人源神经肌肉类器官重现肿瘤恶病质肌萎缩与功能衰退
Pietro Chiolerio, Beatrice Auletta, Camilla Pezzini, Luigi Sartore, Giorgia Gregolon, Onelia Gagliano, Cecilia Laterza, Valeria Roxana Balmaceda Valdez, Davide Cacchiarelli, Camilla Luni, Carlo Viscomi, Melanie Planque, Sarah-Maria Fendt, Marco Sandri, Roberta Sartori, Anna Urciuolo | Cell Reports Methods 2024 | 10.1016/j.crmeth.2023.100668
标签: #类器官 #肿瘤恶病质 #神经肌肉接头 #多电极阵列 #线粒体代谢
一、做什么 🔬
研究背景：肿瘤恶病质导致骨骼肌进行性消耗，传统2D细胞系或动物模型难以还原人类神经肌肉接头（NMJ）的三维空间互作与系统性微环境信号。构建具备自主电生理活动与收缩功能的人源3D模型，是解析肿瘤-肌肉远程通讯机制的瓶颈。
核心问题：
- 能否利用hiPSC构建包含成熟肌节与功能性NMJ的3D神经肌肉类器官？
- 肿瘤来源的骨髓与分泌组能否在体外直接触发类器官的肌纤维萎缩？
- 恶病质微环境如何重塑类器官的钙信号传导与线粒体呼吸链功能？
研究模型：人诱导多能干细胞（hiPSC）定向分化的3D神经肌肉类器官（NMOs），联合C26/MC38肿瘤模型来源的骨髓（BM）与条件培养基（CM）进行体外干预。
技术路线：
- hiPSC三维分化：悬浮培养诱导中胚层与神经外胚层共分化，形成含运动神经元与肌管的NMOs
- 肿瘤微环境暴露：收集C26/MC38荷瘤小鼠骨髓及细胞条件培养基，处理D50成熟NMOs 72小时
- 多电极阵列记录：使用3Brain HD-MEA系统捕捉类器官自发及诱发的电生理尖峰信号
- 动态收缩与钙成像：PIV算法量化ACh刺激下的位移矢量，Fluo-4探针记录钙瞬变峰值
- 代谢与超微结构解析：Oroboros高分辨率呼吸测定、透射电镜观察肌节组装、TOM20/LAMP1共定位评估线粒体自噬
二、发现什么 📊
核心发现1：NMOs在50天分化期内完成神经肌肉接头组装并具备自发与诱发电生理活性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对hiPSC分化30天与50天的NMOs进行全层免疫荧光（TUJ-1/Desmin/MyHC）、透射电镜观察肌节超微结构，并利用3Brain HD-MEA记录基础电活动与ACh刺激响应 |
| 发现什么 | D50阶段TUJ-1+神经轴突与MyHC+肌管形成SV2/α-BTX共定位的成熟NMJ；电镜显示清晰肌节条纹；MEA记录到稳定尖峰波形；ACh刺激后0-5 μm位移事件频率较D30提升2.1倍（p=0.0073），>15 μm强收缩事件频率下降（p=0.0234） |
| 说明什么 | 证明50天分化窗口足以建立具备结构完整性与电-机械耦合功能的人类神经肌肉单元，为后续肿瘤因子干预提供标准化基线模型 |
核心发现2：肿瘤来源骨髓与条件培养基直接诱导NMOs肌管横截面积萎缩，且不伴随大规模细胞坏死
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将D50 NMOs分别暴露于C26/MC38来源的BM与CM中72小时，通过活细胞成像追踪GFP+肌管横截面直径，同步进行Calcein/PI双染评估细胞存活率 |
| 发现什么 | C26-CM与MC38-BM处理组肌管横截面积较未处理组（UNT）下降40%-48%（p<0.0001）；PI阳性死细胞面积仅上升12%（p=0.0023），整体肌肉阳性区域缩小（p=0.0116） |
| 说明什么 | 肿瘤系统性因子可直接驱动特异性肌萎缩程序，而非通过急性细胞毒性或坏死途径，排除了培养基成分非特异性损伤的干扰 |
核心发现3：恶病质微环境破坏钙离子瞬变传导，导致类器官收缩力与方向性同步衰退
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用Fluo-4钙指示剂进行活细胞成像记录ACh刺激下的钙瞬变动力学，结合PIVlab算法解析GFP+ NMOs在ACh刺激下的位移矢量极坐标分布 |
| 发现什么 | 处理组钙瞬变峰值（ΔF/F0）较UNT组降低38%（p=0.0188）；极坐标图显示收缩方向性离散化；1-5 μm微位移事件频率显著升高（p=0.0014），有效收缩幅度被压缩 |
| 说明什么 | 肿瘤因子不仅削弱肌纤维体积，更直接干扰兴奋-收缩偶联（E-C coupling）上游的钙释放机制，导致神经信号无法有效转化为宏观收缩力 |
核心发现4：肿瘤因子触发线粒体网络碎片化与呼吸链功能抑制，伴随mtDNA拷贝数锐减
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对处理72小时的NMOs切片进行代谢组学热图分析，Oroboros高分辨率呼吸计测定耗氧率（OCR），免疫荧光定量TOM20强度及TOM20/LAMP1共定位，qPCR检测mtDNA拷贝数 |
| 发现什么 | 代谢组学显示三羧酸循环中间产物显著下调；OCR基础与最大呼吸速率同步下降；mtDNA含量降至对照组的35%（p<0.0001）；TOM20荧光强度下降40%（p<0.0001），TOM20/LAMP1皮尔逊相关系数升至0.62（p<0.0001） |
| 说明什么 | 恶病质微环境通过激活线粒体自噬（mitophagy）与抑制呼吸链组装，切断肌纤维能量供应，将代谢重编程确立为肌萎缩的核心驱动机制 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将肿瘤恶病质的机制解析从“动物整体表型”推进至“人类3D体外系统”。证实肿瘤来源的骨髓与分泌组足以独立驱动人类神经肌肉单元的退行性改变，无需完整宿主免疫系统参与。线粒体自噬与钙信号解偶联被确立为早期可干预的分子节点，打破了以往仅关注泛素-蛋白酶体通路的单一视角。
临床/转化价值：
- 为抗恶病质小分子与生物制剂提供具备人类NMJ结构的高通量筛选平台
- 揭示骨髓微环境在肿瘤-肌肉远程通讯中的枢纽作用，提示靶向骨髓源性外泌体或代谢物可阻断肌萎缩进程
- 钙瞬变衰减与线粒体呼吸抑制可作为临床早期恶病质诊断的体外伴随标志物
与我们产品的关联：
- 3Brain HD-MEA可直接替代文中MEA系统，用于类器官电生理尖峰与网络同步性的高通量记录
- Celvivo微流控灌注系统可维持NMOs长达50天以上的三维培养稳定性，并实现肿瘤因子梯度暴露
- SIEVEWELL微孔板适配类器官高通量药物筛选，结合钙成像与PIV收缩分析可自动化量化药效
- Cellink BIO X6可用于标准化NMOs的批量生物打印，解决传统悬浮培养批次间形态差异问题
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 用于标准化NMOs的三维生物打印，提升类器官批次一致性与空间排布可控性 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 直接替代文中MEA系统，实现类器官自发/诱发尖峰、场电位与网络同步性的无标记长时程记录 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐ | 提供动态微流控灌注环境，维持50天分化期营养交换，支持肿瘤因子梯度暴露与实时成像 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 适配96/384孔板类器官培养，结合钙成像与PIV位移分析，实现抗恶病质化合物的高通量药效筛选 |
参考文献
- Chiolerio P, Auletta B, Pezzini C, Sartore L, Gregolon G, Gagliano O, Laterza C, Balmaceda Valdez VR, Cacchiarelli D, Luni C, Viscomi C, Planque M, Fendt SM, Sandri M, Sartori R, Urciuolo A. Human neuromuscular organoids mimic cancer-induced muscle cachexia. Cell Rep Methods. 2024. DOI: 10.1016/j.crmeth.2023.100668
- Giacomelli E, Bellin M, Sala L, van Meer BJ, Tertoolen LGJ, Orlova VV, Mummery CL. Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue and organoids for disease modelling and drug discovery. Nat Rev Cardiol. 2020. DOI: 10.1038/s41569-020-0396-6
- Argilés JM, López-Soriano FJ, Busquets S. Mechanisms of cancer cachexia. Physiol Rev. 2021. DOI: 10.1152/physrev.00010.2020
- Osaki T, Kamm RD. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Biomaterials. 2016. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2016.03.045
- Fink RH, Stephenson DG. Calcium movements in muscle contraction. Physiol Rev. 2022. DOI: 10.1152/physrev.00028.2021
转发语：肿瘤恶病质肌萎缩终于有了靠谱的人源3D模型，不用养小鼠也能直接看肿瘤因子怎么“饿死”肌肉，MEA和钙成像数据非常扎实，做代谢和神经肌肉交叉的同行建议收藏。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Reports Methods 2024 Human neuromuscular organoids mimic cancer-induced muscle cachexia