人iPSC来源小胶质样细胞整合入视网膜类器官的功能与转录组表征
Chichagova et al. | J Cell Mol Med 2023 | DOI: 10.1111/jcmm.17670
标签: #视网膜类器官 #小胶质细胞 #iPSC分化 #scRNA-seq #MEA #神经免疫
一、做什么 🔬
核心问题
视网膜类器官（RO）虽然能包含大部分视网膜细胞类型，但缺乏小胶质细胞——视网膜中唯一的常驻免疫细胞。小胶质细胞在视网膜发育、突触修剪、神经保护和疾病中发挥关键作用，其缺失限制了类器官作为疾病建模和药物筛选平台的真实性。
研究设计
研究者从 hiPSC 分化出小胶质样细胞（iMG），并在体外培养 13 周后将 iMG 加入视网膜类器官，模拟体内小胶质细胞迁移到视网膜的时间窗口（受孕后 6-17 周），在多个维度评估共培养效果：
| 模块 | 方法 | 目的 |
|---|---|---|
| iMG 分化与功能表征 | 间充质→髓系→小胶质前体分化 + IBA1 染色 + 吞噬 bead 实验 + LPS 细胞因子释放 | 确认 iMG 具备小胶质细胞的身份和功能 |
| 共培养时间线设计 | 在 RO 培养 13 周后加入 iMG，共培养至 22 周 | 模拟体内小胶质细胞迁移时间窗口 |
| scRNA-seq 转录组分析 | 22 周 RO ± iMG 单细胞测序（~51,000 细胞） | 评估 iMG 对视网膜细胞组成的影响 |
| MEA 电生理记录 | 多电极阵列记录 RGC 光反应（ON/OFF 中心型） | 评估 iMG 整合对视网膜网络功能的影响 |
| LPS 免疫挑战 | 15 周 RO ± iMG 暴露于 LPS 24h，检测细胞因子释放 | 验证共培养体系中的免疫应答能力 |
为什么值得读
这篇论文首次尝试将 hiPSC 来源的小胶质细胞整合入人视网膜类器官。虽然 iMG 在长期共培养后数量减少（scRNA-seq 未检测到独立簇），但功能实验证明：(1) 共培养的 RO 保留了完整的视网膜细胞组成和光反应能力；(2) LPS 刺激后含 iMG 的 RO 释放的炎症细胞因子显著高于对照 RO；(3) 杆状光感受器比例在 iMG-RO 中更高。这为构建"免疫完整"的视网膜类器官迈出了重要一步。
二、发现什么 📊
Figure 1：hiPSC 来源小胶质样细胞的分化与功能表征
图1：hiPSC 来源小胶质样细胞（iMG）的分化与功能验证。(A) 分化方案：从 hiPSC 经间充质诱导→髓系分化→小胶质前体；(B) 流式细胞术显示 CD14+ 和 CX3CR1+ 小胶质前体细胞比例随时间增加；(C) 明场显示细胞呈现分枝状形态，免疫荧光确认 IBA1 阳性；(D) 基因表达分析显示 iMG 的 TAM 相关基因（MERTK、PROS1、GAS6）以及 TMEM119、TREM2 的表达与原代小胶质细胞相当或更高；(E) 荧光 bead 吞噬实验：加入 bead 后细胞从半激活状态转变为阿米巴样形态，~90% 细胞具有吞噬能力；(F) LPS 刺激 24h 后细胞因子释放：iMG 对 LPS 响应强烈，上调了除 IL-1α 外的所有检测细胞因子，且水平高于原代小胶质细胞。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 间充质→髓系→小胶质前体分化，流式检测 CD14 和 CX3CR1 | CD14+ 和 CX3CR1+ 细胞比例随时间稳定增加，超过 40% 后转入贴壁成熟培养 | 分化方案能有效生成小胶质前体细胞 |
| 形态学 + IBA1 免疫染色 | 成熟细胞呈现分枝状形态，IBA1 阳性 | 具备小胶质细胞的经典形态和分子标记 |
| 基因表达对比原代小胶质细胞 | MERTK、PROS1、GAS6（TAM 受体通路）、TMEM119、TREM2 表达相当或更高 | iMG 的分子身份与原代小胶质细胞高度一致 |
| 荧光 bead 吞噬实验 + 流式定量 | ~90% 的 iMG 能吞噬荧光 bead，形态从分枝状转变为阿米巴样 | 吞噬功能健全——这是小胶质细胞的核心功能 |
| LPS 刺激 24h 后 29 种细胞因子检测 | iMG 对 LPS 响应强烈，上调除 IL-1α 外的所有检测因子，水平高于原代小胶质细胞 | 免疫应答功能健全——iMG 能作为有效的免疫效应细胞 |
Figure 2：含 iMG 的视网膜类器官的生成与表征
图2：视网膜类器官与 iMG 共培养的表征。(A) 时间线示意图：视网膜类器官培养 13 周后加入 iMG，共培养至 22 周进行各种分析；(B) 明场形态观察：含 iMG 和不含 iMG 的类器官形态无明显差异，15-16 周时可见 iMG 附着在类器官表面和内部（箭头所示）；(C) 免疫荧光确认视网膜关键细胞类型存在：光感受器（Recoverin）、Müller 胶质（CRALBP）、内核层神经元（PROX1）、神经节细胞（SNCG）、无长突细胞（AP2α）——IBA1+ 小胶质细胞仅在共培养组中检测到；(D) TEM 超微结构：两组类器官均显示连接纤毛、内段和原始外段，共培养组中可见含脂质包涵体的 iMG 样细胞（形态类似激活的巨噬细胞）。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 在 RO 培养 13 周后加入 iMG，监测至 22 周 | 15-16 周时 iMG 可见于类器官表面和内部，22 周时 iMG 较难在明场中识别 | iMG 能成功整合入视网膜类器官，但长期共培养后数量可能减少 |
| 免疫染色检测视网膜细胞类型 + IBA1 | 两组均含光感受器、Müller 胶质、内核层神经元、RGC、无长突细胞；IBA1+ 仅在共培养组检测到 | iMG 的加入不影响视网膜细胞的正常分化 |
| TEM 超微结构分析 | 两组均含连接纤毛、内段和原始外段；共培养组可见含脂质包涵体的 iMG 样细胞 | 类器官的超微结构不受 iMG 影响，iMG 在类器官中保持激活态巨噬细胞样形态 |
图2→图3的逻辑：Figure 2 证明了 iMG 能整合入视网膜类器官且不破坏视网膜结构，接下来需要在转录组水平系统评估 iMG 对细胞组成的影响。
Figure 3：scRNA-seq 揭示 iMG 对视网膜细胞组成的影响
图3：视网膜类器官共培养的 scRNA-seq 分析。(A) UMAP 显示 RO 中 21 个细胞簇的分布（含和不含 iMG 合并分析）；(B) 关键视网膜细胞类型标记基因在 UMAP 上的表达：光感受器、中间神经元、RGC、Müller 胶质、星形胶质细胞、RPE 和纤维化 Müller 胶质均被鉴定；(C) 各细胞类型在 RO 和 RO+iMG 中的频率比较：除杆状光感受器（Rods）在 iMG-RO 中比例更高、Müller 胶质比例更低外，其他细胞类型频率相似。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 22 周 RO ± iMG 单细胞 RNA 测序（~51,000 细胞） | UMAP 鉴定出 21 个细胞簇，涵盖所有关键视网膜细胞类型 | 类器官的细胞多样性得到全面确认 |
| 比较 RO 和 iMG-RO 的细胞类型频率 | 杆状光感受器在 iMG-RO 中比例更高；Müller 胶质比例更低；其他细胞类型无差异 | iMG 可能促进杆状光感受器的存活或分化；Müller 胶质减少可能与小胶质-胶质相互作用有关（文献已有报道） |
| 寻找小胶质/巨噬细胞特征基因簇 | 未检测到独立的小胶质细胞簇 | iMG 在 8.5 周共培养后数量显著减少，可能在单细胞解离过程中丢失 |
意外发现：scRNA-seq 未检测到小胶质细胞簇——这与免疫荧光和 TEM 检测到的少量 IBA1+ 细胞矛盾。研究者推测 iMG 在长期共培养后存活率低，且单细胞解离步骤可能进一步损失。这是一个重要的技术教训——未来需要优化共培养培养基以维持 iMG 长期存活。
Figure 4：iMG 整合对视网膜功能和免疫应答的影响
图4：视网膜类器官与 iMG 共培养的功能评估。(A) MEA 记录 RGC 光反应：OFF 中心型 RGC 在 WLP 后放电率降低，ON 中心型 RGC 放电率增加。ON RGC 的反应在 iMG-RO 中有升高趋势（10.5% vs 7.5%，p=0.065），但 OFF RGC 无差异（11.8% vs 12.4%，p=0.34）；(B) LPS 免疫挑战：15 周 RO ± iMG 暴露于 LPS 24h 后，含 iMG 的类器官释放的 IL-α、IL-12/IL-23p40、IL-15、IL-16、TNF-β、IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α 和 IL-13 均显著高于不含 iMG 的类器官。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| MEA 记录 RO 和 iMG-RO 的 RGC 光反应（ON/OFF 中心型） | OFF RGC 反应无差异（p=0.34）；ON RGC 反应在 iMG-RO 中有升高趋势（p=0.065，未达显著） | iMG 的整合未显著改变视网膜的光反应能力——这是一个重要发现，说明 iMG 的加入不会干扰视网膜的正常功能 |
| LPS 免疫挑战检测细胞因子释放 | 含 iMG 的 RO 释放的 IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α 等 10 种细胞因子均显著高于不含 iMG 的 RO | iMG 赋予了视网膜类器官免疫应答能力——这是本论文最重要的功能发现之一 |
| 对比 iMG 单独培养的细胞因子释放 | 共培养体系的细胞因子释放量低于 iMG 单独培养 | 符合预期——iMG 在类器官中占比低，但整体免疫应答信号仍然显著 |
三、说明什么 💡
核心结论
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| iMG 能有效分化并具备吞噬和 LPS 响应功能 | hiPSC 来源的小胶质样细胞是可靠的体外模型 |
| iMG 在 13 周加入 RO 后能整合入类器官 | 模拟体内迁移时间窗口的方法是可行的 |
| scRNA-seq 未检测到小胶质细胞簇 | 技术挑战：长期共培养中 iMG 存活率低，需要优化培养基 |
| 杆状光感受器在 iMG-RO 中比例更高 | iMG 可能通过分泌因子促进杆状光感受器的存活——这与小胶质细胞的神经保护功能一致 |
| LPS 挑战后 iMG-RO 释放更多炎症细胞因子 | 免疫完整性——含 iMG 的类器官能模拟视网膜的免疫应答 |
| ON RGC 光反应有升高趋势（p=0.065） | iMG 可能对视网膜网络兴奋性有轻微调节作用，需要更大样本量确认 |
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain HD-MEA | ⭐⭐⭐⭐ | 本文使用 MEA 评估视网膜类器官的 RGC 光反应。3Brain 4096 电极 CMOS-MEA 可用于高通量筛选含 iMG 的视网膜类器官在不同免疫刺激条件下的网络级电生理变化 |
| CELLINK BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 视网膜-小胶质共培养需要精确的空间组织，CELLINK 生物打印可用于构建含免疫细胞的多层视网膜类器官支架 |
| Celvivo Clinostar2 | ⭐⭐⭐ | 长期共培养（13-22 周）需要稳定的环境控制，Celvivo 的自动化系统可用于监测 iMG 在类器官中的存活和功能变化 |
原文下载
📄 Chichagova 2023 J Cell Mol Med microglia retinal organoids.pdf
参考文献
- Chichagova V, Georgiou M, Carter M, et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 2023;27:435-445. DOI: 10.1111/jcmm.17670
- Butovsky O, et al. Identification of a unique microglial signature and their role in CNS homeostasis. Nature Neuroscience. 2014;17:134-142. DOI: 10.1038/nn.3562
- Dorgau B, et al. Decellularised extracellular matrix-derived peptides from neural retina and retinal pigment epithelium enhance the expression of synaptic markers and light responsiveness of human pluripotent stem cell derived retinal organoids. Biomaterials. 2019;199:63-75. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.01.028
- Sridhar A, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the diverse cellular composition of human retinal organoids. Cell Reports. 2020;30:1234-1245. DOI: 10.1016/j.celrep.2020.01.012
转发语：J Cell Mol Med 这篇首次将 hiPSC 来源的小胶质细胞整合入人视网膜类器官——iMG 在 13 周加入类器官后能整合并保留吞噬功能。scRNA-seq 发现杆状光感受器比例在含 iMG 的类器官中更高，LPS 挑战后含 iMG 的类器官释放更多炎症细胞因子。MEA 证明光反应功能不受影响。
联系人：李东伟
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