HUB 来源上呼吸道和下呼吸道肺类器官在 ClinoStar 系统中的培养
研究概述
本应用说明详细介绍了使用 ClinoStar 和 ClinoReactor 系统培养上呼吸道和下呼吸道肺类器官的实验方案。ClinoStar 培养系统能够在封闭、无污染的环境中长期维持动态培养，且培养方法无需额外使用基质材料即可产生 3D 肺类器官。
作者：Dr. Stefanie Dichtl（因斯布鲁克医科大学博士后研究员）、Prof. Doris Wilflingseder（因斯布鲁克医科大学教授）、Louise Leth Hefting PhD（CelVivo 应用经理）
背景介绍
标准化 3D 细胞培养已成为传染病研究的重要模型，包括 SARS-CoV-2 的研究。源自支气管肺泡切除标本的人气道类器官包含基底细胞、功能性多纤毛细胞、产黏液分泌细胞和俱乐部细胞。目前模拟肺上皮的黄金标准是人支气管上皮细胞的气液界面（ALI）培养，但该系统细胞扩增能力有限且分化方案耗时较长。因此，一种易于使用的肺类器官方案将扩展该研究领域可用的模型系统。
关键图表
图1：ClinoReactor 中培养的肺类器官
图1A：使用 5x 物镜观察。肺类器官在 ClinoReactor 中培养，经 Phalloidin（红色）和 Hoechst（蓝色）染色。
图1B：在 ClinoReactor 中培养的肺类器官 3D 结构。
实验方案
肺类器官的准备与转移
- 如果肺类器官原本在含有基质（如 Matrigel）的条件下培养，必须先去除基质才能进行动态培养。
- 为去除基质残留，将肺类器官在 Falcon 管中用 0.5 mL TrypLE Express 酶于 37°C 孵育 5 分钟。
- 孵育后，加入 0.5 mL 培养基，反复吹打类器官多次。
- 1250 rpm 离心 Falcon 管 5 分钟。
- 去除上清液，用培养基重悬类器官。
- 通过顶部端口将类器官转移至已平衡的 ClinoReactor 中。
- 确保细胞室中无残留空气，关闭顶部端口，用 70% 乙醇消毒。
- 将 ClinoReactor 放入 ClinoStar，根据类器官大小调整转速。
换液操作
- 每周两次，使用针头和注射器通过顶部端口更换 5 mL 培养基。
- 如果需要更换 ClinoReactor 且仍有基质残留，可重复 TrypLE 处理步骤。
- 随着类器官生长，提高转速以确保最佳培养基流动。
培养基配方
基础培养基（Basic Medium）
| 试剂 | 用量 |
|---|---|
| Sigma Aldrich Advanced DMEM/F12 (SCM162) | 500 mL |
| Glutamax 100x | 5 mL |
| HEPES 1M | 5 mL |
| Pen/Strep 100x | 5 mL |
完全类器官生长培养基（50 mL 配制量）
| 试剂 | 用量 |
|---|---|
| 基础培养基 | 38.421 mL |
| Rspondin 条件培养基 | 5 mL |
| Noggin 条件培养基 | 5 mL |
| ThermoFisher B27 (50x) | 1 mL |
| Nicotinamide (1M) | 250 μL |
| NAC (500mM) | 125 μL |
| Tocris A83-01 (500μM) | 50 μL |
| Sigma Aldrich SB 202190 (30mM) | 1.7 μL |
| Miltenyi Human FGF-7 (25μg/mL) | 50 μL |
| Miltenyi Human FGF-10 (100μg/mL) | 50 μL |
| InvivoGen Primocin (50mg/mL) | 50 μL |
| MCE Y27632 (100mM) | 5 μL |
所需试剂与材料
- 15 mL Falcon 管
- 20 mL 注射器
- G18 2" 针头
- P200 和 P1000 吸头
- Gibco TrypLE Express 酶
- 已平衡的 ClinoReactor
- ClinoStar 系统
- HUB Organoids 来源的上呼吸道和下呼吸道肺类器官
完整方案页面
结论
ClinoStar 系统使我们能够在不使用任何支架、水凝胶或其他基质的情况下培养 3D 肺类器官。这种新型肺模型仅依赖细胞自聚集能力，是对气液界面（ALI）等已建立的肺模型系统的有益补充。研究团队将在未来的 SARS-CoV-2 研究中使用这一新型肺模型。
参考文献
- Zhou J, et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proc Natl Acad Sci U S A 2018; 115:6822-7.
- Sachs N, et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J 2019; 38.
- Tindle C, et al. Adult stem cell-derived complete lung organoid models emulate lung disease in COVID-19. Elife 2021; 10.
- Fulcher ML, et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med 2005; 107:183-206.
文献信息
| 字段 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | How to Grow HUB Derived Upper and Lower Respiratory Lung Organoids in the ClinoStar System |
| 中文翻译 | 如何在 ClinoStar 系统中培养 HUB 来源的上呼吸道和下呼吸道肺类器官 |
| 类型 | Application Note（应用说明） |
| 作者 | Stefanie Dichtl, Doris Wilflingseder, Louise Leth Hefting |
| 机构 | 因斯布鲁克医科大学（奥地利）; CelVivo Aps（丹麦） |
| 发布日期 | 9月22日 |
| 来源 | CelVivo |
联系人｜李东伟
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