人松果体类器官的构建及其在褪黑素合成与疾病建模中的应用
Ferdi Ridvan Kiral, Woo Sub Yang, Onur Iyilikci, Xiaona Lu, Jonghun Kim, Mu Seog Choe, Cynthia Lo, Mei Zhong, Kun-Yong Kim, Yong-Hui Jiang, In-Hyun Park | Cell Stem Cell 2026 | DOI: 10.1016/j.stem.2025.11.012
标签: #类器官 #松果体发育 #褪黑素合成 #安格曼综合征 #昼夜节律 #干细胞定向分化
一、做什么 🔬
研究背景：松果体通过分泌褪黑素调控哺乳动物睡眠-觉醒周期。该结构位于脑深部，发育期组织样本极度稀缺，导致松果体细胞分化轨迹、神经内分泌调控网络及节律障碍的发育机制长期缺乏体外研究模型。传统动物模型存在显著的物种差异，无法准确反映人类松果体的转录调控与翻译后修饰特征。
核心问题：
- 能否利用人多能干细胞体外构建具备完整褪黑素分泌功能的松果体类器官？
- 松果体类器官能否重现体内交感神经去甲肾上腺素调控褪黑素合成的生理机制？
- UBE3A基因缺失如何干扰松果体细胞成熟并导致褪黑素合成障碍？
研究模型：人多能干细胞（hPSCs）衍生的松果体类器官（hPGOs），结合小鼠松果体切除移植模型及安格曼综合征（AS）患者iPSC疾病模型。
技术路线：
- 定向分化协议优化：BMP4激活联合100 nM环杷明（SHH抑制）与16-22天FGF8时间窗暴露，定向诱导背侧间脑松果体命运
- 多组学保真度验证：单细胞转录组聚类结合VoxHunt空间映射，比对小鼠胚胎脑图谱与成年人类松果体转录组
- 神经内分泌功能评估：GCaMP6s钙成像监测去甲肾上腺素响应，ELISA与LC-MS定量褪黑素分泌
- 体内整合验证：GFP标记hPGOs移植至新生小鼠松果体切除模型，评估系统性激素恢复能力
- 疾病机制解析：AS患者iPSC构建类器官，结合WNT/BMP通路干预与光遗传交感神经联合培养，解析发育阻滞节点
二、发现什么 📊
核心发现1：优化分化协议实现松果体细胞高效定向诱导
图1：100 nM环杷明联合16-22天FGF8处理使CRX/LHX4/TPH1显著上调，18周时>70%细胞共表达TPH1与ASMT（p<0.001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 测试三种浓度环杷明（1 μM/500 nM/100 nM）抑制SHH信号，并对比FGF8暴露时间窗（8-22天/12-22天/16-22天），通过qPCR与免疫荧光定量松果体标志物表达 |
| 发现什么 | 1 μM与500 nM环杷明导致类器官生长缺陷与结构异常；100 nM环杷明维持正常形态并使CRX/LHX4/TPH1上调3.1倍（p<0.001）；FGF8限制在16-22天可消除中脑标志物表达；18周时72.4%细胞共表达TPH1与ASMT（p<0.001） |
| 说明什么 | 明确了SHH轻度抑制与FGF8精确时间窗是避免非特异性神经分化、锁定松果体谱系的关键参数，建立了可重复的体外分化标准流程 |
核心发现2：转录组特征与组织形态高度匹配体内松果体
图2：18周成熟松果体细胞占比升至68%，与成年人类松果体转录组Pearson相关系数达0.89，2D培养分支长度较丘脑类器官降低62%（p<0.001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对6周与18周hPGOs进行scRNA-seq聚类，使用VoxHunt进行跨物种空间转录组映射比对，并将18周类器官解离进行2D培养，量化细胞突起分支数与总长度 |
| 发现什么 | 18周时成熟松果体细胞（Mat_Pin）占比达68%，较6周提升41%；VoxHunt映射显示与成年人类松果体转录组Pearson相关系数为0.89；2D培养中hPGOs细胞呈内分泌腺样岛状聚集，单细胞分支长度较丘脑类器官降低62%（p<0.001） |
| 说明什么 | hPGOs在细胞组成比例、空间转录特征及组织形态上高度保真，排除了非特异性神经分化，证实类器官成功模拟了松果体发育成熟轨迹 |
核心发现3：类器官具备完整褪黑素分泌能力并可恢复体内激素水平
图3：18周hPGOs褪黑素分泌量较6周提升4.5倍（p<0.001），移植2个月后切除小鼠血清褪黑素恢复至对照组的78%（p<0.01）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | ELISA定量6/12/18周培养上清褪黑素浓度；将GFP标记的10周龄hPGOs移植至P4期松果体切除小鼠，2个月后通过LC-MS检测血清褪黑素水平 |
| 发现什么 | 18周hPGOs褪黑素分泌量达42.6 pg/mL，较6周提升4.5倍（p<0.001）；移植组小鼠血清褪黑素浓度恢复至18.3 pg/mL，达到未切除对照组的78%（p<0.01），切除组仅为2.1 pg/mL |
| 说明什么 | hPGOs不仅具备体外内分泌功能，还能在活体脑微环境中存活、整合并系统性恢复循环激素水平，验证了细胞治疗干预松果体功能缺失的可行性 |
核心发现4：松果体细胞发育后期获得功能性交感神经受体响应
图4：12周后Adra1b表达上调3.2倍（p<0.001），18周时>85%细胞在NA刺激下产生钙瞬变，响应可被α受体拮抗剂哌唑嗪完全阻断。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | qPCR与免疫荧光检测α/β-肾上腺素能受体表达动态；利用GCaMP6s钙成像记录不同周龄类器官对去甲肾上腺素（NA）刺激的响应；应用肾上腺素能激动剂（PE/DH）与拮抗剂（哌唑嗪）进行通路筛选 |
| 发现什么 | 12周时Adra1b表达量较6周上调3.2倍（p<0.001）；18周时87.3%细胞在NA刺激下产生显著钙瞬变；该响应可被α受体拮抗剂哌唑嗪完全抑制，而β受体激动剂多沙胺不引发钙内流 |
| 说明什么 | hPGOs松果体细胞在发育后期特异性获得α-肾上腺素能受体功能，钙信号通路成熟时间与体内交感神经支配窗口一致，重现了神经-内分泌调控的生理基础 |
核心发现5：人类松果体褪黑素合成依赖翻译后修饰而非转录调控
图5：NA处理6小时使p-AANAT蛋白信号增强2.4倍（p<0.001）且与14-3-3结合显著富集，光遗传激活联合类器官使褪黑素产量提升2.1倍（p<0.05）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | NA处理18周hPGOs 6小时，通过GPCR分析检测褪黑素合成酶mRNA变化；Western blot与Co-IP检测p-AANAT水平及与14-3-3蛋白结合；构建光遗传交感神经类器官（SymNO）与hPGOs融合模型，红光激活后检测褪黑素分泌 |
| 发现什么 | NA处理未改变AANAT/ASMT mRNA水平；p-AANAT蛋白信号强度提升2.4倍（p<0.001），Co-IP证实与14-3-3结合显著富集；光遗传激活SymNO-hPGOs联合类器官使褪黑素产量提升2.1倍（p<0.05） |
| 说明什么 | 人类松果体褪黑素合成主要依赖AANAT磷酸化及14-3-3蛋白稳定作用的翻译后调控机制，与啮齿类依赖转录调控的机制存在本质差异，确立了人类特异性调控模型 |
核心发现6：UBE3A缺失引发WNT信号异常与松果体成熟阻滞
图6：AS类器官中脉络丛样区域占比达22.5%（p<0.001），褪黑素分泌量降至对照的12%（p<0.001），WNT抑制使脉络丛区域缩小40%但TPH1表达未恢复。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用AS患者iPSC（母源15q11.2-q13.1缺失）构建hPGOs，定量TTR阳性脉络丛样区域占比；ELISA与免疫荧光检测褪黑素与TPH1；钙成像评估NA响应；在分化第22-32天施加梯度WNT/BMP抑制剂 |
| 发现什么 | AS类器官脉络丛样区域占比达22.5%（对照<5%，p<0.001）；褪黑素分泌量降至对照的12%（p<0.001）；NA诱导的钙响应细胞比例不足15%；WNT抑制使脉络丛区域缩小40%，但TPH1表达与褪黑素合成未恢复 |
| 说明什么 | UBE3A缺失导致WNT通路过度激活与上皮命运偏移，引发松果体细胞成熟阻滞；早期细胞命运纠正无法逆转晚期功能缺陷，揭示了AS睡眠障碍的发育性病理根源 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究突破了松果体深部定位导致的组织获取瓶颈，首次建立具备完整内分泌功能的人类松果体类器官模型。研究推翻了啮齿类动物中“褪黑素合成主要受转录调控”的传统认知，证实人类松果体高度依赖p-AANAT/14-3-3翻译后修饰机制。UBE3A缺失导致WNT信号异常与成熟阻滞的发现，将安格曼综合征的睡眠障碍从“神经递质失衡”层面推进至“发育命运偏移”层面，为神经发育性疾病的节律紊乱提供了机制共识。
临床/转化价值：
- 为安格曼综合征及其他伴发严重睡眠障碍的神经发育疾病提供高通量药物筛选平台，靶向WNT通路或AANAT磷酸化修饰酶
- 验证了松果体细胞移植恢复系统性褪黑素水平的可行性，为退行性节律疾病或松果体钙化导致的内分泌衰竭提供细胞治疗概念验证
- 光遗传联合类器官模型为解析自主神经-内分泌轴交互提供了标准化体外测试系统
与我们产品的关联：
- 类器官长期分化与功能验证高度依赖稳定的3D培养与实时监测设备。Cellink BIO X系列可直接用于优化分化微环境与构建交感-松果体联合类器官。
- 钙成像与电生理替代方案需要高灵敏度记录平台。3Brain HD-MEA可替代部分钙成像实验，实现无标记、长时程网络电活动监测。
- 18周超长分化周期对培养基稳定性要求极高。Celvivo微流控灌注系统可维持代谢稳态，减少换液带来的机械损伤。
- 疾病模型建立后需进行化合物干预。SIEVEWELL高通量筛选板适用于解离后松果体细胞的剂量-效应评估。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具。用于BMP4/FGF8/SHH抑制因子的精确空间递送，优化分化协议；构建SymNO-hPGOs光遗传联合类器官时提供高精度生物打印支架 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐ | 配套使用。替代GCaMP6s钙成像，实现18周成熟类器官的无标记、长时程电生理与网络同步性监测，适用于交感神经刺激响应的高通量记录 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 配套使用。针对18周超长分化周期，提供动态微流控灌注与实时成像，维持代谢物梯度稳定，减少手动换液对松果体细胞成熟轨迹的干扰 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 潜在应用。将18周hPGOs解离为单细胞后，用于WNT抑制剂或AANAT调节剂的96/384孔高通量剂量筛选，加速疾病模型药物验证 |
参考文献
- Kiral FR, Yang WS, Iyilikci O, et al. Generation of human pineal gland organoids with melatonin production for disease modeling. Cell Stem Cell. 2026;33:91-107. DOI: 10.1016/j.stem.2025.11.012
- Klein DC, Coon SL, Roseboom PH, et al. The melatonin rhythm-generating enzyme: molecular regulation of serotonin N-acetyltransferase in the pineal gland. J Neurochem. 2004;91(1):1-15. DOI: 10.1111/j.1471-4159.2004.02748.x
- Jiang YH, Sahoo T, Michaelis RC, et al. Angelman syndrome: clinical features and molecular basis. Nat Rev Neurol. 2021;17(8):471-485. DOI: 10.1038/s41582-021-00512-2
- Qian X, Nguyen HN, Song MM, et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 2016;165(5):1238-1254. DOI: 10.1016/j.cell.2016.04.032
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9(10):2329-2340. DOI: 10.1038/nprot.2014.158
转发语：耶鲁团队首次用干细胞造出能分泌褪黑素的人松果体类器官，不仅重现了交感神经调控机制，还揭示了安格曼综合征睡眠障碍的发育根源，为节律疾病建模和细胞治疗提供了全新平台。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Cell Stem Cell 2026 Generation of human pineal gland organoids