GenX 的真实生物学影响是代谢层面的长期重塑，而非急性扰动。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 慢性 4 周 DEG 通路富集；按浓度梯度；与急性 4 天通路对比 |
| 发现什么 | 慢性 4 周在 0.08 μM 即出现脂代谢通路抑制；慢性触发"代谢重编程 + 细胞信号"通路；急/慢性在通路层面不重叠 |
| 说明什么 | 慢性是渐进性代谢重塑，不是急性扰动的延长；4 周 vs 4 天是生物学质变；支持慢性 3D 体外模型在 PFAS 评估中的不可替代性 |
6. 慢性 tPOD 显著低于急性，长期低剂量风险被低估（Fig 6）
图 6：1 panel 基准剂量（BMD）累积分析。(A) 急性 4 天与慢性 4 周 GenX 暴露的最佳 BMD 累积曲线：横轴为 BMD（基准剂量）值，纵轴为达到该累积数所需的转录本数量；曲线左移表示更多转录本在更低的 GenX 浓度下即出现剂量响应。关键发现：慢性 4 周的 BMD 曲线显著左移于急性 4 天，提示慢性 tPOD（转录组基准剂量起点）显著低于急性 tPOD；这意味着以急性数据推导的"安全剂量"在慢性真实暴露下会显著低估生物学影响；以 BMD 累积分布对比急/慢性，提供了定量证据支持"短期检测低估长期低剂量风险"的核心论断。核心 claim：基于 BMD 累积分析，慢性 4 周体外模型的 GenX tPOD 显著低于急性 4 天——这是"短期实验低估慢性 PFAS 风险"的定量证据；支持监管层面采用慢性、长期、3D 人源体外模型替代部分短期高剂量动物实验（NAMs, New Approach Methodologies）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 急性 4 天与慢性 4 周的 BMD 累积分析；最佳 BMD 转录组水平计算；tPOD 量化对比 |
| 发现什么 | 慢性 4 周 BMD 曲线显著左移于急性；tPOD 慢性 < 急性（具体数值未直接展示于摘要，详见论文 Fig 6 主体） |
| 说明什么 | 短期检测的"安全剂量"会显著低估慢性真实风险；定量支持 PFAS 风险评估方法学改革；为 NAMs（New Approach Methodologies）监管路径提供机制证据 |
💡 与可应用的产品/平台的关联
本研究的全部实验在 Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器 中完成。ClinoStar + ClinoReactor 系统的低剪切力特征是支撑 4 周长期稳定培养（不塌缩、不融合、保持球形）的核心平台条件，这是常规摇床（orbital shaker）和静态培养在 3D 长期实验中难以达到的关键能力。
| 产品/平台 | 关联维度 | 关联度 | 说明 |
|---|---|---|---|
| Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器 | ①方法直接使用 ②平台核心 ③客户刚需 ④差异化优势 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本研究全部 4 周培养在 ClinoStar (Celvivo) 中完成，ClinoReactor + SP5D 预聚集板是 HepG2/C3A 球体长期低剪切培养的核心；论文 Methods 2.1 明示使用 ClinoStar (Celvivo)。直接证明：ClinoStar 系统支持 4 周可重复、稳定的 3D 肝球体培养，适用于慢性毒理学长期暴露研究 |
| Celvivo ClinoReactor 单个反应器 | ①方法直接使用 ②配套硬件 ③客户刚需 ④扩展性 | ⭐⭐⭐⭐ | 论文 Methods 2.1 详细描述使用 ClinoReactor 单个反应器 + 连续旋转维持培养；ClinoReactor 是与 ClinoStar 配套的细胞培养容器，支持培养基置换与多浓度并行处理 |
| Celvivo SP5D 预聚集板 | ①方法直接使用 ②可迁移互补 ③标准化 ④可重现 | ⭐⭐⭐⭐ | 论文使用 SP5D 球形板进行 24 h 预聚集（500 cells/微孔）再转入 ClinoReactor，这一两阶段流程是 Celvivo 系统的标准方法学，确保 4 周培养的可重复性 |
面向客户的应用场景：
- PFAS 风险评估机构 / 监管科学团队：ClinoStar + 4 周 + 3D 肝球体 + TempO-Seq 的整合方案可作为 NAMs（New Approach Methodologies）方法学示范，支持"用慢性人源体外模型替代短期高剂量动物实验"的具体落地
- 化学品安全评估 CDMO / CRO：对需要长期（4-12 周）3D 培养的慢性毒理、药物肝毒性、PFAS 评估项目，ClinoStar 系统是经过文献验证的长期稳定培养平台
- 环境毒理 / 暴露科学实验室：对 PFAS、PM2.5、纳米材料等低剂量长期健康影响研究，3D 旋转培养 + 时间分辨转录组 + BMD 累积分析是定量风险评估的成熟方法学
- 制药企业肝毒性早期筛选：对需要 4-12 周时间尺度的慢性 DILI（药物性肝损伤）研究，本研究的方法学路径（HepG2/C3A 3D 球体 + 长期暴露 + 多组学终点）可直接迁移
论文方法对领域的方法学遗产：本研究用 ClinoStar 3D 肝球体 + 4 周时间尺度 + 全转录组 + BMD 累积，建立了**"短期实验低估 PFAS 风险"的定量证据链**。这套方法学可推广到所有 PFAS 同源物（PFOA、PFOS、GenX 衍生物等）、其他慢性肝毒物（APAP 慢性暴露、AFB1 等）、其他 3D 体外长期模型（肝、肾、心、神经类器官）的慢性毒理研究。
🏷️ 结论
- 暴露持续时间是 GenX 转录毒性的主要决定因素：急/慢性（4 天 vs 4 周）暴露在匹配浓度上诱导定性不同的转录谱，几乎无重叠，不能用短期数据外推长期效应
- 急性（4 天）响应呈非单调剂量模式：0.4 μM 中间浓度 DEG 数量最多，主要由细胞周期通路驱动；高浓度（10-50 μM）转为脂代谢抑制 + 压力/毒性信号；两段机制是急性非单调响应的来源
- 慢性（4 周）响应呈更线性剂量关系 + 渐进性代谢重编程：0.08 μM 最低浓度即出现脂代谢通路抑制，这是急性 4 天在任何浓度下都未观察到的响应；慢性触发"代谢重编程 + 细胞信号"通路，不是急性扰动的延长
- BMD 累积分析定量证明：慢性 4 周体外模型的 GenX tPOD 显著低于急性 4 天，这是"短期检测低估慢性 PFAS 风险"的定量证据，支持监管层面采用慢性、长期、3D 人源体外模型（NAMs）替代部分短期高剂量动物实验
- 方法学示范价值：ClinoStar 3D 旋转培养 + 4 周时间尺度 + 多浓度梯度 + TempO-Seq + BMD 累积 = 可推广的慢性体外毒理学评估范式，适用于 PFAS、药物肝毒性、环境污染物等所有需要长期低剂量评估的化合物
📖 文献信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | Exposure Duration Shapes the Hepatic Response to GenX: Divergent Acute and Chronic Transcriptomic Profiles Reveal Non-Monotonic Dose Effects and Increased Sensitivity in Human Liver Spheroids |
| 中文标题 | GenX 暴露持续时间对肝球体转录组的影响：急/慢性剂量响应的非单调差异 |
| 作者 | Chanhee Kim, Abderrahmane Tagmount, Zhaohan Zhu, W. Brad Barbazuk, Rhonda Bacher, Christopher D. Vulpe |
| 通讯 | Christopher D. Vulpe, University of Florida |
| 期刊 | bioRxiv preprint（待 peer review 期刊投稿） |
| DOI | 10.64898/2026.08.08.743693 |
| PMID | 42845386 |
| 发布日期 | 2026-08-14（bioRxiv 预印本） |
| License | CC-BY 4.0 International |
| 摘要关键数字 | 5 档 GenX 浓度（0.08-50 μM）；2 个时间点（4 天 / 4 周）；3 个生物学重复/组；约 20,000 转录本（TempO-Seq 人全转录组 panel）；DEG 阈值 |Log2FC|>1 且 FDR<0.05 |
| 设备 | ClinoStar 旋转生物反应器 (Celvivo) + ClinoReactor + SP5D 预聚集板 |
| 测序平台 | TempO-Seq Human Whole Transcriptome Assay (BioSpyder Technologies) |
| 统计方法 | DEG: |Log2FC|>1 + FDR<0.05；UpSet 跨浓度；Trendy 分段回归；BMD 基准剂量累积 |
| 引用建议 | Kim et al., 2026, bioRxiv, DOI 10.64898/2026.08.08.743693 |
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|---|---|
| Kim 2026 GenX Liver Spheroids bioRxiv preprint (5.14 MB) | 下载 PDF |
**转发语:**bioRxiv 预印本！GenX 慢性低剂量毒性被急性实验严重低估——HepG2/C3A 3D 肝球体在 Celvivo ClinoStar 旋转生物反应器中培养 4 周，通过 TempO-Seq 全转录组 + BMD 累积分析定量证明，慢性 tPOD 显著低于急性。4 周 vs 4 天诱导定性不同的转录响应，急/慢性几乎无重叠。支持 PFAS 风险评估必须用慢性、长期、3D 人源体外模型替代短期高剂量动物实验。🧠⚡
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