基于CMOS高密度微电极阵列的急性脑片高质量类癫痫活动记录方案
Melissa L. Blotter, Isaac W. Stubbs, Jacob H. Norby, Maxwell Holmes, Ben Kearsley, Alexis Given, Kutter Hine, Micah R. Shepherd, R. Ryley Parrish | Journal of Visualized Experiments 2024 | DOI: 10.3791/67065
标签: #高密度微电极阵列 #癫痫模型 #脑片电生理 #CMOS芯片 #局部场电位 #3Brain
一、做什么 🔬
研究背景：CMOS高密度微电极阵列（CMOS-HD-MEA）凭借数千个记录点与高信噪比，能够以前所未有的时空分辨率捕捉细胞培养与离体脑片的神经电活动。该技术在急性脑片局部场电位（LFP）记录中展现出追踪病理网络传播模式的潜力。浸没式记录舱内脑片易出现界面气泡噪声、组织缺氧以及2D芯片仅能记录表层信号等瓶颈，导致类癫痫放电诱发成功率低、信号质量不稳定。
核心问题：
- 能否通过标准化芯片亲水处理与接地流程消除界面电噪声？
- 浸没式灌流系统的入流出流速率与针位布局如何影响脑片贴附与长期活性？
- 0 Mg²⁺与100 μM 4-AP两种致痫范式在CMOS-HD-MEA上诱发的网络放电频带特征有何定量差异？
- 2D非穿透式电极阵列记录>150 Hz高频活动的物理局限如何影响数据解读？
研究模型：成年C57BL/6小鼠（≥P21）急性海马与新皮层脑片（厚度350 μm）。
技术路线：
- 芯片预处理：190-proof乙醇润洗30-60 s后aCSF交替冲洗3次，静置45 min消除疏水性气泡
- 脑片固定：亚切割适配电极阵列，使用铂金琴弦（harp）压片并防静电擦拭吸除多余液体
- 动态灌流：入流针置于电极阵列底部外侧（5 mL/min），出流针置于液面顶部边缘（7 mL/min），维持34-37 ℃恒温
- 双范式诱导：切换至0 Mg²⁺ aCSF或含100 μM 4-AP的aCSF，持续记录约40 min
- 数据降采样与可视化：空间跳行/跳列（每2行2列跳过）与300 Hz时间降采样，导入Xenon LFP平台生成栅格图与频谱分析
二、发现什么 📊
核心发现1：标准化实验流程可系统化整合脑片制备、芯片处理与数据采集
图1：完整实验流程涵盖脑片切割、芯片清洗、组织放置与通道筛选4个核心模块，确保记录可重复性。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 绘制标准化操作流程图，明确脑片亚切割尺寸、CMOS-HD-MEA芯片清洗步骤、组织放置位置及数据通道筛选逻辑 |
| 发现什么 | 流程将实验拆解为4个独立可控阶段，各阶段操作节点与对应设备（振动切片机、防静电擦拭布、灌流系统）严格对应 |
| 说明什么 | 建立模块化SOP可消除传统MEA实验中因步骤交叉导致的污染与信号漂移，为后续定量比较提供基线操作框架 |
核心发现2：优化的灌流针布局与琴弦固定方向是维持脑片贴附与信号稳定的关键
图2：入流针置于电极阵列底部外侧、出流针置于顶部边缘，配合无框侧朝向入流的琴弦放置，可防止组织移位。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 设计3Brain Accura芯片解剖结构图，标注海马与新皮层靶区位置，规定琴弦无框侧朝向入流针，入/出流针分别置于芯片井底部外侧与顶部边缘 |
| 发现什么 | 该布局使液体在芯片井内形成自下而上的稳定层流，琴弦框架避开记录电极阵列，避免物理压迫与流体剪切力干扰 |
| 说明什么 | 针位与琴弦方向的几何优化直接阻断气泡在组织-电极界面聚集，解决浸没式舱内因流体扰动导致的信号丢失问题 |
核心发现3：乙醇/aCSF交替清洗与防静电擦拭能彻底消除芯片疏水性气泡与界面噪声
图3：乙醇单次润洗后aCSF冲洗3次，配合防静电擦拭布吸除边缘残液，使电极噪声降至基线水平。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 执行芯片预处理：190-proof乙醇覆盖井底30-60 s，aCSF冲洗3次，静置≥45 min；放置脑片后用防静电擦拭布尖角吸除电极周围多余aCSF |
| 发现什么 | 乙醇处理使芯片表面由疏水转为亲水，aCSF静置后界面气泡消失；擦拭操作使组织与电极贴合度提升，假彩色噪声图显示非生物振荡信号完全消除 |
| 说明什么 | 表面张力调控与物理吸液是获取高信噪比LFP的前置条件，直接决定后续致痫放电能否被清晰捕获 |
核心发现4：0 Mg²⁺与4-AP范式均可在约40分钟内稳定诱发跨脑区传播的类癫痫网络放电
图4：0 Mg²⁺与100 μM 4-AP处理约40 min后，栅格图显示新皮层与海马通道均出现高频簇状放电，优于未优化条件下的短暂爆发。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在CMOS-HD-MEA上分别灌注0 Mg²⁺ aCSF与含100 μM 4-AP的aCSF，连续记录约40 min，生成全通道栅格图并提取新皮层与海马代表性LFP轨迹 |
| 发现什么 | 两种范式均在40 min内诱发持续类癫痫活动；0 Mg²⁺组呈现规则传播模式，4-AP组放电频次更高但单次持续时间较短；未优化组仅出现<1 s的短暂爆发 |
| 说明什么 | 标准化流程显著提升致痫成功率，验证CMOS-HD-MEA具备同时捕捉双脑区网络同步放电的能力，为机制对比提供可靠数据源 |
核心发现5：两种范式诱发的放电在时频特征上呈现显著差异，新皮层与海马响应模式不同
图5：频谱图与80 Hz高通滤波轨迹显示，0 Mg²⁺在新皮层诱发强直性放电，4-AP在海马诱发高频瞬态爆发。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 提取典型放电事件的原始轨迹，应用80 Hz高通滤波分离高频成分，生成对应频谱图并放大关键时窗进行形态学比对 |
| 发现什么 | 0 Mg²⁺新皮层放电呈现低频主导的持续强直模式；4-AP海马放电呈现短时高频簇状爆发；新皮层4-AP频谱显示发作初期高频能量密集，随后逐渐衰减 |
| 说明什么 | 不同致痫机制（NMDA受体去阻断 vs Kv3钾通道阻滞）驱动截然不同的网络振荡动力学，提示频带特征可作为区分病理机制的生物标志物 |
核心发现6：0 Mg²⁺范式在1-150 Hz频段产生更高的相对功率，而>150 Hz高频信号在2D芯片上普遍衰减
图6：2-way ANOVA显示0 Mg²⁺在新皮层delta、theta、低/高gamma频段功率显著高于4-AP（P<0.05至P<0.0001），>150 Hz频段功率均受限。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 计算各频段（1-150 Hz）相对基线功率百分比，采用2-way ANOVA与Tukey事后检验比较范式与脑区差异，单独分析>150 Hz高频段表现 |
| 发现什么 | 0 Mg²⁺新皮层在delta(1-4 Hz)、theta(4-8 Hz)、低gamma(30-60 Hz)、高gamma(60-150 Hz)功率均显著高于4-AP（*P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001）；海马0 Mg²⁺高gamma功率最高；>150 Hz频段两组功率均处于低位 |
| 说明什么 | 0 Mg²⁺更适合研究宽频带网络同步，4-AP侧重低频与高频瞬态事件；>150 Hz信号衰减证实2D非穿透芯片受限于神经元-电极距离，高频研究需依赖3D穿透式阵列 |
三、说明什么 💡
领域意义：该方案将CMOS-HD-MEA的应用边界从单层细胞培养拓展至复杂急性脑片网络，明确了浸没式记录舱内维持组织活性与消除界面噪声的标准化参数。学界此前对2D芯片记录脑片LFP的稳定性存疑，本研究通过定量对比0 Mg²⁺与4-AP的频带功率差异，确立了不同致痫范式在HD-MEA上的适用边界。>150 Hz高频信号的普遍衰减被明确归因于2D芯片的物理距离限制，推动领域向3D穿透式电极阵列迭代。
临床/转化价值：
- 为抗癫痫药物体外高通量筛选提供可重复的LFP记录平台，支持跨脑区药效动力学评估
- 频带功率特征差异可作为靶向离子通道（如Kv3或NMDA受体）药物开发的体外药效学终点
- 标准化SOP可直接平移至患者术后皮层组织或基因编辑癫痫动物模型，加速机制验证与生物标志物发现
与我们产品的关联：
- 3Brain HD-MEA系统是该方案的核心记录平台，芯片处理、接地与数据导出流程完全匹配
- 若需延长脑片活性或进行多模态联用，需配套恒温灌流与显微成像设备
- 高频（>150 Hz）单细胞放电捕捉需升级至3D穿透式MEA或结合膜片钳技术
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心记录工具，芯片清洗、琴弦固定、灌流布局与Xenon LFP数据分析流程完全对应，可直接复现本方案 |
参考文献
- Blotter, M.L., Stubbs, I.W., Norby, J.H., Holmes, M., Kearsley, B., Given, A., Hine, K., Shepherd, M.R., Parrish, R.R. High-Quality Seizure-Like Activity from Acute Brain Slices Using a Complementary Metal-Oxide-Semiconductor High-Density Microelectrode Array System. J. Vis. Exp. (211), e67065, doi:10.3791/67065 (2024).
- Mahadevan, A., Codadu, N. K., Parrish, R. R. Xenon LFP analysis platform is a novel graphical user interface for analysis of local field potential from large-scale MEA recordings. Front Neurosci. 16, 904931, doi:10.3389/fnins.2022.904931 (2022).
- Obien, M. E. J., Frey, U. Large-scale, high-resolution microelectrode arrays for interrogation of neurons and networks. Adv Neurobiol. 22, 83-123, doi:10.1007/978-3-030-28963-3_4 (2019).
- Ferrea, E. et al. Large-scale, high-resolution electrophysiological imaging of field potentials in brain slices with microelectronic multielectrode arrays. Front Neural Circuits. 6, 80, doi:10.3389/fncir.2012.00080 (2012).
- Thouta, S. et al. Pharmacological determination of the fractional block of Nav channels required to impair neuronal excitability and ex vivo seizures. Front Cell Neurosci. 16, 964691, doi:10.3389/fncel.2022.964691 (2022).
转发语：急性脑片在CMOS-HD-MEA上记录类癫痫放电总被噪声和缺氧打断？这篇JoVE方案把芯片清洗、灌流针位和双范式对比的SOP全量化了，直接照着做就能拿到干净的跨脑区LFP数据。
联系人：李东伟
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