人源松果体类器官的构建及其在褪黑素合成与安格曼综合征建模中的应用
Ferdi Ridvan Kiral, Woo Sub Yang, Onur Iyilikci, Xiaona Lu, Jonghun Kim, Mu Seog Choe, Cynthia Lo, Mei Zhong, Kun-Yong Kim, Yong-Hui Jiang, In-Hyun Park | Cell Stem Cell 2026 | DOI: 10.1016/j.stem.2025.12.001
标签: #类器官技术 #昼夜节律 #安格曼综合征 #褪黑素合成 #神经发育疾病
一、做什么 🔬
研究背景：松果体通过合成褪黑素调控哺乳动物睡眠-觉醒周期。该器官位于深脑区域，发育期组织样本极度稀缺，导致人类松果体细胞分化轨迹与褪黑素调控机制长期缺乏直接研究模型。啮齿类动物模型中褪黑素合成主要受转录水平调控，而人类依赖翻译后修饰，跨物种差异使得传统动物实验难以准确模拟人类昼夜节律障碍与神经发育疾病的病理机制。
核心问题：
- 能否在体外利用人多能干细胞定向分化出具备完整褪黑素合成能力的松果体类器官？
- 人类松果体细胞如何通过去甲肾上腺素能信号通路调控褪黑素分泌？
- UBE3A基因缺失如何干扰安格曼综合征患者的松果体细胞成熟与褪黑素合成？
研究模型：人多能干细胞（hESC与hiPSC）衍生的松果体类器官（hPGOs）及松果体切除小鼠移植模型。
技术路线：
- 定向分化诱导：采用BMP4/FGF8激活联合100 nM Cyclopamine（SHH抑制剂）的时序性小分子方案，引导背侧间脑向松果体谱系分化。
- 单细胞转录组解析：对6周与18周类器官进行scRNA-seq，通过VoxHunt空间映射比对小鼠E18.5脑图谱与人类胎儿脑图谱。
- 钙成像与光遗传学验证：利用GCaMP6s传感器监测去甲肾上腺素（NA）诱导的钙瞬变，构建交感神经元-松果体类器官融合体（Assembloid）进行光控刺激。
- 活体功能移植：将GFP标记的10周龄hPGOs移植至P4期松果体切除小鼠脑内，2个月后通过LC-MS检测血清褪黑素水平。
- 疾病机制建模：使用安格曼综合征（AS）患者iPSC构建hPGOs，结合WNT/BMP通路干预与转录组分析解析发育阻滞节点。
二、发现什么 📊
核心发现1：时序性小分子诱导成功建立具备松果体分子特征的类器官模型
图1：100 nM Cyclopamine处理下，18周龄hPGOs中TPH1与ASMT双阳性细胞比例突破70%（p<0.001），显著高于对照组。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在分化第8-22天测试1 μM、500 nM、100 nM三种浓度Cyclopamine，并在第16-22天施加FGF8；通过免疫荧光与qPCR检测OTX2、CRX、LHX4、TPH1、ASMT表达。 |
| 发现什么 | 100 nM浓度维持类器官结构完整，18周时TPH1/ASMT双阳性细胞占比达72.4%（p<0.001）；CRX表达在18周稳定，LHX4在晚期显著上调；中脑标志物被有效抑制。 |
| 说明什么 | 轻度SHH抑制配合限时FGF8暴露可精准阻断腹侧化与中脑命运，确立人类松果体体外分化的最优化学窗口。 |
核心发现2：类器官转录组与二维形态高度还原体内松果体发育轨迹
图2：VoxHunt映射显示18周hPGOs与成人松果体转录组皮尔逊相关系数达0.85，二维培养中hPGO细胞分支总长度较丘脑神经元缩短68%（p<0.001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对6周与18周hPGOs进行scRNA-seq聚类，使用VoxHunt比对小鼠E18.5原位杂交数据与人类胎儿脑图谱；将18周类器官解离后二维铺板，量化细胞突起分支数与总长度。 |
| 发现什么 | 18周类器官中成熟松果体细胞（Mat_Pin）占比从6周的18%升至54%；VoxHunt与成人松果体Bulk RNA-seq相关性达0.85；二维培养中hPGO细胞形成致密岛状结构，单细胞分支总长度降至丘脑神经元的32%（p<0.001）。 |
| 说明什么 | hPGOs在转录组层面精准复现松果体成熟进程，其独特的内分泌样聚集形态与短突起特征区别于典型神经元，验证了谱系特异性。 |
核心发现3：移植后的类器官在活体内恢复系统性褪黑素分泌
图3：松果体切除小鼠移植hPGOs后，血清褪黑素浓度从切除组的0.8 pg/mL恢复至对照组的58%（约4.2 pg/mL，p<0.01）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将GFP标记的10周龄hPGOs移植至P4期松果体切除小鼠脑内，饲养2个月后取血清，采用LC-MS定量褪黑素；免疫荧光验证移植物内人源TPH1表达。 |
| 发现什么 | 切除组血清褪黑素降至0.8 pg/mL，移植组恢复至4.2 pg/mL（p<0.01 vs 切除组）；GFP+细胞在受体脑区存活并高表达人源TPH1，电镜显示移植物内富含致密核心囊泡（DCVs）。 |
| 说明什么 | hPGOs具备在宿主微环境中整合并执行生理级激素分泌的能力，为神经内分泌细胞替代疗法提供直接概念验证。 |
核心发现4：松果体细胞通过α-肾上腺素能受体获得去甲肾上腺素响应能力
图4：18周hPGOs经NA刺激后，85.3%的细胞产生钙瞬变，峰值幅度较12周提升2.1倍（p<0.001），且该响应可被α受体拮抗剂Prazosin完全阻断。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用GCaMP6s病毒转染hPGOs，在6/12/18周龄阶段施加NA、α激动剂（PE）、β激动剂（DH）及α拮抗剂（Prazosin），记录单细胞钙成像轨迹。 |
| 发现什么 | 6周细胞对NA无响应；12周响应细胞比例达62%；18周响应比例升至85.3%，峰值ΔF/F提升2.1倍（p<0.001）；PE可完全模拟NA效应，DH无效；Prazosin预处理使响应率降至4.1%。 |
| 说明什么 | 人类松果体细胞的交感神经调控在体外培养12周后逐步成熟，且严格依赖α-肾上腺素能受体介导的钙内流，与啮齿类β受体主导的机制存在物种差异。 |
核心发现5：人类褪黑素合成依赖AANAT翻译后修饰而非转录调控
图5：NA处理6小时后，hPGOs褪黑素分泌量提升3.1倍（p<0.001），p-AANAT蛋白水平升高2.8倍（p<0.001），但AANAT/ASMT mRNA水平无显著变化。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对18周hPGOs施加NA处理6小时，同步进行ELISA褪黑素定量、qPCR检测合成酶转录本、Western blot检测p-AANAT及14-3-3蛋白，并进行Co-IP验证互作。 |
| 发现什么 | ELISA显示褪黑素浓度从基线12.4 pg/mL升至38.6 pg/mL（提升3.1倍，p<0.001）；qPCR显示AANAT/ASMT mRNA无变化；Western blot显示p-AANAT信号增强2.8倍（p<0.001）；Co-IP证实NA刺激后p-AANAT与14-3-3结合丰度提升2.5倍。 |
| 说明什么 | 人类松果体褪黑素分泌的昼夜节律调控核心在于AANAT磷酸化与14-3-3蛋白稳定化，而非转录水平开关，纠正了长期依赖啮齿类模型推导的机制认知。 |
核心发现6：UBE3A缺失导致安格曼综合征类器官脉络丛扩张与褪黑素合成阻滞
图6：AS来源hPGOs中TTR阳性脉络丛区域占比达22.7%（对照<5%，p<0.001），褪黑素分泌量降至对照的8.4%（p<0.001），且NA诱导的钙响应几乎消失。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用UBE3A母源缺失AS患者iPSC构建hPGOs，通过免疫荧光量化TTR+区域面积，ELISA检测褪黑素，钙成像评估NA响应；施加WNT抑制剂（IWP2）观察表型逆转情况。 |
| 发现什么 | AS hPGOs体积缩小，TTR+区域占22.7%（对照<5%，p<0.001）；褪黑素分泌量仅为对照的8.4%（p<0.001）；NA刺激下仅11.2%细胞产生微弱钙瞬变；WNT抑制使TTR+区域缩小至12.4%，但褪黑素分泌未恢复。 |
| 说明什么 | UBE3A缺失引发异常WNT信号激活，导致早期细胞命运偏向脉络丛上皮，并不可逆地阻滞松果体细胞晚期成熟与翻译后调控网络，直接解释AS患者顽固性睡眠障碍的细胞学根源。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将松果体体外建模从“形态模拟”推进至“功能与调控机制还原”。过去学界普遍将啮齿类转录调控模型外推至人类，本研究通过直接证据确立人类松果体褪黑素合成以翻译后修饰（p-AANAT/14-3-3）为核心，重塑了昼夜节律内分泌调控的物种差异共识。同时，hPGOs成功跨越了深脑器官难以获取发育期组织的长期技术壁垒。
临床/转化价值：
- 为安格曼综合征、自闭症谱系障碍等神经发育疾病的睡眠共病提供机制明确的体外筛选平台，靶向WNT通路或14-3-3结合界面可能成为新型干预策略。
- 验证了松果体细胞移植修复系统性褪黑素缺乏的可行性，为退行性节律障碍或老年松果体钙化导致的睡眠紊乱提供细胞治疗路径。
- 建立的光遗传-交感神经-松果体融合体模型，可直接用于评估拟交感神经药物对褪黑素分泌的脱靶效应。
与我们产品的关联：
- 类器官构建阶段依赖高精度微环境控制与长期培养，Cellink BIO X系列可标准化该分化流程。
- 钙成像与光遗传验证环节需要高时空分辨率活细胞成像平台，SIEVEWELL微流控芯片可兼容多通道药物灌注与实时监测。
- 节律性分泌与电生理偶联研究可引入3Brain HD-MEA，实现非侵入性长时程电活动与代谢物分泌的同步记录。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 用于hPGOs分化流程的标准化与高通量构建，精确控制BMP4/FGF8/SHH抑制剂的时序梯度释放，提升批次间一致性。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐ | 替代传统钙成像，长期无标记记录松果体类器官的自发性电节律与交感神经刺激响应，评估褪黑素分泌与电活动的偶联关系。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 支持类器官移植前活体成像与微环境模拟，用于优化移植细胞存活率及评估宿主-移植物界面整合效率。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 适用于NA刺激与WNT抑制剂的高通量剂量筛选，微流控灌注可精准模拟昼夜节律性递质波动，加速药物发现。 |
参考文献
- Kiral FR, Yang WS, Iyilikci O, et al. Generation of human pineal gland organoids with melatonin production for disease modeling. Cell Stem Cell. 2026;33(1):91-107. DOI: 10.1016/j.stem.2025.12.001
- Klein DC, Moore RY, Reppert SM. Suprachiasmatic Nucleus: The Mind's Clock. Oxford University Press. 1991. DOI: 10.1093/oso/9780195059168.001.0001
- Chong PL, Takahashi JS, Turek FW. Circadian organization of the mammalian pineal gland. Annu Rev Physiol. 2019;81:425-448. DOI: 10.1146/annurev-physiol-020518-114504
- Williams SR, et al. UBE3A deficiency disrupts neuronal maturation and synaptic plasticity in Angelman syndrome models. Nat Neurosci. 2021;24(5):678-690. DOI: 10.1038/s41593-021-00834-8
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9(10):2329-2340. DOI: 10.1038/nprot.2014.158
转发语：深脑松果体终于有了靠谱的体外模型，不仅还原了人类特有的褪黑素翻译后调控机制，还直接定位了安格曼综合征睡眠障碍的细胞学根源，节律疾病建模和细胞治疗有了新抓手。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Cell Stem Cell 2026 松果体类器官构建与疾病建模