GBM-NK 细胞互作:动态球体模型揭示分泌细胞因子与 CD155 轴的关键作用
Glioblastoma–natural killer cell crosstalk: insights from dynamic spheroid models reveal the importance of secreted cytokines and the CD155 axis
Anamarija Habič, Tina Kolenc Milavec, Pia Žižek, Špela Kladnik, Bernarda Majc, Emanuela Senjor, Milica Perišić Nanut, Andrej Porčnik, Borut Prestor, Urban Švajger, Metka Novak, Barbara Breznik | Cell Communication and Signaling 2026, 24:289 | DOI: 10.1186/s12964-026-02826-y
#标签: #GBM #NK细胞 #类器官 #ClinoStar #免疫治疗 #CD155 #DNAM1 #TIGIT #MIVO芯片
📣 摘要
核心技术: Celvivo Clinostar 旋转生物反应器动态培养 GB 球体 + MIVO® Single-Organ 动态 organ-on-chip 平台 + 流式杀伤定量 + 65 因子多重细胞因子/趋化因子分析 + CD155-DNAM1/TIGIT 轴功能阻断。
GBM 是侵袭性最强的原发脑肿瘤,5 年生存率 <10%;NK 细胞免疫治疗 因 GBM 免疫抑制微环境(TME)效果有限。本文首次在 Celvivo Clinostar 系统 中建立可重复 GB 球体动态培养协议(NCH421k 干细胞样 + NIB140 已分化 + NIB237GSC 干细胞 + 患者来源 GBM),3D 培养改变 NK 配体表达(CD155/B7-H6/ULBPs 下调),GB-NK 互作是 GB 细胞类型依赖;分泌组学揭示 NK 共培养显著上调免疫吸引因子(IL-8/CXCL9/CCL8 等),CD155-DNAM1/TIGIT 轴是 NK 杀伤 GB 干细胞的关键调控点。临床意义:CD155 阻断抗体已注册 I 期试验(NCT04656535)用于复发 GB。
🔬 研究背景
GBM 临床困境:
- 最常见 + 最侵袭性原发脑肿瘤
- 标准治疗 = 手术 + 放疗 + temozolomide 化疗
- 5 年生存率 <10%;30 年无重大进展
- 亟需新治疗方案
NK 细胞免疫治疗潜力:
- NK 细胞可识别并杀伤 GB 干细胞(驱动复发)
- 优势: 不需要预先致敏 + 不受 MHC 限制 + 可杀伤肿瘤干细胞
- 困境: GB 免疫抑制 TME 物理阻挡 NK 浸润 + 分泌免疫抑制因子(IDO/TGF-β/HLA-E 等)直接抑制 NK 活性
- 临床转化:迄今无随机对照试验显示持久临床获益 —— 主要瓶颈 = 缺乏可预测疗效的临床前模型
现有模型局限:
- 2D 单层培养: 缺乏 ECM + 缺乏 3D 相互作用 + 药物敏感度预测差
- PDX 鼠模型: 昂贵 + 耗时 + 难完整复现人免疫
- 3D 球体 + 旋转培养: 介于两者之间 + 长期培养稳定,但需优化
本文核心目标:用 Celvivo Clinostar 动态培养 GB 球体 + 共培养 NK + 系统分析 CD155 轴,为 NK 免疫治疗 GB 提供可临床转化的临床前模型 + 分子靶点。
🧪 实验方法
设备与平台
- Celvivo Clinostar 旋转生物反应器 + ClinoReactors — 核心 GB 球体动态培养
- MIVO® Single-Organ Platform (React4life) — 动态 organ-on-chip + transwell + Matrigel + flow
- 流式细胞仪 — NK 配体表达 + 浸润率定量 + 杀伤定量 (7AAD)
- 荧光显微镜 — Nikon Eclipse Ti + NIS-Elements 软件
- 多重细胞因子/趋化因子分析 — Bio-Plex Pro Human Cytokine 65-plex panel (Bio-Rad)
- 流式 8-Color Immunophenotyping Kit — PBMC + NK 亚群分析
细胞模型 (4 类 GB + 3 类 NK)
| 类型 | 名称 | 来源 |
|---|---|---|
| GB 细胞系 - 干细胞样 | NCH421k | 含 SOX2 + OLIG2 |
| GB 细胞系 - 已分化 | NIB140 | 高 GFAP + CD44 + 间充质亚型 |
| GB 干细胞 | NIB237GSC | 干细胞样 |
| GB 患者原代 | 6 例患者 | 复发 GBM |
| NK 细胞系 | NK-92 | 表达 CD16/DNAM-1/NKG2D/NKp30/TIGIT |
| NK - 健康供体 | HD NK | 6-9 健康供体外周血 |
| NK - GB 患者 | GB NK | 6 GB 患者外周血 |
共培养体系
- 直接共培养: Celvivo ClinoStar 球体 + NK(24-48 h)
- 动态 organ-on-chip: MIVO® transwell + Matrigel + flow,模拟 NK 体内浸润
- NK 配体分析: 流式 12 个配体 (CD155/CD112/B7-H6/CD54/ULBP1-3/HLA-A/B/C/MICA/B)
- NK 受体分析: 12 个受体 (CD16/CD96/DNAM-1/KIR2DL1-4/KIR3DL1/NKG2D/NKp30/PD-1/TIGIT)
- CD155 轴阻断: 抗 CD155 抗体 + TIGIT-Fc 融合蛋白
- 多重分泌组: 65 因子 Bio-Plex panel (含 IL-2/6/8/10/15、IFN-γ、TNF-α/β、CXCL9-13、CCL2-8、VEGF-A、TGF-β1-3 等)
📊 核心结果与配图
1. Celvivo Clinostar 培养 GB 球体方案 (Fig 1)
图 1: 多 panel (a-d) 工作流。Panel a: GB 细胞系(NCH421k/NIB140/NIB237GSC)单细胞悬液制备 + Clinostar 反应器水化 + 接种 (15 rpm 平衡 ≥ 2 h)。Panel b: 强制漂浮法(forced floating)+ 1×10^5 cells/mL 接种 + 维持 8-18 天。Panel c: 球体在 Clinostar 中成熟(细胞 - 细胞 ECM 形成 + 形态均质化) + 维持培养(培养基每 2 天更换)。Panel d: 共培养 NK 细胞接种(NK-92 + HD NK + GB NK 三种来源)+ 24-48 h 共培养 + 多终点分析。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | Celvivo Clinostar 反应器水化 + 3 类 GB 细胞系 + 3 类 NK 细胞 + 共培养标准化协议 |
| 发现什么 | 首次在 Celvivo Clinostar 中成功培养 GB 球体 — 形态均质 + 长期稳定 + NK 共培养可行 |
| 说明什么 | 动态 3D 培养是 GBM-NK 互作研究的关键工具 — 填补 2D 单层与体内之间的空白 |
2. GB 球体表征 (Fig 2)
图 2: 多 panel (a-b) GB 球体表征。Panel a: NCH421k vs NIB140 球体免疫荧光染色 (Day 8 + Day 18) — 干细胞标记 SOX2/OLIG2 + 增殖 Ki-67 + 缺氧标记 HIF1α/CA9 + GFAP + CD44 + 间充质亚型标记。Panel b: 干细胞样 NCH421k SOX2/OLIG2 全部阳性; 已分化 NIB140 GFAP/CD44 高表达 + 间充质亚型标记明显。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 球体 Day 8 + Day 18 IF 染色 — 5 个 GB 标记 (GFAP/CD44/SOX2/OLIG2) + 2 个增殖/缺氧 (Ki-67/HIF1α/CA9) |
| 发现什么 | 3D 球体维持 GB 异质性 — NCH421k 干细胞样 + NIB140 已分化 + 缺氧核心区形成 |
| 说明什么 | 球体是 GB 临床前模型的金标准 — 异质性 + 缺氧梯度 = 体内肿瘤特征 |
3. 3D 培养改变 NK 配体表达 (Fig 3)
图 3: 多 panel (a-b)。Panel a: 流式定量 NK 配体表达 (% 阳性细胞) 在 NCH421k + NIB140 球体 vs 标准 2D 培养 — 配体包括 CD155/CD112/B7-H6/CD54/ULBP1-3/HLA-A/B/C。Panel b: NK 杀伤 7AAD+ % vs E:T (Effector:Target) 比 — NCH421k vs NIB140 球体 + 不同 NK 浓度梯度。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 流式定量 9 个 NK 配体在 2D vs 3D + 杀伤 7AAD+ % vs E:T |
| 发现什么 | 3D 培养下调 NK 激活配体 — CD155/B7-H6/ULBPs 在 3D 显著下调(Mean ± SEM, 双因素 ANOVA, n=3) |
| 说明什么 | 3D 培养改变 GB 免疫表型 — GB 在 3D 中对 NK 更具抗性 — 这是临床失败的潜在原因 |
4. GB-NK 共培养 + 浸润 + 杀伤 (Fig 4)
图 4: 多 panel (a-h) 完整共培养分析。Panel a: 共培养示意图 + 直接共培养 vs MIVO® organ-on-chip 两种模式。Panel b-d: 流式定量 NK-92 + HD NK + GB NK 在 NCH421k/NIB140/NIB237GSC 球体中浸润率 (24 h)。Panel e-f: 免疫荧光成像 NK (绿色) 浸润 GB 球体 (红色) + 共培养。Panel g-h: transwell 流动 MIVO® 平台 NK 浸润量化。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 直接共培养 + MIVO® organ-on-chip 双模式 + 3 类 NK + 3 类 GB + 浸润率流式 + IF 成像 |
| 发现什么 | NK 浸润 ≠ 杀伤 — NK-92 对 NCH421k 浸润低但杀伤高;NIB140 浸润高但杀伤低 — 浸润与细胞毒性脱钩 |
| 说明什么 | 不能用浸润率单独评估 NK 治疗效力 — 杀伤效力需独立评估 — Celvivo 3D 模型是金标准 |
5. NK 杀伤效力定量 (Fig 5)
图 5: 多 panel (a-b) 柱状图。Panel a: NK-92 在非活化 vs IL-2 活化条件下对 NCH421k/NIB140 球体的杀伤率 (7AAD+ %)。Panel b: HD NK 在非活化 vs IL-2 活化条件下对两种球体的杀伤率。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | NK-92 + HD NK + 非活化 vs IL-2 活化 + NCH421k vs NIB140 球体 + 杀伤率 7AAD+ % |
| 发现什么 | NK-92 对 NCH421k 显著杀伤 + NIB140 球体抵抗 — IL-2 活化增强杀伤(尤其 HD NK) |
| 说明什么 | NK 治疗 GB 需针对 NCH421k 类干细胞样亚型 — NIB140 类已分化亚型治疗无效 |
6. 共培养分泌组学 (Fig 6)
图 6: 多 panel (a-f) 多重分泌组。Panel a: NK-92 杀伤活性柱状图。Panel b: NKp30 表达柱状图。Panel c-e: 分层聚类热图 (hierarchical clustered heatmap) — 65 因子在 NK 单培养 / GB 单培养 / 共培养 三组中表达 (Z-score)。Panel f: 关键趋化因子 CXCL9/10/11 + IL-8 + CCL8 ELISA 定量柱状图。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | Bio-Plex Pro Human Cytokine 65-plex + 三组对照分层聚类 + ELISA 验证 5 关键趋化因子 |
| 发现什么 | 共培养显著上调 — 颗粒酶 A/B + perforin + sFasL(细胞毒性) + IL-16 + CCL5 + IL-8 + M-CSF + 显著下调 TNF-β/IL-10/IL-13/perforin/SDF-1/VEGF-A |
| 说明什么 | NK-GB 互作是分泌组重塑过程 — Celvivo 3D + NK 共培养是分泌组学研究金标准 |
7. NK 细胞表型变化 (Fig 7)
图 7: 多 panel (a-b) 柱状图。Panel a: 共培养后 NK 细胞表面标记变化 (CD16/CD96/DNAM-1/NKG2D/NKp30/TIGIT/PD-1) — 配对柱状图比较单培养 vs 共培养。Panel b: NK 浸润率与杀伤率相关性散点图 — 浸润 vs 杀伤关系。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 共培养后 NK 表面标记流式定量 + 浸润-杀伤相关性分析 |
| 发现什么 | 共培养后 NK 表面标记变化 + NK-92 vs HD NK 不同亚群响应模式 |
| 说明什么 | NK 表面表型 ≠ 杀伤效力 — 需要功能检测(7AAD)+ 表面标记联合评估 |
8. CD155 轴调控 NK 杀伤 (Fig 8)
图 8: 多 panel CD155 轴功能研究。Panel a: TCGA 数据分析 — PVR(CD155 基因)在 GB vs 低级别胶质瘤上调。Panel b: 共培养中抗 CD155 抗体 + TIGIT-Fc 融合蛋白功能阻断 — 杀伤率变化柱状图。Panel c: 抗 CD155 阻断对 NK-92 vs HD NK 对 NCH421k/NIB140 杀伤的差异化效应。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | TCGA 分析 PVR 表达 + 抗 CD155 抗体 + TIGIT-Fc 融合蛋白功能阻断杀伤实验 |
| 发现什么 | CD155-DNAM1/TIGIT 轴 是 NK 杀伤 GB 干细胞样细胞的关键调控 — 阻断 CD155 显著增强 HD NK 对 NCH421k 杀伤 |
| 说明什么 | CD155 阻断抗体 是 GB NK 免疫治疗新策略 — 已注册 NCT04656535 I 期临床试验(复发 GB 患者) |
💡 与可应用的产品/平台的关联
| 产品/平台 | 关联维度 | 关联度 | 说明 |
|---|---|---|---|
| Celvivo ClinoStar / ClinoReactors | 论文核心设备 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本研究首次在 Celvivo Clinostar 中建立 GB 球体动态培养协议。这是 Celvivo 在 GBM + 免疫治疗交叉方向的厂家背书 SOP 论文, ClinoStar + ClinoReactor 双设备组合支撑球体成熟 + 共培养。 |
面向客户:
- GBM 免疫治疗客户(药企转化医学 + CAR-NK 公司):Celvivo Clinostar + MIVO® 双平台是 GBM NK 免疫治疗临床前筛选金标准 + CD155 阻断是 I 期临床候选靶点(NCT04656535)。
- 类器官厂家客户:本文是 Celvivo Clinostar 在 GBM 应用的第一份公开论文, 适合做临床前平台推广。
- 临床前 CRO 客户:65 因子多重分泌组学 + CD155 轴 + Celvivo 球体 = 完整 NK-GB 互作筛选服务。
🏷️ 结论
- 首次在 Celvivo Clinostar 中建立 GB 球体动态培养协议 + 长期稳定 + 形态均质 + 适合 NK 共培养。
- 3D 培养改变 GB NK 配体表达谱 — CD155/B7-H6/ULBPs 显著下调, 影响 NK 治疗响应。
- NK 浸润 ≠ 杀伤 — NCH421k 干细胞样对 NK 敏感但 NIB140 已分化抵抗 — 浸润率不能单独预测疗效。
- CD155-DNAM1/TIGIT 轴 是 NK 杀伤 GB 干细胞样细胞的关键调控 — 抗 CD155 抗体 + TIGIT-Fc 增强 HD NK 杀伤。
- 共培养分泌组重塑 — 65 因子显著变化(颗粒酶/perforin/CCL5/IL-8 上调;TNF-β/IL-10/VEGF-A 下调)。
- 临床意义 — CD155 阻断抗体已注册 NCT04656535 I 期临床试验(复发 GB 患者)。
📖 文献信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | Glioblastoma–natural killer cell crosstalk: insights from dynamic spheroid models reveal the importance of secreted cytokines and the CD155 axis |
| 期刊 | Cell Communication and Signaling |
| 年份 / 卷 / 页 | 2026, 24:289 |
| DOI | 10.1186/s12964-026-02826-y |
| 作者 | Anamarija Habič, Tina Kolenc Milavec, Pia Žižek, Špela Kladnik, Bernarda Majc, Emanuela Senjor, Milica Perišić Nanut, Andrej Porčnik, Borut Prestor, Urban Švajger, Metka Novak, Barbara Breznik |
| 通讯 | National Institute of Biology, Ljubljana, Slovenia (Barbara Breznik + Anamarija Habič) |
| 临床试验 | NCT04656535 (CD155 阻断 + 复发 GB) |
| License | CC BY-NC-ND 4.0 (OA) |
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| Habič 2026 CCS | 7.0 MB |
联系人：李东伟
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Cell Commun. Signal. 2026 重磅!斯洛文尼亚国家生物研究所首次在 Celvivo Clinostar 中建立 GBM 球体 + NK 共培养动态模型 — 65 因子分泌组学揭示 CD155-DNAM1/TIGIT 轴是 NK 杀伤 GB 干细胞关键调控点; CD155 阻断抗体 I 期临床试验 (NCT04656535) 已启动。🧠⚡