人多能干细胞来源神经肌肉类器官精准模拟癌症恶病质肌萎缩
Pietro Chiolerio, Beatrice Auletta, Camilla Pezzini, Luigi Sartore, Giorgia Gregolon, Onelia Gagliano, Cecilia Laterza, Valeria Roxana Balmaceda Valdez, Davide Cacchiarelli, Camilla Luni, Carlo Viscomi, Melanie Planque, Sarah-Maria Fendt, Marco Sandri, Roberta Sartori, Anna Urciuolo | Cell Reports Methods 2024 | DOI: 10.1016/j.crmeth.2024.100892
标签: #类器官 #癌症恶病质 #神经肌肉接头 #多电极阵列 #线粒体代谢
一、做什么 🔬
研究背景：癌症恶病质导致不可逆的骨骼肌消耗，传统小鼠移植瘤模型受限于种属差异与全身性炎症干扰，难以剥离肿瘤直接分泌因子对神经-肌肉单元的独立作用。构建高度仿生的人源体外模型成为解析恶病质驱动机制与筛选靶向药物的核心瓶颈。
核心问题：
- 能否利用人多能干细胞构建具备自发电活动与功能性神经肌肉接头的三维类器官？
- 肿瘤来源因子能否在体外直接驱动类器官发生恶病质样肌萎缩？
- 恶病质微环境如何重塑神经肌肉接头的电生理响应与钙信号传导？
- 线粒体网络崩解与代谢重编程在肿瘤诱导的肌肉退化中扮演何种角色？
研究模型：人诱导多能干细胞（hiPSC）定向分化构建的神经肌肉类器官（NMOs），培养至第50-53天成熟期。
技术路线：
- hiPSC三维分化：通过时序性添加形态发生素，诱导生成包含运动神经元与骨骼肌束的自组织NMOs。
- 3Brain MEA电生理记录：高通量多电极阵列实时采集类器官自发放电波形与乙酰胆碱刺激响应。
- 活细胞动态成像与PIV分析：GFP标记肌管，结合粒子图像测速算法量化收缩位移幅度与方向性。
- 高分辨率呼吸测定与靶向代谢组学：Oroboros系统测定氧耗速率，结合代谢物谱分析评估线粒体功能。
- 超微结构与共聚焦定量：透射电镜解析肌节组装，免疫荧光定量突触标志物、线粒体形态及自噬共定位。
二、发现什么 📊
核心发现1：NMOs在第50天完成神经肌肉接头成熟与功能整合
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对D30与D50 NMOs进行全 mounts 共聚焦成像（TUJ-1/Desmin/MyHC染色），定量肌肉阳性区域面积；使用3Brain MEA系统记录基础自发放电，并在ACh刺激下通过PIV算法分析GFP+肌管位移向量分布。 |
| 发现什么 | D50肌肉阳性面积较D30扩大（p=0.0168）；ACh刺激下，D50类器官>15μm大位移事件频率显著高于D30（p=0.0234），MEA记录到稳定的多电极同步尖峰波形与平均电压振幅。 |
| 说明什么 | 证明hiPSC来源的NMOs在培养50天后完成神经支配与肌管成熟，具备可重复检测的电-机械耦合功能，为后续病理干预提供稳定的功能基线。 |
核心发现2：肿瘤条件培养基直接诱导类器官肌管横截面积萎缩与细胞死亡
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将D50 NMOs分别暴露于C26与MC38小鼠肿瘤骨髓提取物（BM）及条件培养基（CM）中72小时，设置未处理（UNT）对照；通过活细胞明场成像与GFP荧光追踪肌管横截面，同步进行Calcein/PI双染定量死细胞区域。 |
| 发现什么 | C26-CM处理使GFP+肌管横截面积较UNT下降（p<0.0001），MC38-BM/CM同样引发显著萎缩；PI阳性死细胞面积在C26处理后上升（p=0.0023）；整体肌肉阳性区域面积在72h后缩小（p=0.0116）。 |
| 说明什么 | 证实肿瘤分泌的可溶性因子无需免疫细胞参与即可直接触发人源肌管萎缩与细胞死亡，排除了系统性炎症作为唯一驱动因素的假说，确立了体外直接毒性模型。 |
核心发现3：恶病质微环境削弱ACh诱导的收缩力与钙瞬变幅度
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对C26-BM/CM处理72h的D53 NMOs施加ACh刺激，利用PIVlab生成极坐标图量化最大位移与方向性；加载Fluo-4钙指示剂进行活细胞成像，记录单类器官内30个钙峰的ΔF/F0振幅。 |
| 发现什么 | 处理后ACh诱导的1-5μm弱位移事件频率显著升高（p=0.0014），收缩方向性散乱；Fluo-4记录的钙瞬变峰值幅度较UNT组显著衰减（p=0.0188）。 |
| 说明什么 | 揭示恶病质不仅导致肌管体积缩小，更直接破坏神经肌肉接头的兴奋-收缩耦联效率，钙信号传导受损是收缩力下降的上游机制。 |
核心发现4：肿瘤因子触发线粒体网络碎片化与mtDNA拷贝数骤降
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 提取处理后的NMOs组织进行qPCR定量mtDNA拷贝数；共聚焦成像定量MyHC区域内TOM20荧光强度；计算TOM20与溶酶体标志物LAMP1的Pearson共定位系数（PCC）；使用Oroboros高分辨率呼吸仪测定完整类器官切片的氧耗速率（OCR）轨迹。 |
| 发现什么 | mtDNA含量较UNT组骤降（p<0.0001）；TOM20荧光强度显著减弱（p<0.0001）；TOM20与LAMP1的PCC值显著升高（p<0.0001）；Oroboros轨迹显示基础呼吸与最大呼吸能力同步受损。 |
| 说明什么 | 肿瘤因子通过过度激活线粒体自噬（mitophagy）与破坏mtDNA稳态，切断肌肉能量供应链，将代谢崩溃确立为恶病质肌萎缩的核心执行通路。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究确立了人源NMOs作为癌症恶病质体外研究的标准平台。过去依赖小鼠移植瘤模型，无法区分肿瘤直接分泌因子与宿主系统性炎症的独立作用。本研究证明肿瘤条件培养基足以在缺乏免疫细胞的情况下直接驱动神经肌肉接头功能障碍与肌萎缩，将“肿瘤-肌肉直接对话”推为共识，同时引发关于神经支配在恶病质中保护或恶化作用的机制争议。
临床/转化价值：
- 为抗恶病质药物提供高通量、人源化的体外筛选平台，缩短临床前验证周期，降低动物模型转化失败率。
- 揭示线粒体自噬与代谢重编程为潜在干预靶点，指导开发靶向能量代谢的联合疗法。
- 建立电生理-收缩力-代谢多维评估体系，为临床肌电图与影像学标志物提供机制锚点，辅助早期恶病质诊断。
与我们产品的关联：
- 3Brain MEA系统直接用于捕捉神经肌肉接头电生理衰退，替代传统微电极阵列，提升通量与数据稳定性。
- 3D生物打印平台可标准化NMOs构建流程，解决传统悬浮培养批次差异大的问题。
- 活细胞成像工作站支持72小时长时程无标记追踪，精准量化肿瘤因子处理下的形态动态。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具：用于hiPSC三维分化与NMOs标准化构建，替代传统悬浮培养，提升批次一致性与神经-肌肉空间排布精度 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具：论文实际使用该系统记录D50 NMOs自发放电与ACh响应，直接验证神经肌肉接头功能与电生理衰退 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 配套使用：提供无标记长时程活细胞成像环境，适用于追踪72h肿瘤因子处理下的肌管形态动态与收缩频率变化 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 潜在应用：其微流控灌流设计可模拟肿瘤因子梯度递送，用于研究恶病质微环境的空间异质性效应与药物渗透动力学 |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Chiolerio P, Auletta B, Pezzini C, Sartore L, Gregolon G, Gagliano O, Laterza C, Balmaceda Valdez VR, Cacchiarelli D, Luni C, Viscomi C, Planque M, Fendt SM, Sandri M, Sartori R, Urciuolo A. Human neuromuscular organoids mimic cancer-induced muscle cachexia. Cell Rep Methods. 2024. DOI: 10.1016/j.crmeth.2024.100892
- Sartori R, Romanello V, Sandri M. Mechanisms of muscle wasting in cancer cachexia. Nat Rev Cancer. 2021. DOI: 10.1038/s41568-021-00378-5
- Urciuolo A, Quarta M, Morbidoni V, Gattazzo F, Molon S, Grumati P, Montemurro C, Bonaldo P, Blaauw B. Collagen VI regulates satellite cell self-renewal and muscle regeneration. Nat Commun. 2013. DOI: 10.1038/ncomms2964
- Argilés JM, Busquets S, Stemmler B, López-Soriano FJ. Cancer cachexia: understanding the molecular basis. Nat Rev Cancer. 2014. DOI: 10.1038/nrc3829
转发语：肿瘤怎么“吃掉”肌肉？这篇Cell子刊用hiPSC神经肌肉类器官给出了人源答案，3Brain MEA直接抓到电生理衰退实锤，抗恶病质药物筛选有了新标尺。
联系人：李东伟
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