胶质母细胞瘤突触连接性的跨突触追踪技术 (Nature Protocols, 2025)

作者: Yusha Sun, Xin Wang, ..., Guo-li Ming & Hongjun Song
期刊: Nature Protocols, 2025, 20(6), 1957–1995
DOI: 10.1038/s41596-025-01287-w
PDF 原文: SeaFile 下载

核心科学问题

胶质母细胞瘤（GBM）会与中枢神经系统中的神经元形成功能性突触连接，这些神经元-肿瘤突触可促进肿瘤进展。然而，系统性地表征和操控这些**肿瘤支配神经元（tumor-innervating neurons）**极具挑战性，因为它们可能局部存在，也可能广泛分布于全脑。

本研究由宾夕法尼亚大学 Ming 和 Song 团队开发，提供了一套标准化的实验方案，利用GBM 类器官（GBOs）结合狂犬病毒和单纯疱疹病毒（HSV）跨突触追踪技术，系统解析肿瘤-神经元连接组。

技术方案

1. GBM 类器官（GBO）平台

图 3：(a) GBO 解离与重组流程 | (b) UP-778827 GBO 及其重组体 | (c) 肿瘤标志物（Nestin、SOX2）和微环境标志物（IBA1、MBP、NeuN、CD3）的免疫组化 | (e) 单细胞测序 UMAP 图 | (f) 标志性特征图 | (g) 染色体变异（CNV）分析

• 患者来源 GBO: 从手术切除组织中直接生成，保留肿瘤异质性（如 Chr 7 增加、Chr 10 缺失）。
• 解离与重组: GBO 可解离为单细胞并重新聚集成类器官，便于同时病毒感染进行转基因传递。

2. 跨突触追踪策略

图 1：(a) 逆向（Rabies）与顺向（HSV）追踪工作流程 | (b) 逆向追踪在小鼠大脑或人脑组织中进行 | (c) HSV 顺向追踪

2.1 逆向跨突触追踪 (Retrograde Tracing)

• 原理: 病毒从突触后（肿瘤细胞）逆向传播到突触前（神经元）。
• 工具:
  • 辅助病毒: 逆转录病毒表达 TVA 受体、狂犬病毒糖蛋白 (G) 和 DsRedExpress，选择性地感染分裂中的恶性细胞。
  • 追踪病毒: EnvA 假型、缺失 G 蛋白的狂犬病毒（ΔG-RV）。只能感染表达 TVA 的细胞，并借助 G 蛋白跨突触传播。
• 两种策略:
  • 预标记法（Pre-labeling）: 在移植或融合前感染 GBO 狂犬病毒，适用于研究突触形成的速度。
  • 两步法（Two-step/Long-term）: 移植后等待 GBM 细胞充分浸润，再注射狂犬病毒，适用于研究进展期或治疗后的连接组。

2.2 顺向跨突触追踪 (Anterograde Tracing)

• 原理: 病毒从突触前（神经元）顺向传播到突触后（肿瘤细胞）。
• 工具: HSV1-H129（TK 缺陷型）。
  • 结合 Cre 依赖性 AAV（表达胸苷激酶 TK），仅在特定 Cre 表达的神经元中复制并跨突触传播到 GBM。
  • 也可使用 Cre 依赖性 HSV1-H129 实现更广泛的标记。

3. 多种模型系统

3.1 GBO-皮层类器官组装体 (Assembloids)

图 4：(a) GBO 与 iPSC 来源的皮层类器官（SNO）融合 | (b) 组装体 10 天后肿瘤细胞侵入皮层区域

• 将 GBO 与人 iPSC 衍生的**切片新皮层类器官（SNO）**在气液界面（ALI）培养下融合。
• 融合后 24-48 小时可观察到肿瘤细胞向皮层区域的广泛浸润。

3.2 人脑手术切片共培养

• 使用振动切片机将新鲜手术组织切片为 300 μm 厚度。
• 将 GBO 放置于切片上，进行共培养和病毒追踪。
• 可在人源组织中直接观察肿瘤-神经元连接。

3.3 小鼠体内移植

图 5：(a) GBO-皮层类器官组装体中的单突触追踪 | (c) 小鼠大脑不同区域（胼胝体、海马）移植后的追踪 | (f) 突触前输入神经元连接组定量

• 立体定位注射: 将 GBO 细胞注射到小鼠大脑的不同区域（M1 皮层、S1 皮层、后扣带皮层、海马、纹状体）。
• 3-10 天后: 可观察到病毒从 GBM 细胞跨突触传播到多种神经递质类型的神经元（胆碱能、5-羟色胺能、多巴胺能）。

实验数据与结果

1. 连接组特征

• 多样化输入: GBM 细胞接收来自多种神经递质类型（谷氨酸能、GABA 能、胆碱能、5-羟色胺能、多巴胺能）和多个脑区的输入。
• 同侧与对侧连接: 病毒传播不仅限于注射侧，还可跨越到对侧大脑半球。
• 时间动态: 突触连接在移植后 3-10 天内逐渐形成并增强。

2. 功能验证

• 胆碱能输入: 鉴定出功能性胆碱能输入通过代谢型受体 CHRM3 促进肿瘤进展。
• 乙酰胆碱记忆: GBM 细胞在急性暴露于乙酰胆碱后，会产生持久的转录组记忆。

创新点

1. 首个 GBM 突触追踪标准方案: 提供了一套完整的、可重复的病毒追踪流程，适用于多种模型（类器官、小鼠、人脑切片）。
2. 双向验证: 结合了逆向（狂犬病毒）和顺向（HSV）追踪，确保连接特异性。
3. 时间控制: 开发了"预标记"和"两步法"策略，可以研究肿瘤进展不同阶段的神经连接。
4. 广泛适用性: 方法可扩展到其他涉及神经系统的癌症研究（如乳腺癌、黑色素瘤、脑转移瘤）。

学术启示

本研究对 3Brain 产品的间接应用价值：

• 电生理验证: 在追踪到特定的神经-肿瘤连接后，可以使用 3Brain HD-MEA 进行高通量的电生理功能验证（如钙成像、场电位记录），评估神经元活动对肿瘤生长的影响。
• 药物筛选: 结合 MEA 记录，可以评估针对特定神经递质受体（如 CHRM3）的药物是否能阻断神经-肿瘤信号传导，从而抑制肿瘤生长。
• 复杂模型表征: 为类器官-神经元共培养体系的功能性表征提供了强大的工具。

产品线关联: 🔴 3Brain HD-MEA (4096 通道) — 肿瘤-神经元网络电生理表征平台

💡 宾夕法尼亚大学 Ming/Song 团队开发了一套标准化的跨突触追踪方案，利用狂犬病毒和 HSV 在类器官、人脑切片和小鼠模型中系统性解析胶质母细胞瘤（GBM）的神经元连接组。研究发现 GBM 接收来自多种神经递质类型和脑区的输入，其中胆碱能信号通过 CHRM3 促进肿瘤进展。

联系人｜李东伟
📞 18045130660
🌐 主页：https://www.biokingdom.top